Nghiên cứu bán tổng hợp troxerutin từ rutin

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Rutin 3 1.1.1. Công thức, tính chất 3 1.1.2. Nguồn nguyên liệu và phương pháp chiết 5 1.2. Troxerutin 7 1.2.1. Công thức, tính chất 7 1.2.2. Tác dụng của troxerutin (Vitamin P4) 8 1.2.3. Một số sản phẩm troxerutin trên thị trường 11 1.2.4. Các phương pháp bán tổng hợp troxerutin từ rutin 13 1.3. Ethylen clorohydrin 15 1.3.1. Công thức, tính chất 15 1.3.2. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người 16 1.3.3. Những điều cần chú ý về an toàn lao động khi làm việc với EC 16 1.4. Ethylen oxyd 17 1.4.1. Công thức, tính chất 17 1.4.2. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người 18 1.4.3. Những điều cần chú ý về an toàn lao động khi làm việc với EO 19 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Nguyên liệu 20 2.2. Thiết bị và dụng cụ 21 2.3. Nội dung nghiên cứu 22 2.3.1. Xây dựng quy trình bán tổng hợp troxerutin từ rutin 22 2.3.2. Kiểm nghiệm troxerutin 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1. Phương pháp tổng hợp hóa học 22 2.4.2. Xác định các thành phần có trong sản phẩm 22 2.4.3. Xác định cấu trúc sản phẩm 24 2.4.4. Định lượng 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1. Nghiên cứu quy trình bán tổng hợp troxerutin 25 3.1.1. Tiến hành bán tổng hợp troxerutin với tác nhân alkyl hóa là ethylen clorohydrin trên cơ sở phương pháp của Stevens 25 3.1.2. Tiến hành bán tổng hợp troxerutin với tác nhân alkyl hóa là ethylen oxyd trên cơ sở phương pháp của F. De carvahho 32 3.1.3. Xác định thành phần của các sản phẩm thu được 37 3.1.4. Xác định cấu trúc sản phẩm 41 3.1.5. Đề xuất quy trình bá n tổng hợp troxerutin 44 3.2. Định lượng troxerutin trong sản phẩm 48 3.2.1. Xác định mất khối lượng do làm khô 48 3.2.2. Định lượng troxerutin trong sản phẩm 49 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 51 4.1. Về quy trình bán tổng hợp troxerutin 51 4.1.1. Về phản ứng bán tổng hợp 51 4.1.2. Về quá trình tinh chế sản phẩm sau phản ứng 56 4.2. Về xác định thành phần hỗn hợp sản phẩm bằng HPLC 57 4.3. Về xác định cấu trúc sản phẩm chính 58 4.3.1. Về phổ hồng ngoại 58 4.3.2. Về phổ khối lượng 59 4.3.3. Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 60 4.4. Về xác định hàm lượng troxerutin 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 65 1. KẾT LUẬN 65 2. ĐỀ XUẤT 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid desoxyribonucleic ACGHI Hội nghị các tổ chức vệ sinh công nghiệp của Mĩ (American Conference of Governmental Industrial Hygienists) CDCl 3 Cloroform – d CICAD Văn bản thẩm định hóa chất (Concise Chemical Assessment Document) 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) COSY Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid EC Ethylen clorohydrin ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) EO Ethylen oxyd EtOH Ethanol h Giờ (hour) HDL Lipoprotein tỉ trọng cao (High Density Lipoprotein) HMBC Heteronuclear Multiple Bonds Correlation 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IARC Cơ quan quốc tế nghiên cứu ung thư (International Agency for Research in Cancer) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) IUPAC Hiệp hội Hóa học Quốc tế (International Union of Pure and Applied Chemistry) l Lít LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) MeOH Methannol NIOSH- US Viện quốc gia về an toàn sức k hỏe lao động Mĩ (National Institute for Occupational Safety and Health- United States) NTP- US Chương trình độc chất học quốc gia Mĩ (National Toxicology Program - United States) ppm Đơn vị phần triệu (parts per million) SKLM Sắc ký lớp mỏng SN 2 Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (Nucleophilic Substitution) T 0 nc Nhiệt độ nóng chảy US-EPA Cơ quan bảo vệ môi trường Mĩ (United States Environmetal Protetion Agency) US- OSHA Cục quản lý sức khỏe và an toàn lao động Mĩ (United States Occupational Safety and Health Administration) UV Tử ngoại (Ultraviolet) UV-VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) VLDL Lipoprotein tỉ trọng rất thấp (Very Low Density Lipoprotein) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số biệt dược có chứa troxerutin của Việt Nam 11 Bảng 1.2. Một số biệt dược có chứa troxerutin trên thế giới 12 Bảng 1.3. Các cấp độ tiếp xúc với ethylen clorohydrin 17 Bảng 1.4. Giới hạn cho phép tiếp xúc với EO của US-OSHA 19 Bảng 2.1. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm 20 Bảng 2.2. Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm 21 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxeruti n với tác nhân EC 26 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin với tác nhân EC 27 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol EC/rutin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin 29 Bảng 3.4. Tính chất các sản phẩm (T1-T4) thu được sau tinh chế 31 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát sư ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin với tác nhân EO 33 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol EO/rutin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin 34 Bảng 3.7. Tính chất các sản phẩm (T5-T8) thu được sau tinh chế 36 Bảng 3.8. Kết quả chạy HP LC của T1 39 Bảng 3.9. Kết quả chạy HPLC của T9 40 Bảng 3.10. Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của T1 và T9 49 Bảng 3.11. Kết quả xác định hàm lượng troxerutin 50 DANH MỤC CÁC HÌNH  Hình 3.1. Sắc kí đồ troxerutin đối chiếu (a) 38 Hình 3.2. Sắc kí đồ mẫu thử T650C (EC) 39 Hình 3.3. Sắc kí đồ mẫu thử T1 39 Hình 3.4. Sắc kí đồ mẫu thử T9 40 Hình 4.1. Phổ ESI-MS negative của chất T9 59 Hình 4.2. Phổ 13C-NMR và DEPT của T9 60 Hình 4.3. Phổ 1H-NMR giãn rộng vùng từ 3,04 – 4,96 ppm của T9 61 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR giãn rộng vùng từ 5,11 – 7,84 ppm của T9 62 Hình 4.5. Phổ COSY giãn rộng của T9 62 Hình 4.6. Phổ HMBC của T9 63 Hình 4.7. Một số tương tác chính trên phổ COSY ( ) và HMBC () của T9 63   DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. Quy trình bán tổng hợp tri(hydroxyethyl) rutin 45 Sơ đồ 2. Quy trình bán tổng hợp troxerutin 47 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thông báo năm 2010 của Hội tim mạch Việt Nam, hiện nay trên toàn thế giới bệnh tim mạch đã vượt xa các bệnh ung thư, nhiễm khuẩn nói chung và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong. Mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong do bệnh tim mạch và các biến chứng của nó [9]. Nếu không có một hành động t ích cực thì đến năm 2015 sẽ có 20 triệu người trên toàn thế giới chết do bệnh tim mạch, tỉ lệ này tập trung nhiều ở các nước đang phát triển (khoảng 80%).Đứng trước những thách thức đó, các nhà khoa học trên thế giới đã và đang không ngừng nghiên cứu tìm ra các thuốc đặc trị cho các bệnh tim mạch. Rutin là một flavonoid có tác dụng làm bền và làm giảm tính thấm của mao mạch , giảm trương lực cơ và chống co thắt. Rutin được dùng chủ yếu để phòng những biến cố của bệnh xơ vữa động mạch, điều trị các trường hợp suy tĩnh mạch [5]. Từ trước đến nay, rutin được biết đến như một vị thuốc chữa trị rất tốt các bệnh liên quan đến mạch máu trong Đông y cũng như trong Tây y. Tuy nhiên nhược điểm của rutin là tan kém trong nước nên khó hấp thu và khó bào chế các dạng thuốc có khả năng hấp thu tốt. Để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học đã tìm ra một dẫn chất flavonoid cùng nhóm với rutin, dễ hấp thu và tác dụng dược lí mạnh hơn – đó là troxerutin. Troxerutin có ý nghĩa quan trọng trong điều trị suy tĩnh mạch m ãn tính – một bệnh lý nguy hiểm và ngày càng trở nên phổ biến hơn ở nước ta cũng như trên thế giới. Chính vì vậy, việc nghiên cứu bán tổng hợp các hoạt chất có tác dụng điều trị tốt như troxerutin hiện đang rất được quan tâm. Troxerutin được bán tổng hợp từ rutin với tác nhân alkyl hóa là ethylen- oxyd, ethylen-clohydrin. Việc bán tổng hợp troxerutin từ rutin đã được thực hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới như Anh, Mĩ, Trung Quốc, Nhật 1 Bản…Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa sản xuất được troxerutin, việc sử dụng troxerutin cho sản xuất dược phẩm trong nước là từ nguồn nguyên liệu nhập khẩu. Trước nhu cầu thực tế và tình hình sản xuất dược phẩm trong nước, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu bán tổng hợp troxerutin từ rutin” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng được quy trình bán tổng hợp troxerutin từ rutin ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Bán tổng hợp được t roxerutin đạt tiêu chuẩn hàm lượng theo dược điển Anh 2010. Với những mục tiêu trên, chúng tôi hi vọng khóa luận này sẽ là một nghiên cứu thăm dò để có thể ứng dụng sản xuất troxerutin ở quy mô pilot và tiến tới quy mô công nghiệp tại Việt Nam.          2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN  1.1. Rutin 1.1.1. Công thức, tính chất Công thức cấu tạo - Công thức phân tử: C 17 H 30 O 19 . - Khối lượng phân tử: 610,52 đvC. -Theo sự phân loại dựa vào vị trí của gốc aryl thì rutin được xếp vào nhóm flavonol thuộc nhóm Euflavonoid [5]. Công thức cấu tạo như sau: O OH Flavonol Rutin Rutin 3D Tính chất - Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng hơi lục, để ra ánh sáng có thể màu hơi sẫm lại. Kết tinh hình kim vàng nhạt trong nước. Tinh thể ngậm 3 phân tử nước, trở thành khan sau khi sấy 12h ở 110 o C dưới áp suất giảm 10 mm Hg. - Rutin khan rất dễ hút ẩm, rutin khan biến màu nâu ở 125 o C, dẻo ở 195-197 o C và phân hủy ở 214-215 o C [3]. - Năng suất quay cực [α] 23 D = +13,82 0 . Bột Rutin 3 - Độ tan: dễ tan trong pyridin, tan trong methanol và các dung dịch kiềm loãng, hơi tan trong glycerin, khó tan trong ethanol nguội và isopropanol, thực tế không tan trong nước, aceton, ether, cloroform, ether dầu hỏa, benzen. - Điểm chảy: 210 0 C kèm theo phân hủy. - Phổ hấp thụ tử ngoại của rutin trong ethanol có cực đại hấp thụ ở bước sóng 259 ± 1nm và 362,5 ± 1; trong methanol là 359 nm. - Rutin có cấu trúc là một glycosid nên rất dễ bị thủy phân bởi enzym có trong dược liệu là rhamnodistase hoặc môi trường acid, nhiệt độ cao, dung dịch kiềm đặc ở nhiệt độ cao [3]. - Tác dụng với FeCl 3 cho màu xanh lục [5]. - Tác dụng với H 2 SO 4 đậm đặc: Acid H 2 SO 4 nhỏ lên rutin cho màu vàng đậm [2].  Định tính - Đo phổ IR của chế phẩm, so sánh với phổ IR của rutin chuẩn. - Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 250,0 ml với cùng dung môi, lọc nếu cần. Pha loãng 5,0 ml dung dịch này thành 50,0 ml bằng methanol . Đo phổ hấp thụ tử ngoại trong khoảng từ 210 nm đến 450nm, dung dịch phải cho hai cực đại hấp thụ ở 257nm và 358 nm. Độ hấp thụ riêng ở bước sóng cực đại 358 nm phải đạt từ 305 đến 330, tí nh theo chế phẩm khan. - Phương pháp sắc kí lớp mỏng + Bản mỏng: Silica gel G + Dung môi khai triển: N-butanol/acid acetic khan/nước/methyl ethyl ceton/ethyl acetat = 5/10/10/30/50). + Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg chế phẩm trong 10,0 ml methanol. + Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 25 mg rutin chuẩn 10,0 ml methanol. 4 [...]... dung nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng quy trình bán tổng hợp troxerutin từ rutin - Thực hiện phản ứng bán tổng hợp troxerutin từ rutin với 2 tác nhân là ethylen oxyd và ethylen clorohydrin - Khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp troxerutin: + Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng + Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng + Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ mol rutin/ EO... tỉ lệ mol rutin/ EO (EC) đến hiệu suất phản ứng - Đưa ra quy trình bán tổng hợp troxerutin 2.3.2 Kiểm nghiệm troxerutin Tiến hành kiểm nghiệm hàm lượng troxerutin theo chuyên luận troxerutin của Dược điển Anh 2010 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp tổng hợp hóa học - Sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học để tổng hợp ra troxerutin dựa trên nguyên tắc của phản ứng O-alkyl hóa - Sử dụng các phương... của troxerutin trên chuột và độc tính của troxerutin trên dòng tế bào V79 Kết quả của nghiên cứu cho thấy: + Troxerutin không có khả năng gây độc rõ ràng ở nồng độ dưới 20mg/ml + Troxerutin có tác dụng chống tia phóng xạ do troxerutin làm tăng đáng kể tỉ lệ sống sót sau 30 ngày bị chiếu xạ (tia gamma) ở chuột nghiên cứu [41] - Cũng trong năm 2011, Jun Lu đã tiến hành nghiên cứu tác dụng của troxerutin. .. nang Troxerutine (Pháp) EMD Chemicals Kem bôi da Inc Troxerutin 20mg Chema Elektromet Gel Troxerutin Chengdu PingYuan Medicine Co.,Ltd Ratiopharm Medikamente zum Schutz der Gefäße Syntenda SP Z O.O P.F.-CH Hanlim Pharm Co., Ltd (Hàn Quốc) BalkanpharmaRazgrad AD – Bungari Rotapharm Troxerutin 300 mg Troxerutin 200 mg Troxerutin (500 mg/10ml) Troxerutin 300mg Troxerutin Carbazochrom Coumarin Troxerutin. .. ngoại ở bước sóng 350 nm + So sánh với giá trị A11 = 250 Xác định được hàm lượng mẫu thử - Yêu cầu: Chế phẩm chứa 95–105 % troxerutin tính theo chế phẩm đã làm khô [17] 24 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU   3.1 Nghiên cứu quy trình bán tổng hợp troxerutin 3.1.1 Tiến hành bán tổng hợp troxerutin với tác nhân alkyl hóa là ethylen clorohydrin trên cơ sở phương pháp của Stevens - Phương trình phản ứng +HO-CH2-CH2... trình bày trong bảng 1.2 Bảng 1.2 Một số biệt dược có chứa troxerutin trên thế giới Stt 1 Tên Thuốc Flebotrat 2 Ginkor fort 3 Ronacare troxerutin Troxerutin 4 5 6 7 8 9 Troxerutin injection Troxerutin ratiopharm 300 mg Troxerutin 200mg Troxeti Eye drop Troxevasin 10 Troxivenol 11 Venalot SR 12 Venoruton Thành phần Công ty sản xuất Coumarin Troxerutin Neckerman Industria Farmaceutica Dạng bào chế Viên... giờ - Kết thúc phản ứng: Hỗn hợp phản ứng được tiến hành xử lí như trong mục 3.1.1.1 - Kết quả khảo sát phản ứng bán tổng hợp troxerutin với các tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng khác nhau được trình bày trong bảng 3.3 28 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol EC /rutin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin T0nc Stt Rutin (gam) EC (ml) Tỉ lệ EC /rutin Khối lượng sản phẩm (g)... học Trung Quốc đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh của troxerutin Kết quả cho thấy troxerutin có khả năng cải thiện nhận thức và có tác dụng bảo vệ thần kinh [23] - Theo nghiên cứu của F Squadrito cùng đồng sự thì sự kết hợp 150 mg troxerutin và 1,5 mg carbazochrom cho hiệu quả điều trị tốt và an toàn ở những bệnh nhân mắc trĩ [34] - Năm 2011, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu về tác dụng... cholesterol ở chuột Trong nghiên cứu này, tác giả đánh giá hiệu quả của troxerutin đối với hiện tượng suy giảm nhận thức do sự kháng insulin ở não chuột thực nghiệm Kết quả thu được từ nghiên cứu cho thấy troxerutin có khả năng phòng ngừa và điều trị bệnh suy giảm nhận thức do đái tháo đường typ 2 và bệnh Alzheimer [26] - Năm 2013, nghiên cứu của các nhà khoa học Ấn Độ cho thấy rằng troxerutin có khả năng... kể Từ các kết quả khảo sát trên, kết hợp kiểm tra sản phẩm bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi n-butanol/methanol/nước (10/1/3) chúng tôi lựa chọn tỉ lệ mol EC /rutin là 4/1 để thực hiện phản ứng bán tổng hợp troxerutin 3.1.1.4 Khảo sát một số phương pháp tinh chế sản phẩm Sau khi đã lựa chọn được các điều kiện tối ưu cho phản ứng bán tổng hợp troxerutin, chúng tôi tiến hành khảo sát một . Nghiên cứu bán tổng hợp troxerutin từ rutin với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng được quy trình bán tổng hợp troxerutin từ rutin ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Bán tổng hợp được t roxerutin đạt tiêu. giới. Chính vì vậy, việc nghiên cứu bán tổng hợp các hoạt chất có tác dụng điều trị tốt như troxerutin hiện đang rất được quan tâm. Troxerutin được bán tổng hợp từ rutin với tác nhân alkyl. PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Nguyên liệu 20 2.2. Thiết bị và dụng cụ 21 2.3. Nội dung nghiên cứu 22 2.3.1. Xây dựng quy trình bán tổng hợp troxerutin từ rutin 22 2.3.2. Kiểm nghiệm troxerutin