Nghiên cứu bán tổng hợp carbocistein từ l cystein qui mô 10 kg trên mẻ

Carbocistein là thuốc điều hòa chất nhầy, có tác dụng điều chỉnh fucos và acid sialic trong chất nhầy đường hô hấp thông qua cơ chế ức chế yếu tố TNF-α tumor nucrosis factor alpha- TNF α

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN NGUYỄN THÀNH ĐẠT NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CARBOCISTEIN TỪ L-CYSTEIN QUI

MÔ 10 kg/mẻ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN NGUYỄN THÀNH ĐẠT

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CARBOCISTEIN TỪ L-CYSTEIN QUI

MÔ 10 kg/mẻ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc

MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đình Luyện

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo

mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, thầy TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn Giang, CN Phan Tiến Thành của Tổ môn Tổng hợp Hóa dược - Bộ môn Công nghiệp Dược đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận vừa qua

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo thuộc bộ môn Công nghiệp Dược, cũng như các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình trong suốt năm năm học

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố

mẹ, anh chị tôi và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 01 tháng 07 năm 2015

Sinh viên

Đoàn Nguyễn Thành Đạt

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về carbocistein 2

1.1.1 Cấu trúc, tính chất lý hóa 2

1.1.2 Tác dụng dược lý và ứng dụng trong điều trị 4

1.2 Tổng quan về các phương pháp tổng hợp CMC 7

1.2.1 Phương pháp tổng hợp carbocistein đi từ L-cystein 8

1.2.2 Phương pháp tổng hợp carbocistein đi từ L-cystin 9

1.2.3 Phương pháp tổng hợp carbocistein đi từ nguyên liệu khác 11

1.3 Phân tích và lựa chọn phương pháp 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Bán tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm 16

2.3.2 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết 17

2.3.3 Xác định cấu trúc sản phẩm 17

2.3.4 Kiểm nghiệm chất lượng carbocistein tổng hợp được 18

2.3.5 Theo dõi độ ổn định của sản phẩm 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 21

3.1 Bán tổng hợp carbocistein từ L-CHM qui mô 100 g/mẻ 21

3.1.1 Tổng hợp carbocistein qui mô 100 g/mẻ theo [5] 21

3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 21

3.2 Xây dựng qui trình bán tổng hợp carbocistein qui mô 500 g/mẻ 26

3.3 Xây dựng qui trình bán tổng hợp carbocistein qui mô 1 kg/mẻ 27

3.4 Xây dựng phương pháp tinh chế sản phẩm qui mô 1,5 kg/mẻ 28

3.5 Xây dựng qui trình bán tổng hợp và tinh chế Carbocistein qui mô 5 kg/mẻ 31

3.5.1 Phương pháp 1: tổng hợp theo qui trình tương tự qui mô 1 kg/mẻ 31

3.5.2 Phương pháp 2: cải tiến phương thức nạp liệu 33

3.6 Xây dựng qui trình bán tổng hợp và tinh chế Carbocistein qui mô 10 kg/mẻ 37

3.6.1 Tổng hợp carbocistein qui mô 10 kg/mẻ 37

3.6.2 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm 40

3.7 Khẳng định cấu trúc sản phẩm 40

3.8 Kiểm nghiệm sản phẩm theo tiêu chuẩn dược điển Anh 2013 43

3.9 Theo dõi độ ổn định của sản phẩm 44

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 47

4.1 Về phản ứng tổng hợp carbocistein 47

4.1.1 Phản ứng tổng hợp carbocistein qui mô 100 g/mẻ, 500 g/mẻ và 1 kg/mẻ 47

4.1.2 Phản ứng tổng hợp carbocistein qui mô 5 kg/mẻ và 10 kg/mẻ 48

4.2 Về phương pháp tinh chế 49

4.3 Về khẳng định cấu trúc 50

4.3.1 Về phổ hồng ngoại 50

4.3.2 Về phổ khối lượng 50

4.3.3 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 50

4.4 Về theo dõi độ ổn định 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MCA Acid monocloroacetic

MCA.Na Natri cloroacetat

1

H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton

nuclear magnetic resonance spectroscopy) 13

C-NMR Phổ cộng hưởng từ carbon 13 (Carbon-13

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

RH Độ ẩm tương đối (Relative Humidity)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ mol MCA: L- CHM tới

Bảng 3.14 Số liệu phân tích phổ khối lượng của carbocistein 41 Bảng 3.15 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của carbocistein tổng hợp được 42 Bảng 3.16 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của carbocistein tổng hợp được 42 Bảng 3.17 Kết quả kiểm nghiệm carbocistein theo BP 2013 43 Bảng 3.18 Kết quả theo dõi độ ổn định sản phẩm ở điều kiện thường 45 Bảng 3.19 Kết quả theo dõi độ ổn định sản phẩm ở điều kiện lão hóa cấp tốc 45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.5 Tổng hợp carbocistein từ L-cystin và L-CHM 7 Hình 1.6 Phản ứng tổng hợp carbocistein của Alfred A Maierhop và cộng

ứng

23

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH tới hiệu suất phản ứng 25 Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp carbocistein qui mô 5 kg/mẻ theo phương pháp 1 32 Hình 3.5 Phản ứng tỏa nhiệt giữa L-CHM, MCA với NaOH 33

Hình 3.7 Sơ đồ tổng hợp carbocistein qui mô 5 kg/mẻ theo phương pháp 2 36

Hình 3.8 Sơ đồ tổng hợp carbocistein qui mô 10 kg/mẻ 39 Hình 4.1 Phản ứng S-alkyl hóa theo cơ chế SN1 giữa L-CHM và MCA 47

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Carbocistein là một thuốc được sử dụng để điều trị các bệnh đường hô hấp Carbocistein có tác dụng làm lỏng dịch nhầy đường hô hấp, được dùng trong các trường hợp rối loạn hô hấp, đặc biệt liên quan đến sự tăng tiết hoặc tăng độ nhầy nhớt như viêm phế quản cấp hoặc mạn tính, giãn phế quản, viêm phế quản dạng hen hoặc khí phế thũng, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính Điều trị

hỗ trợ trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng, chảy dịch ống tai và giảm việc tăng tiết trước khi phẫu thuật [2], [17], [20]

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh được carbocistein có tác dụng tốt trong việc điều trị bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (chronic obstructive pulmonary disease- COPD) [17], [13], [34] và ức chế sự lây nhiễm virus cúm

A [32]

Các biệt dược chứa carbocistein có trên thị trường Việt Nam hiện nay

(Rhinathiol 2%, Rhinathiol 375 mg, Babythiol 2%, Bicanthiol 375 mg, Flemex…) đều nhập khẩu từ nước ngoài Mặt khác, chưa đơn vị nào sản xuất

được nguyên liệu này Trong khi đó ở trong nước đã có những thành công trong việc tổng hợp carbocistein qui mô phòng thì nghiệm, từ các nguồn nguyên liệu có sẵn [6], [5], đặc biệt là đề tài “Nghiên cứu bán tổng hợp carbocistein qui mô 1 kg/mẻ” của Dương Văn Khoa [5]

Để góp phần tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc và phát triển nền công

nghiệp hóa dược nước nhà, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:”Nghiên cứu bán tổng hợp carbocistein từ L-cystein qui mô 10 kg/mẻ” với mục tiêu

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về carbocistein

1.1.1 Cấu trúc, tính chất lý hóa

Carbocistein (CMC) là dẫn chất của L-cystein với nhóm carboxymethyl

gắn ở vị trí –SH, nó có công thức cấu tạo như hình 1:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của carbocistein

Tên khoa học: (R)-2-amino-3-(carboxymethylthio) propanoic acid

Công thức phân tử: C5H9NO4S

Khối lượng phân tử: 179,19 g/mol

Thành phần: 33,51% C; 5,06% H; 7,82% N; 35,71% O; 17,89% S

Một số danh pháp khác: S-Carboxymethyl-L-cystein, Acid

(R)-2-amino-4-thia-adipic, Acid L -2-Amino-(carboxymethylthio) propionic,

3-(Carboxymethylthio)- L–alanin, L-3-((Carboxymethyl)thio)alanin, L–

Carboxymethylcystein, (R) –Carbocistein

- Tính chất vật lý [18]

 Bột kết tinh hay tinh thể hình đĩa, không màu

 Tan trong nước sôi, không tan trong nước lạnh và không tan trong một

số dung môi hữu cơ thông thường (ethanol, methanol, aceton…)

 Độ quay cực riêng: [𝛼] 𝐷 20 = 0,5 (trong dung dịch HCl 1N)

 Nhiệt độ nóng chảy: 204 - 2070

C

- Tính chất hóa học [3], [12]

3

 CMC có cấu trúc của một α-amino acid, có chứa nhóm –COOH và –NH2 nên có các phản ứng đặc trưng của các nhóm amin và carboxyl như phản ứng acetyl hóa, phản ứng formyl hóa hay ester hóa

Phản ứng với ninhydrin:

Nguyên tắc: Nhóm amin và nhóm carboxyl của α-amino acid bị oxy hóa

bởi ninhydrin khi đun nóng tạo dạng khử, CO2, NH3 và aldehyd Sau đó ninhydrin và sản phẩm khử lại phản ứng tiếp với NH3 tự do tạo thành phức hợp màu tím, có độ hấp thụ cực đại ở λ= 570 nm, cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin

Hình 1.2 Phản ứng của carbocistein với ninhydrin

Phản ứng với Fluorescamin:

Nguyên tắc: Fluorescamin phản ứng với nhóm α-amino của acid amin tạo

dẫn xuất huỳnh quang Phản ứng rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới cỡ nano gram

Hình 1.3 Phản ứng của acid amin với Fluorescamin

Fluorescamin Acid amin Dẫn xuất huỳnh quang

4

Phản ứng Sanger:

Nguyên tắc: Acid amin phản ứng với clorid dabsyl, clorid dansyl và 1-

fluoro-2,4 dinitrobezen cho các dẫn chất bền vững trong điều kiện thủy phân protein (Phản ứng này dùng để xác định aa-N tận nhưng không có khả năng xác định liên tiếp vì peptid còn lại bị phá hủy do thủy phân)

Hình 1.4 Phản ứng Sanger của acid amin

 Trong phân tử CMC có chứa lưu huỳnh, nên có phản ứng Folh xác định

acid amin chứa lưu huỳnh

Nguyên tắc: CMC khi đun nóng trong môi trường kiềm tạo ra muối

sulfit, chất này sẽ phản ứng với muối chì tạo chì sulfid PbS màu đen xám

 Phân tử CMC có chứa 2 nhóm chức acid, nên có phản ứng đặc trưng của acid: phản ứng ester hóa, phản ứng acyl hóa

1.1.2 Tác dụng dược lý và ứng dụng trong điều trị

Carbocistein hấp thu nhanh sau khi uống, động học của thuốc tuân theo

mô hình một ngăn [11] Đỉnh nồng độ trong huyết tương đạt được sau 1-2 h Thời gian bán thải 1,33 h Carbocistein có khả năng thấm sâu vào mô phổi và dịch hô hấp, có tác dụng điều trị tại chỗ [22], [10]

Chuyển hóa của carbocistein rất phức tạp, thông qua phản ứng decarboxyl hóa, N-acyl hóa và phản ứng sulfo hóa, deamin hóa và ester với acid glucoronic tạo thành chất không có tác dụng Chất chuyển hóa chính

5

được thải trừ qua thận (30-60%) là hợp chất disulfid L-cystein, xuất hiện trong nước tiểu sau 24 giờ đầu, dạng không hoạt tính được phát hiện trong phân [30], [17] Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng

S-(carboxymethylthio)-sự chuyển hóa của carbocistein dao động trên cùng 1 cá thể, vài chất chuyển hóa dạng sulfoxid được tạo thành sau khi dùng thuốc về đêm Do vậy việc lựa chọn đúng thời điểm uống thuốc có tác động lớn đến sự đồng nhất của các chất chuyển hóa S-oxid qua thận

Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy các thành phần đường (fucos

và acid sialic) trên glycoprotein nhầy (còn được gọi là mucin, thông qua việc

ức chế kinin, làm giảm hay ngăn chặn phản ứng viêm và co thắt phế quản) có liên quan đến độ nhớt của dịch nhầy đường hô hấp Carbocistein là thuốc điều hòa chất nhầy, có tác dụng điều chỉnh fucos và acid sialic trong chất nhầy đường hô hấp thông qua cơ chế ức chế yếu tố TNF-α (tumor nucrosis factor alpha- TNF α) yếu tố làm tăng độ nhớt của chất nhầy và ức chế sialyl Lewis

X trên protein dung hợp MUC5AC (Mucin 5 kiểu phụ A và C) do đó làm giảm độ nhớt của chất nhầy [2], [17], [13] Thêm vào đó, carbocistein còn có tác dụng làm loãng đờm bằng cách cắt đứt cầu nối disulfid liên kết chéo các chuỗi peptid của mucin Tính chất này làm giảm độ quánh của chất nhầy, và giúp khạc đờm dễ dàng [17], [13]

Tác dụng chống oxy hóa: trong in vitro, carbocistein có tác dụng chống

oxy hóa Nhóm thioester của carbocistein có thể bị oxy hóa bởi các mẩu oxy hoạt động và hình thành dạng sulfoxid hoặc các dẫn chất sulfon Đó là khả năng oxy hóa nội sinh Đặc biệt là chúng rất chọn lọc với nhóm -HClO và -

OH Tác dụng oxy hóa cũng đã được chứng minh khi kích hoạt các tế bào máu đơn nhân ở ngoại vi, nhờ đó mà chúng cũng có tác dụng chống viêm Tuy nhiên cơ chế oxy hóa vẫn chưa được biết đến một cách đầy đủ [17] , [27]

6

Tác dụng chống viêm: Đối với những thuốc có chứa nhóm cystein, khả năng chống oxy hóa cùng với tiền chất khác là glutathion đã được chứng minh là làm tăng khả năng sản xuất cytokin tiền viêm (TNF-α; IL-6; IL-8) [22], [9]

Tác dụng trong ngăn ngừa lây nhiễm cúm A: theo nghiên cứu của Mutsuo và cộng sự cho thấy, carbocistein có tác dụng trong ngăn ngừa lây nhiễm cúm typ A Tác dụng ức chế yếu tố nhân kappa B (Nuclear factor- kappa B, NF-κB) và tăng pH trong endosomes làm giảm các thụ thể virus cúm người trong tế bào biểu mô đường hô hấp, do vậy, ức chế sự lây nhiễm virus cúm A [32]

Carbocistein được sử dụng hiệu quả trong bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính là bệnh có liên quan đến phản ứng viêm

và các yêu tố nguy cơ: khói thuốc lá, khí độc khi vào đường dẫn khí thì chính các khí này kích thích đại thực bào và các tế bào thượng bì tiết ra các TNF-α

và các chất trung gian gây viêm như IL8 Cho nên phản ứng viêm trong bệnh này chính là đáp ứng bảo vệ của đường hô hấp trước những tác động của khói thuốc và các chất độc khác Theo đó, thuốc hoạt động như là một chất long đờm, một chất chống viêm và chất chống oxy hóa đều có tác dụng tốt trong bệnh CODP Như vậy, tính chất chống viêm và chống oxy hóa chính là một đặc tính quan trọng trong điều trị bệnh CODP [34], [22], [17]

Carbocistein được sử dụng trong hội chứng suy nhược liên quan đến ung thư Trong một loạt những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, những bệnh nhân ung thư với nồng độ cao các mẫu chất oxy hóa hoạt động trong máu và giảm nồng độ các men erythrocyt glutathion peroxydase và superoxyd dimutase Sự có mặt của các chất này có liên quan mật thiết đến nồng độ các cytokin tiền viêm IL-6; TNF-α và CRP (C-reactive protein) và nồng độ thấp leptin [19]

7

Chỉ định: Rối loạn hô hấp, đặc biệt liên quan đến sự tăng tiết hoặc tăng độ

nhầy nhớt như viêm phế quản cấp hoặc mãn, giãn phế quản, viêm phế quản dạng hen hoặc khí phế thũng, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính Ðiều trị hỗ trợ trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng, chảy dịch ống tai và giảm việc tăng tiết trước khi phẫu thuật [17], [12], [22]

1.2.1 Phương pháp tổng hợp carbocistein đi từ L-cystein

- Phương pháp của L Michaelis và Maxwell P Schubert (1934)

Tổng hợp từ L-cystein hydroclorid monohydrat và acid monocloroacetic trong môi trường kiềm (dung dịch KOH 6,7M) Dung dịch sau phản ứng được điều chỉnh về pH 5 bằng acid acetic băng, làm lạnh bằng nước đá trong 2h Lọc loại tủa cystein, thu lấy dịch lọc Điều chỉnh pH của dịch lọc về 2 bằng acid HCl 6M, làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h, carbocistein sẽ kết tinh Lọc thu lấy tinh thể Hòa tan tinh thể carbocistein trong 200 ml nước sôi, lọc nóng thu dịch lọc Dịch lọc được làm lạnh bằng đá Carbocistein sẽ kết tinh dưới dạng tinh thể 6 mặt Lọc, rửa bằng nước lạnh, sấy ở 60oC Hiệu suất phản ứng khoảng 70% [25]

- Phương pháp của M.D Amstrong và cộng sự (1951)

Tổng hợp carbocistein từ cystein bằng cách hồi lưu hỗn hợp của cystein và acid monocloroacetic trong HCl đặc Kết quả thu được dạng racemic của carbocistein [8] Năm 1958, L Goodmans và cộng sự đã cải tiến qui trình này bằng cách đun hồi lưu trong môi trường kiềm loãng cũng thu

L-được L-carbocistein nhưng hiệu suất thấp hơn [16]

- Phương pháp của Maurice Joullie và cộng sự (1967)

Carbocistein được tổng hợp từ cystein hydroclorid và acid monocloroacetic trong môi trường pH 8 (điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 5N) dưới bầu khí nitơ ở nhiệt độ 50o

C Khi phản ứng kết thúc, ngừng cung cấp nitơ, sau đó điều chỉnh pH về 6 bằng HCl đặc Tẩy màu bằng than hoạt,

9

lọc nóng, thu dịch lọc Dịch lọc được đưa về nhiệt độ phòng Điều chỉnh pH dịch lọc về 2,8 bằng HCl đặc, carbocistein sẽ kết tủa Ly tâm thu lấy tủa và rửa tủa cho đến khi hết ion Cl-

Tinh chế: Tạo hỗn dịch của carbocistein thô với HCl 2N (HCl dư khoảng 25%) Đun sôi hỗn dịch trong 5 phút, rồi làm lạnh về 30oC Điều chỉnh pH dung dịch đến 2,8 bằng NaOH 2N Sản phẩm sẽ kết tủa Lọc rửa tủa sản phẩm tới khi hết ion clorid Sản phẩm đạt độ tinh khiết 99,5% Hiệu suất tinh chế đạt 90- 95% Nhiệt độ nóng chảy: 249- 250oC [24]

- Phương pháp của Dương Văn Khoa (2014)

Cho vào bình cầu 3 cổ dung tích 250ml hỗn hợp gồm: 10,00g (0,042mol) L-cystin và 10,00g (0,106mol) acid monocloroacetic vào 100 ml nước ở nhiệt độ phòng Nitơ được sục liên tục trong quá trình phản ứng Thêm từ từ 40,0ml NaOH 5M vào khối phản ứng, nhiệt độ duy trì khoảng 25°C Thêm tiếp 20g (0,31mol) kẽm đã được hoạt hóa, khuấy 45 phút Sau đó lọc loại bỏ kẽm dư, dịch lọc được điều chỉnh về pH 2 bằng acid sulfuric đặc Làm lạnh bằng nước đá khoảng 1 giờ, lọc kết tủa sản phẩm đem sấy ở 60°C trong 3 giờ, thu được 11,67g sản phẩm thô Hiệu suất đạt 78%

Tinh chế bằng nước: Hòa tan 10,0(g) sản phẩm thô vào trong 500,0ml nước sôi, lọc nóng thu dịch lọc Dịch lọc được để kết tinh lạnh qua đêm SCMC sẽ kết tinh dưới dạng tinh thể trắng, lóng lánh Lọc, rửa bằng nước lạnh, sấy ở 60oC trong 3h thu được 9,42g sản phẩm Hiệu suất quá trình kết tinh khoảng 94,0%, nhiệt độ nóng chảy 204- 206oC

1.2.2 Phương pháp tổng hợp carbocistein đi từ L-cystin

- Phương pháp của Earl Pierson và cộng sự (1946)

Carbocistein được tổng hợp từ L-cystin bằng cách thực hiện phản ứng khử trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 30%) có mặt acid

C [14]

- Phương pháp Alfred A Maierhop và cộng sự (1978)

Để tổng hợp carbocistein, trước tiên nhóm tác giả tiến hành phản ứng khử hóa L-cystin bằng tác nhân Na/NH3 lỏng, ở -40oC để tạo thành L-cystein Sau đó cho L-cystein thu được phản ứng với acid monocloroacetic ở nhiệt độ 20-30oC, tạo thành Carbocistein Hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 92%, sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao hơn các phương pháp khác [23]

Phương trình phản ứng:

Hình 1.6 Phản ứng tổng hợp carbocistein của Alfred A Maierhop và cộng sự

(1978)

- Phương pháp của J González-García và các cộng sự (1998)

Sử dụng phản ứng điện phân L-cystin với điều kiện tại cực âm của bình điện phân luôn có mặt của anion monocloacetat, bằng cách thêm tác nhân alkyl hóa này vào trong suốt quá trình điện phân Điện cực sử dụng có thể là điện cực carbon

- Cực âm: Điện cực sợi carbon

- Cực dương: Kim loại

1.2.3 Phương pháp tổng hợp carbocistein đi từ nguyên liệu khác

- Phương pháp của Kazuo Nakayasu và cộng sự (1984)

Các tác giả tiến hành tổng hợp carbocistein đi từ nguyên liệu ban đầu là acid thioglycollic bằng phản ứng với β-cloroalanin trong môi trường kiềm (dung dịch KOH), pH 10-13, ở nhiệt độ 20oC Sau đó acid hóa khối phản ứng

về pH 2-4, sản phẩm sẽ kết tủa [26]

Hình 1.7 Phản ứng tổng hợp carbocistein của Kazuo Nakayasu và cộng sự

(1984)

- Phương pháp của Kenzo Yokozeki và cộng sự (1988)

Từ chất ban đầu là aicd DL-2-aminothiazolin-4-carboxylic (ATC), sử

dụng vi khuẩn Pseudomonas thiazolinophilum hoặc Pseudomonas desmolytica, quá trình sinh tổng hợp nên Carbocistein gồm 4 bước:

- Bước 1: Sử dụng enzym ATC racemase phân tách hỗn hợp đồng phân racemic DL-ATC thành D-ATC và L-ATC

- Bước 2: Thủy phân L-ATC thành S-carbamyl-L-cystein bằng enzym L-ATC hydroxylase

P thiazolinophilum và P desmolytica có thể tạo ra cả 3 enzym trên với

sự có mặt của DL-ATC trong môi trường nuôi cấy [33]

- Phương pháp của Ken-Ichi Ishiwata và cộng sự (1989)

Các tác giả tiến hành tổng hợp carbocistein từ L-serin với enzym

tryptophan synthease (thu được từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Escherichia Coli) trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Enzym tryptophan synthease sẽ

xúc tác cho phản ứng thay thế vị trí β của L-serin bằng một chất nền là

thioglycolic hoặc tốt hơn là alkylthioglycolat tạo thành S - Ethylhexyloxycarbonylmethyl) – l - cystein, sau đó S - (2-

(2-ethylhexyloxycarbonylmethyl) – l - cystein sẽ bị thủy phân trong môi trường kiềm tạo sản phẩm [21]

1.3 Phân tích và lựa chọn phương pháp

- Bệnh đường hô hấp hiện nay khá phổ biến trên cả nước Nhu cầu sử dụng

carbocistein cho các bệnh này là khá cao mà hầu hết các dạng bào chế đều

phải nhập ngoại

- Từ vài năm qua, trong quá trình thực hiện đề tài Nghiên cứu cấp Nhà

nước: “Nghiên cứu chiết tách L-cystin từ tóc, phụ phẩm móng, sừng, lông

gia súc và bán tổng hợp N-acetyl-L-cystein làm nguyên liệu sản xuất thuốc”, nhóm nghiên cứu trường Đại học Dược Hà Nội đã triển khai chiết

tách được L-cystin (là nguyên liệu chính để bán tổng hợp Carbocistein) từ tóc

và các phụ phẩm như móng, sừng, lông gia súc Cũng trong đề tài này, nhóm

đã thực hiện phản ứng khử hóa L-cystin thành L-cystein ở qui mô pilot với hai tác nhân Al/HCl và điện hóa Như vậy, cả hai nguyên liệu cho bán tổng

để loại L-cystin, rồi hạ pH xuống 2 để thu sản phẩm CMC Kết tinh lại bằng nước) [5] Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp này chỉ phù hợp với qui mô nhỏ

do có một số nhược điểm là: phản ứng tỏa nhiệt mạnh nên khó kiểm soát được nhiệt độ phản ứng khi tăng qui mô; quá trình tinh chế bằng nước cần thiết bị cồng kềnh và tốn nhiều năng lượng Chúng tôi thấy cần phải cải tiến qui trình để có thể triển khai ở qui mô lớn hơn (10 kg/mẻ) và có khả năng ứng dụng trong sản xuất Nguyên liệu để bán tổng hợp Carbocistein là L-cystein hydroclorid monohydrat Qui trình tổng hợp được thực hiện và cải tiến theo phương pháp của L Michaelis và Maxwell P Schubert (1934), Dương Văn

Khoa [5], [25]

14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu chính là L-cystein hydroclorid monohydrat được điều chế tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược Các hóa chất, dung môi được liệt kê ở bảng 2.1 Thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội (xem bảng 2.2)

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu

2 Acid monocloroacetic PA và công nghiệp Trung Quốc

15

Bảng 2.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu

1 Bản mỏng Silicagel GF254 70-230 mesh Đức

2 Bộ lọc hút chân không Buchner Đức

Đức

5 Máy cất quay chân không Buchi CH 9230 Buchi- Thụy Sĩ

6 Máy khuấy từ gia nhiệt Wisd Wise stir

7

Máy tạo khí N2 Nitrox UHP N0751

Model UHP N0751E-SIN 9900774

Domnick Hunter Ltd- Anh

8

Tủ hotte Unilab

Model TH 1300

Jinan Unilab Instrusments Co Ltd-Trung quốc

16

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Bán tổng hợp carbocistein từ L-cystein hydroclorid monohydrat qui mô

100 g/mẻ và khảo sát một số điều kiện phản ứng để hoàn thiện phương pháp (nhiệt độ, pH, tỷ lệ mol) Chọn phương pháp tối ưu và phù hợp điều kiện trong nước về nguyên liệu, hóa chất, khả năng triển khai ở qui

 Theo dõi độ ổn định của sản phẩm, dự đoán tuổi thọ thuốc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bán tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm

Tổng hợp carbocistein từ L-cystein hydroclorid monohydrat

Bán tổng hợp carbocistein ở qui mô 100 g/mẻ, 500 g/mẻ, 1 kg/mẻ, 5 kg/mẻ theo L.Michaelis và cộng sự [25] Sơ đồ phản ứng như sau:

Hình 2.1 Tổng hợp carbocistein từ L-CHM theo L.Michaelis và cộng sự Bán tổng hợp carbocistein ở qui mô 5 kg/mẻ và 10 kg/mẻ theo sơ đồ phản ứng sau:

Hình 2.2 Tổng hợp carbocistein theo phương thức mới

17

Tinh chế sản phẩm bằng các phương pháp kết tinh trong dung môi thích hợp (phương pháp kết tinh từ nước, phương pháp kết tinh sử dụng NaOH, phương pháp kết tinh từ môi trường kiềm)

2.3.2 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết

Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm thu được bằng SKLM và đo t0nc

- SKLM: Tính giá trị hệ số lưu giữ Rf

 Dung môi hòa tan: dung dịch HCl 1M hoặc NH4OH 2M

 Hệ dung môi chạy sắc ký: n-butanol: acid acetic băng: nước cất - 6: 2: 2

 Thuốc thử hiện màu: Dung dịch ninhydrin 1% trong ethanol 96% – Đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm trên máy EZ – Melt (Mỹ)

2.3.3 Xác định cấu trúc sản phẩm

Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13

C-NMR)

 Phổ hồng ngoại (IR): phổ hồng ngoại được ghi tại Khoa Hóa, Trường Đại học KHTN Hà Nội, trên máy Perkin Elmer và trên máy Impact- 410 tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000- 400 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm [4]

 Phổ khối lượng (MS): phổ khối lượng các chất được ghi tại Viện Hóa học

và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, máy đo LC/MSD Trap Agilent, dung môi nước [7]

18

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

H-NMR) và phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR) được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dùng D2O làm dung môi [1]

2.3.4 Kiểm nghiệm chất lượng carbocistein tổng hợp được

Sản phẩm carbocistein được tiến hành kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn dược điển Anh BP 2013 tại Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung Ương

Định lượng carbocistein theo Dược điển Anh BP 2013 bằng phương pháp chuẩn độ acid - base trong môi trường khan:

Hòa tan 0,150 g chế phẩm trong 10 ml acid formic khan, đun nóng nhẹ

và lắc tới khi hòa tan hoàn toàn Thêm 50 ml acid acetic khan Chuẩn độ với acid percloric 0,1M, xác định điểm kết thúc bằng máy đo điện thế 1 ml dd acid percloric tương đương với 17,92 mg CMC

Nguyên tắc chuẩn độ: Chuẩn độ base yếu trong môi trường khan

Phương trình chuẩn độ: CMC có nhóm NH2 ký hiệu là R-NH2

19

2.3.5 Theo dõi độ ổn định của sản phẩm

Nghiên cứu độ ổn định của thuốc ở giai đoạn sản xuất công nghiệp: ba

lô thuốc sản xuất ở qui mô công nghiệp được đánh giá độ ổn định với phép thử nghiệm cấp tốc tối thiểu 6 tháng và thử nghiệm dài hạn tối thiểu 12 tháng

Điều kiện khí hậu ở Việt Nam là vùng khí hậu IV

Phương pháp thử nghiệm lão hóa cấp tốc:

Là các thử nghiệm làm tăng tốc độ phân giải của thuốc bằng cách bảo quản thuốc trong các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm cao hơn mức độ bình thường ở điều kiện thực Mục đích của lão hóa cấp tốc là xác định các thông số động hóa học của quá trình phân hủy, từ đó tính toán, dự báo tuổi thọ của thuốc Điều kiện bảo quản lão hóa cấp tốc: 400

C ± 20C , độ ẩm 75% ± 5%

Thời gian tối thiểu: 6 tháng

Số lô tối thiểu: 3 lô

Phương pháp thử nghiệm trong điều kiện thường:

Là thử nghiệm bảo quản thuốc trong điều kiện thực, toàn bộ các chỉ tiêu chất lượng theo tiêu chuẩn đều được đánh giá kéo dài theo thời gian đến khi thuốc không còn đáp ứng được yêu cầu đề ra Thử nghiệm này có ý nghĩa xác định chính xác tuổi thọ, thời gian sử dụng của thuốc Tuy nhiên, vì thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chỉ tiến hành thử nghiệm ở điều kiện thường trong thời gian 1 năm

Điều kiện bảo quản trong điều kiện thường: nhiệt độ 30 ± 20C, độ ẩm 75 ± 5%

Thời gian: 12 tháng

Số lô tối thiểu: 3 lô

Mọi biến đổi về hàm lượng của sản phẩm trong thời gian nghiên cứu được theo dõi và đánh giá theo phương pháp thử của Dược điển Anh BP 2013

20 Lập bảng số liệu kết quả, kết luận về độ ổn định của thuốc [28], [31]

21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 3.1 Bán tổng hợp carbocistein từ L-CHM qui mô 100 g/mẻ

3.1.1 Tổng hợp carbocistein qui mô 100 g/mẻ theo [5]

Tiến hành tổng hợp carbocistein qui mô 100g/mẻ với qui trình tương tự với qui trình tổng hợp 10 g/mẻ đã được khảo sát bởi Dương Văn Khoa (2014) [5]

6 bằng HCl 5M Làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h Lọc loại tủa L-cystin, thu lấy dịch lọc Điều chỉnh pH của dịch lọc về 2,8 bằng HCl 5M Sau đó làm lạnh khối phản ứng trong 2h, CMC sẽ kết tinh Lọc thu lấy sản phẩm, sấy ở 600C trong 3h thu được 98,5 g sản phẩm thô

Hiệu suất đạt: 96,5%, t0nc = 188-1910C

3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

Ở các nghiên cứu trong nước trước đây cũng đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng giữa L-cystein và MAC Tuy nhiên chúng đều chỉ là những nghiên cứu tiến hành ở qui mô 10 g/mẻ Với mục tiêu là

3.1.2.1 Tỷ lệ mol acid monocloroacetic và L-cystein hydroclorid monohydrat

Để đánh giá được tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của sản phẩm, các thí nghiệm được tiến hành với lượng L-CHM giữ nguyên (100,0g), thay đổi lượng MCA

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng tỷ lệ mol MCA: L- CHM tới phản

Tỷ lệ mol MCA: L- CHM

Khối lượng CMC (g)

Hiệu suất (%)

Kết quả bảng 3.1 được biểu diễn đồ thị ở hình 3.1:

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lệ mol tới phản ứng

87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

23

Nhận xét: Qua bảng số liệu 3.1 và hình 3.1 ta thấy, tỷ lệ mol MCA : L-CHM

có ảnh hưởng lớn tới hiệu suất phản ứng Khi tăng tỷ lệ mol MCA : L-CHM

từ 0,9 tới 1,0 và 1,1 thì hiệu suất phản ứng tăng dần, khi tăng tỷ lệ mol tới 1,2 hiệu suất gần như không đổi Tại tỷ lệ mol MCA: L-CHM = 1,1 quá trình tổng hợp cho hiệu suất cao nhất (hiệu suất 96,55 %)

3.1.2.2 Nhiệt độ phản ứng

Để đánh giá được ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất phản ứng, các thí nghiệm được tiến hành với tỷ lệ mol MCA : L-CHM = 1,1 là: 100,0 g (0,57 mol) L-CHM và 59,2 g (0,63 mol) MCA, dải nhiệt độ được khảo sát từ 5-750C

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất phản ứng

STT Nhiệt

độ

Khối lượng CMC thô (g)

Hiệu suất (%)

T° nc (°C )

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất phản ứng

24

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy, khi nhiệt độ dưới 450C thì phản ứng đạt hiệu suất cao (95,86 - 96,74%) Từ 45-750C, hiệu suất giảm còn 92% Điều này là do ở nhiệt độ cao, L-cystein bị oxy hóa thành L-cystin Từ đồ thị trên ta thấy, phản ứng tốt nhất nên tiến hành ở nhiệt độ dưới 450C

3.1.2.3 pH của phản ứng

Để đánh giá được ảnh hưởng của pH tới phản ứng alkyl hóa, chúng tôi

đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH tới hiệu suất với: 100,0 g (0,57 mol) L-CHM và 59,2 g (0,63 mol) MCA, nhiệt độ phòng, chỉ thay đổi pH phản ứng bằng cách thêm lượng khác nhau NaOH 10M

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của pH tới hiệu suất phản ứng

STT pH của hỗn

hợp phản ứng

Khối lượng CMC (g)

Hiệu suất (%)

25

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH phản ứng tới hiệu suất phản

ứng

Nhận xét: pH của phản ứng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất Với pH dưới 8 và

trên 10, hiệu suất rất thấp Tại pH 9 ta thấy hiệu suất phản ứng đạt cao nhất (96,6%)

Từ kết quả khảo sát, chúng tôi đề nghị qui trình tổng hợp carbocistein từ L-CHM qui mô 100 g/mẻ như sau:

Trong bình cầu 500 ml: hòa tan hỗn hợp gồm: 100,0 g (0,57 mol) cystein hydroclorid monohydrat; 59,2 g (0,63 mol) acid monocloroacetic và

L-100 ml nước đã sục khí N2 Làm lạnh, vừa nhỏ từ từ dung dịch NaOH 10M vừa khuấy từ đến khi đạt pH 9 (duy trì sục N2 và nhiệt độ phản ứng dưới

450C) Sau đó khuấy tiếp đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), rồi điều chỉnh pH của dung dịch về 6 bằng HCl 5M Làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h Lọc loại tủa L-cystin, thu lấy dịch lọc Điều chỉnh pH của dịch lọc về 2,8 bằng HCl 5M Sau đó làm lạnh khối phản ứng trong 2h, CMC sẽ kết tinh Lọc, rửa bằng nước thu lấy sản phẩm Sấy ở 600C trong 3h thu được 98,5 g CMC, hiệu suất đạt 96,55%, t0

26

Nhận xét: quá trình tổng hợp carbocistein qui mô 100 g/mẻ so với qui

mô 10 g/mẻ không có nhiều khác biệt về điều kiện phản ứng cũng như hiệu suất Vì thế chúng tôi quyết định chọn những qui trình tổng hợp trên để làm

cơ sở cho việc nâng lên qui mô cao hơn

3.2 Xây dựng qui trình bán tổng hợp carbocistein qui mô 500 g/mẻ

Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát, chúng tôi đã rút ra được các điều kiện thích hợp để tổng hợp carbocistein có hiệu suất cao và đạt tiêu chuẩn:

- Tỷ lệ mol MCA: L-CHM = 1,1 : 1

- pH phản ứng bằng 9

- Nhiệt độ phản ứng: <450C

- Sục nitơ trong quá trình phản ứng

Từ các kết quả trên, tiến hành nâng cấp qui mô tổng hợp lên 500 g/mẻ với qui trình tổng hợp như sau: Cho vào bình cầu 6L hỗn hợp gồm: 540,0 g (3,07 mol) L-cystein hydroclorid monohydrat; 320,0 g (3,38 mol) acid monocloroacetic và 400 ml nước đã sục khí N2 Làm lạnh, vừa nhỏ từ từ dung dịch NaOH 10M vừa khuấy từ đến khi đạt pH 9 (duy trì sục N2 và nhiệt độ phản ứng dưới 450C) Sau đó khuấy tiếp đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), rồi điều chỉnh pH của dung dịch về 6 bằng HCl 5M Làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h Lọc loại tủa L-cystin, thu lấy dịch lọc Điều chỉnh pH của dịch lọc về 2,8 bằng HCl 5M Sau đó làm lạnh khối phản ứng trong 2h, CMC sẽ kết tinh Lọc, rửa bằng nước thu lấy sản phẩm Sấy ở

600C trong 3h Kết quả tổng hợp 3 mẻ được thể hiện trong bảng sau:

27

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của qui trình tổng hợp

carbocistein qui mô 500g/mẻ

STT

Khối lượng L-CHM (g)

Khối lượng MCA (g)

Khối lượng CMC (g)

Hiệu suất (%) t° nc (°C )

Nhận xét: với qui trình tương tự như ở qui mô 100 g/mẻ, khi nâng cấp lên qui

mô 500 g/mẻ cho thấy quá trình diễn ra ổn định với hiệu suất khá cao (tương

tự như ở qui mô 100 g/mẻ) Từ đó làm cơ sở để chúng tôi tiếp tục nâng cấp lên qui mô lớn hơn

3.3 Xây dựng qui trình bán tổng hợp carbocistein qui mô 1 kg/mẻ

Tiếp tục nâng cấp qui trình tổng hợp lên qui mô 1 kg/mẻ, tương tự như ở qui

mô 500 g/mẻ:

Trong bình cầu 6 L: hòa tan hỗn hợp gồm: 1050,0g (5,98 mol) cystein hydroclorid monohydrat; 621,4g (6,58 mol) acid monocloroacetic và 800ml nước đã sục khí N2 Làm lạnh, vừa nhỏ từ từ dung dịch NaOH 10M vừa khuấy từ đến khi đạt pH 9 (duy trì sục N2 và nhiệt độ phản ứng dưới

L-450C) Sau đó khuấy tiếp đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), rồi điều chỉnh pH của dung dịch về 6 bằng HCl 5M Làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h Lọc loại tủa L-cystin, thu lấy dịch lọc Điều chỉnh pH của dịch lọc về 2,8 bằng HCl 5M Sau đó làm lạnh khối phản ứng trong 2h,