HPLC là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao [1]. Phép thử xác định thành phần troxerutin sử dụng sắc kí phân bố
pha đảo (cột dùng là C18).
Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha này là một chất lỏng
được cho qua cột C18 một cách liên tục. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số
phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động [1, 2]. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phép phân tích xác định thành phần troxerutin .
- Troxerutin đối chiếu có chứa 82,41% tri-hydroxyethyl [phụ lục 28].
- Kết quả chạy sắc kí đồ của mẫu T9(EO), T1(EC)cho thấy có sự tương đồng về
thời gian lưu của các pic trong mẫu thử với thời gian lưu của các pic trong mẫu đối chiếu. Điều này cho phép sơ bộ xác định T9, T1 là troxerutin có tỉ lệ
các dẫn chất mono, bis, tri, tetra(hydroxyethyl)rutin khác nhau; trong đó ở sắc kí đồ của T9 không có sự xuất hiện của pic mono(hydroxyethyl) rutin.
Mẫu Thời gian lưu (phút) Tetra(hydroxy ethyl) rutin Mono(hydroxy ethyl) rutin Tri(hydroxyl ethyl) rutin Bis(hydroxy ethyl) rutin Troxerutin đối chiếu 15,034 23,898 32,738 34,678 T1 15,003 23,793 32,708 34,563 T9 15,148 32,908 34,670
- Về tỉ lệ các thành phần có trong hỗn hợp cũng được báo cáo trong sắc kí đồ, cụ thể như sau:
Mẫu Diện tích pic (tỉ lệ %) tetra(hydroxy ethyl) rutin mono(hydroxy ethyl) rutin tri(hydroxyl ethyl) rutin bis(hydroxy ethyl) rutin Tổng T1 1497550 (9,38%) 111757 (0,69%) 13885071 (86,97%) 470978 (2,95%) 15965356 T9 222459 (1,11%) 19347338 (97,25%) 323817 (1,64%) 19893614 Từ kết quả chạy HPLC cho thấy ở mẫu T9 thành phần chính tri(hydroxyethyl)rutosid chiếm 97,25%, ở mẫu T1 tỉ lệ này là 86,97%. Kết quả này cho thấy sản phẩm tổng hợp được từ quy trình với tác nhân EC và EO
đều đạt đạt tiêu chuẩn về tỉ lệ các thành phần theo Dược điển Anh 2010. Trong một số nghiên cứu trước đây thì tỉ lệ này là 88% [20] và 99,84% [22].
Sản phẩm T9 cũng đã được tiến hành kiểm nghiệm xác định thành phần các dẫn chất tại Trung tâm kiểm nghiệm nghiên cứu dược – Cục Quân Y – Việt Nam. Kết quả cho thấy T9 có pic chính chiếm 97,58 % (phụ lục 25).
Từ các kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng sản phẩm T9 (với tỉ lệ pic chính chiếm 97,58%, nhiệt độ nóng chảy 180-1810C) đủ điều kiện đo phổ để
xác định cấu trúc sản phẩm.
4.3. Về xác định cấu trúc sản phẩm chính
4.3.1. Về phổ hồng ngoại
Phổ IR của T9 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức ở max3474 cm-1 (OH) và 1651 cm-1 (C=O). Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất thì các dữ liệu của phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ
hạt nhân mới thực sự có ý nghĩa quyết định.
4.3.2. Về phổ khối lượng
Phổ khối lượng đóng vai trò quan trọng việc xác định khối lượng phân tử các chất tổng hợp và thường là loại phổ được lựa chọn đo đầu tiên để kiểm chứng xem sản phẩm phản ứng được tạo thành có là chất dự kiến hay không.
Tùy theo chế độ đo, trên phổ đồ của T9 xuất hiện pic ion có số khối bằng [M+H]+ (chế độ ESI (+)) hoặc [M-H]- (chế độ ESI (-)). Pic ion phân tử
của các hợp chất hữu cơ nói chung không phải là vạch riêng lẻ mà là một cụm pic vì các nguyên tố chứa trong hợp chất đều tồn tại các đồng vị khác nhau. Bởi vậy, bên cạnh vạch chính ứng với pic ion phân tử M+ còn có các vạch [M+1]+, [M+2]+,... với cường độ phù hợp quy tắc đa thức đồng vị [28].
Chất T9 có công thức phân tử dự kiến là C33H42O19. tương ứng với số
khối 742,67. Trên phổ đồ ESI-MS negative xuất hiện pic ion [M-H]- cường độ
lớn nhất có số khối 741,10 (hình 4.2), phổ ESI-MS positive xuất hiện pic ion [M+H]+ cường độ lớn nhất có số khối 743,14. Như vậy, sơ bộ cho thấy chất T9 có số khối đúng như số khối dự kiến. Pic M Pic M - 1 Pic M+ 1 Hình 4.1.Phổ ESI-MS negative của chất T9
Trên phổ ESI-MS positive còn cho pic ion ở m/z 597 [M-rhamnose + H]+ và pic ion ở m/z 435 [M-glucose-rhamnose + H]+.
4.3.3. Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thông số đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1 chiều và 2 chiều NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu phân tích.
Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất được trình bày trong mục 3.1.3.3 và phổ đồ trong phần phụ lục. Sau đây là một số bàn luận dựa trên số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của T9.
Phổ 13C-NMR và DEPT của T9 rất giống với tiền chất rutin, chỉ khác là thấy xuất hiện thêm 6 nhóm metylen gắn với oxy nằm trong khoảng C 59,3- 70,4. Ngoài ra trên phổ 13C-NMR còn có tín hiệu của 1 nhóm cacbonyl ở C177,5(C-4); 5 nhóm metin vòng thơm ở C122,4 (C-6’); 114,5 (C-2’); 112,8 (C-5’); 98,4 (C-6) và 92,9 (C-8); 1 nhóm metylen gắn với oxy ở C 67,2 (C- 6’’); 1 nhóm metyl ở C 17,7 (CH3-6’’’); 10 nhóm metin sp3 và 9 cacbon bậc 4.
C4 C6’ C2’ C5’ C6 C8 C7 C5 C2 C5’ C8 C2’ Hình 4.2. Phổ 13C-NMR và DEPT của T9 60
Phổ 1H-NMR của T9 cũng cho thấy nhiều hơn phổ 1H-NMR của rutin 6 nhóm metylen gắn với oxy nằm trong khoảng H 3,75-4,11.
CH2 A CH 2 A’ + CH 2 A’’ CH 2 B + CH 2 B’ + CH 2 B’’ + H-6’’a Hình 4.3.Phổ1H-NMR giãn rộng vùng từ 3,04 – 4,96 ppm của T9 Cũng giống như rutin, trên phổ 1H-NMR của T9 xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm OH ởH 12,50 đặc trưng cho liên kết cầu hydro nội phân tử ở vị trí C- 5, 3 proton vòng thơm tương tác kiểu ABX ở H 7,84 (1H, br s, H-2’); 7,69 (1H, dd, J=1,5; 8,5 Hz, H-6’); 7,12 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5’) và 2 proton vòng thơm tương tác dạng meta ở H 6,72 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8); 6,37 (1H, d,
J=2,0 Hz, H-6). Ngoài ra còn có tín hiệu của 2 proton anomeric thuộc 2
đường glucose và rhamnose ở H 5,42 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1’’) và 4,40 (1H, br s, H-1’’’), tín hiệu của 1 nhóm metyl thuộc đường rhamnose ở H 0,96 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 - 6’’’) và tín hiệu của 8 nhóm metin, 1 nhóm metylen của 2
đường nằm trong khoảng H 3,06 - 4,40. Dựa vào các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất T9 đã có gắn 3 nhóm hydroxyethyl.
H6’ H2’ H5’ H8 H1’’ H6 Hình 4.4. Phổ1H-NMR giãn rộng vùng từ 5,11 – 7,84 ppm của T9
Trên phổ COSY phần đường cho thấy hệ tương tác của một đơn vị đường glucose H-1’’/H-2’’/H3’’/H-4’’/H-5’’/ CH2-6’’ và một đơn vị đường rhamnose H-1’’’/H-2’’’/H3’’’/H-4’’’/H-5’’’/ CH3-6’’’. Đồng thời tương tác giữa các nhóm metylen CH2-A/CH2-B, CH2-A’/CH2-B’ và CH2-A’’/CH2-B’’ cũng được quan sát thấy trên phổ COSY.
Hình 4.5.Phổ COSY giãn rộng của T9
Giống như tiền chất rutin, đường glucose gắn với khung flavonoit ở vị
trí C - 3 và đường rhamnose gắn với glucose ở vị trí C - 6’’ được xác định dựa vào tương tác xa trên phổ HMBC: proton H-1’’ tương tác với C- 3, C-2’’, C- 3’’; proton H-1’’’ tương tác với C-6’’ và CH2-6’’ với C-1’’’.
Hình 4.6.Phổ HMBC của T9
Hình 4.7.Một số tương tác chính trên phổ COSY ( ) và HMBC () của T9
Kết hợp các dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, và so sánh với tài liệu tham khảo [42,22] cho phép xác định chất T9 chính là 2-[3,4-bis(2-hydroxyethoxy) phenyl]-5-hydroxy-7-(2- hydroxyethoxy)-4-oxo-4H-chromen-3-yl 6-O-(6-deoxy-β-D-mannopyranosyl) -β-D-glucopyranoside.
4.4. Về xác định hàm lượng troxerutin
Hàm lượng troxerutin có trong mẫu thử T1 và T9 được xác định theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 350 nm [17].
Kết quả đo được tổng hợp trong bảng 3.10 và bảng 3.11 cho thấy sản phẩm T1 và T9 có hàm lượng troxerutin tính theo chế phẩm đã làm khô nằm trong tiêu chuẩn cho phép (95 - 105%) của Dược điển Anh 2010.
Mẫu T1 và T9 cũng đã được kiểm nghiệm để xác định hàm lượng troxerutin tại Trung tâm kiểm nghiệm nghiên cứu dược – Cục Quân Y – Việt Nam, kết quả cho thấy T1 đạt 98,8%, T9 đạt 96,7% hàm lượng troxerutin [phụ lục 26, 27].
65
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
1. KẾT LUẬN
Về xây dựng quy trình bán tổng hợp troxerutin
Đã xây dựng được quy trình bán tổng hợp troxerutin từ rutin với 2 tác nhân alkyl hóa là EO và EC ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Bán tổng hợp troxerutin với tác nhân EO theo quy trình xây dựng: Từ 6,10g rutin ban đầu, qua quy trình bán tổng hợp đã thu được 3,49 gam T9, là dạng bột mịn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 180-1810C, thành phần chính tris(hydroxyethyl)rutosid chiếm 97,58%; kết quả biện giải phổ cho phép xác
định T9 chính là tris(hydroxyethyl)rutin.
- Bán tổng hợp troxerutin với tác nhân EO theo quy trình xây dựng: Từ 6,10g rutin ban đầu, qua quy trình bán tổng hợp đã thu được 5,34 gam T1, là dạng bột mịn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 156-1580C. Kết quả chạy HPLC cho phép sơ bộ khẳng định T1 là troxerutin với tỉ lệ các thành phần đạt tiêu chuẩn BP 2010(pic chính tris(hydroxyethyl)rutosid: 86,97 %)
Quy trình BTH troxerutin với tác nhân EC dễ dàng thực hiện hơn so với quy trình BTH từ tác nhân EO. Tuy nhiên, sản phẩm thu được từ quy trình BTH troxerutin với tác nhân EO có tỉ lệ tri(hydroxyethyl) rutin cao hơn.
Vềđịnh lương sản phẩm troxerutin thu được
Sản phẩm thu được có hàm lượng troxerutin trong T1 đạt 98,8%, T9
đạt 96,7% - đạt tiêu chuẩn hàm lượng theo Dược điển Anh 2010.
2. ĐỀ XUẤT
- Nghiên cứu các phương pháp tinh chế để sản phẩm thu được đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2010.
- Tiếp tục nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bán tổng hợp troxerutin ở quy mô bán pilot và pilot.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Trần Tử An (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản y học, tr 84-110.
2. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hóa phân tích II, Nhà xuất bản y học, tr 123.
3. Đoàn Thị Bình (2009), Nghiên cứu chiết xuất Rutin từ hoa hòe bằng
phương pháp siêu âm, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩđại học khóa 2004-
2009, tr 8.
4. Bộ môn Công nghiêp Dược (2009), Thực tập kỹ thuật sản xuất Dược phẩm, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 62.
5. Bộ môn Dược liệu (2006), Bài giảng dược liệu I, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 290-293, 261.
6. Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam III (3)
7. Bộ Y Tế, Dược điển Việt Nam IV, tr 555-557.
8. Nguyễn Thị Xuân Hiếu (2009), Nghiên cứu tổng hợp troxerutin, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩđại học khóa 2004 -2009, Trường Đại học Dược Hà Nội.
9. Hội tim mạch học Việt Nam (2010), Khuyến cáo 2010 về các bệnh lý
tim mạch & chuyển hóa, NXB Y học chi nhánh TP. Hồ Chí Minh, tr 9.
10. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 298-299.
11. Vũ Thị Thúy (2005), Lựa chọn một số thông số trong quy trình chiết
xuất rutin từ hoa hòe, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩđại học khóa 2000-
12. Trần Lê Thùy Vân (2010), Đánh giá kết quả điều trị bệnh tắc tĩnh
mạch trung tâm võng mạc tại bệnh viện mắt trung ương trong 5 năm,
Luận văn Thạc Sỹ Y học, Trường Đại Học Y Hà Nội.
13. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam,
NXB Khoa học kỹ thuật, Tập 1, tr 971- 972.
TIẾNG ANH
14. Adam B.S. et al (2005), “Troxerutin protects the isolate perfused rat liver from a possible lipid peroxidation by coumarin”, Phytomedicine, 12 (1-2), p. 52-61.
15. American Chemistry Council (2007), Product stewardship guldance manual- Ethylene oxide.
16. Boccalon H. et al (1997), “Characteristics of chronic venous insufficiency in 895 patiens followed in general practice”, Int
Angiology, 16(4), p. 226-234.
17. British Pharmacopoeia (2010), vol 2, p. 2169.
18. Courbat P. J et al (1969), “Quercertin and quercertin glycoside”,
United States Patent Office, 3420815.
19. De carvalho Levy Rebelo F. et al (2005), “The production of tri - hydroxyethylrutin (troxerutin) in a pilot plant”, 2nd Mercosur Congress
on Chemical Engineering, p.1-9.
20. Estanove C. et al (2005), “Troxerutin with a high content of trihydroxyethylrutoside and process for its preparation”, US 6,855,697 B1.
21. Frantisek Czech et al (1982), “Mixture of O-hydroxyethylated rutin derivative”, CS, 225440.
22. Jian-Dong Xu et al (2013), “Synthesis and antioxidant activities of flavonoids derivative, troxerutin and 3’,4’,7’-triacetoethoxyquercetin”,
Chinese Chemical Letters, 24, p. 223-226.
23. Jun Lu et al (2010), “NGF-Dependent Activation of TrkA Pathway: A Mechanism for the Neuroprotective Effect of Troxerutin in D- Galactose-Treated Mice”, Brain Pathology, 20, p. 952-965.
24. Jun Lu et al (2012), “Troxerutin Counteracts Domoic acid- Induced Memory Deficits in Mice by inhibiting CCAAT/ Enhancer Binding Protein β- Mediated Inflammatory Response and Oxidative Stress”, The
Journal of Immunology 1202862.
25. Leelavinothan Pari, Perumal Elangovan (2013), “Troxerutin protects nickel-induced alterations in lipids and plasma lipoprotein in rats”,
International Journal of Basic and Life Sciences, 1, p. 39-49.
26. Lu. J et al (2011), “Troxerutin protects against high cholesterol- induced cognitive deficits in mice” Brain - Oxford Journals, 134(3), p.783-797.
27. Marzin D. et al (1987), “Study of mutagenic activity of troxerutin, a flavonoid derivative”, Toxicol Letter, 32 (2-3), p. 297-305.
28. Mc Lafferty F.W., Turecek F. (1993), Interpretation of mass spectra, University science books, 4th edition, USA.
29. Merck & Co.Inc. (2006), The Merck index, published by Merck & Co. Inc., 14th edition.
30. New Jersey Department of Health and Senior Services (1999), Ethylen
chlorohydrin, New Jersey.
31. NIOSH Chemical Listing and Documentation of Revised IDLH Values (1994), Documentation for Immediately Dangerous to Life or Health Concentrations (IDLH).
32. Shao-hua Fan et al (2009), “Troxerutin protects the mouse kidney from d-galactose-cause injury through anti-inflammation and anti – oxidation”, International imhumopharmacology, 9, p.91-96.
33. Siegers C.P. et al (2008), “ Aescin and troxerutin as a successful combination for the treatment of inner ear perfusion disturbances”,
Phytomedicine, 15(3), p. 160-163.
34. Squadrito F. et al (2000), “Double-blind, randomized clinical trial of troxerutin-carbazochrome inpatients with hemorrhoids”, European
Review for Medical and Pharmacological Science, 4, p.21-24.
35. Stevens A. et al (1958), “ A tri- (Hydroxyethyl) Ether of rutin and process for the production thereof”, GB, 833174.
36. Universitaire Pers Maastricht (2011), The antioxidant flavonoid 7-
mono- O- (β-hydroxyethyl)-rutoside, from clinic to concept, Maastricht
- Dutch.
37. US Environmental ProtectionAgency (2008), Acute exposure
guideline levels – Ethylene chlorohydrin (2- chloroethanol), USA.
38. USA Occupational Safety and Health Administration (2002),
Ethylenoxyd, OSHA fact sheet.
39. USA Occupational Safety and Health Administration (2013), Ethylen
chlorohydrin- OSHA 07, OSHA fact sheet.
40. Vladimir Czech et al (1982), “Isolation of O-β-hydroxyethyl rutosids”, CS, 199923.
41. Xu Ping et al (2011), “Radioprotective Effects of Troxerutin against Gamma Irradiation in V79 Cells and Mice”, Asian Pacific J Cancer
Prev, 12, p. 2593-2596.
42. Yong Mei Xiao et al (2010), “Regioselective enzymatic acylation of troxerutin in nonaqueous medium”, Chinese Chemical Letters, 21, p. 59-62.
PHỤ LỤC Phụ lục 1 Phổ IR của T9 Phụ lục 2 Phổ ESI-MS negative của T9 Phụ lục 3 Phổ ESI-MS positive của T9 Phụ lục 4 Phổ 1H-NMR của T9 Phụ lục 5 Phổ 1H-NMR giãn rộng của T9 Phụ lục 6 Phổ 1H-NMR giãn rộng của T9 Phụ lục 7 Phổ 13C-NMR của T9 Phụ lục 8 Phổ 13C-NMR giãn rộng của T9 Phụ lục 9 Phổ 13C-NMR giãn rộng của T9 Phụ lục 10 Phổ DEPT của T9 Phụ lục 11 Phổ DEPT giãn rộng của T9 Phụ lục 12 Phổ COSY của T9 Phụ lục 13 Phổ COSY giãn rộng của T9 Phụ lục 14 Phổ COSY giãn rộng của T9 Phụ lục 15 Phổ COSY giãn rộng của T9 Phụ lục 16 Phổ HSQC của T9