Như đã trình bày ở trên, vấn đề nhiệt độ có liên quan lớn đến hiệu suất phản ứng. Nhiệt phản ứng sinh ra do 3 phản ứng: phản ứng giữa L-CHM với NaOH, MCA với NaOH và bản thân phản ứng S-alkyl hóa. Ở qui mô nhỏ, có thể kiểm soát nhiệt độ bằng cách kiểm soát tốc độ nhỏ giọt NaOH. Vì thế quá trình cũng tiêu tốn nhiều đá làm lạnh và thời gian (khoảng 2,5h phản ứng đối
49
với qui mô 100 g/mẻ). Điều này gây khó khăn khi tiến hành trên qui mô lớn (5 kg/mẻ, 10 kg/mẻ). Ở qui mô này chúng tôi đã tiến hành kiểm soát nhiệt độ bằng cách tạo muối natri của các nguyên liệu trước khi tiến hành phản ứng S- alkyl hóa. Bằng cách này chúng tôi đã hạn chế được nhiệt sinh ra do phản ứng giữa L-CHM với NaOH và MCA với NaOH.
Đầu tiên, L-CHM sẽ phản ứng trước với NaOH 40% và hòa tan vào dung dịch trong bình phản ứng. Ở giai đoạn này cần sục khí N2 liên tục và làm lạnh bằng đá để nhiệt độ không quá 450C nhằm hạn chế sự oxy hóa L- CHM.
Tạo muối Natri monocloroacetat: trộn tỷ lệ đồng lượng mol giữa MCA và Na2CO3 trong nước cất. Thao tác tạo muối giữa MCA với Na2CO3 cũng đỡ gây nguy hiểm hơn (bỏng do acid MCA) so với việc nạp trực tiếp MCA vào bình phản ứng S-alkyl hóa.
Nạp MCA.Na vào trong bình phản ứng để tiến hành phản ứng S-alkyl hóa, nhiệt độ được kiểm soát dưới 450C.
Tinh chế MCA: acid sử dụng trong qui mô lớn là loại acid công nghiệp nên hàm lượng tạp khá lớn, đặc biệt là tạp kim loại. Vì thế MCA cần phải được tinh chế trước khi tiến hành phản ứng.
4.2. Về phương pháp tinh chế
Carbocistein là chất ít tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng. Vì vậy có thể tinh chế khá đơn giản là hòa tan CMC trong nước nóng, sau đó làm lạnh thu lấy tủa. Phương pháp này cho hiệu suất khá, đơn giản và thân thiện với môi trường do không sử dụng hóa chất, sản phẩm tinh thể trắng, đẹp, lóng lánh. Tuy nhiên, khi triển khai với quy mô lớn, cần thiết bị cồng kềnh do thể tích sử dụng lớn (khoảng 25 L nước cho 1 kg CMC thô, hay 137,5 L/mẻ quy mô 5 kg) và tốn nhiều năng lượng để đun sôi. Quá trình tinh chế bằng phương pháp kết tủa (phương pháp 2,3) cho thấy nhiều ưu điểm hơn
50
tinh chế bằng nước: L-cystin là 1 aminoacid tan tốt ở pH 2-3. Vì thế khi chỉnh pH dung dịch về 2,8 để kết tủa sản phẩm, có thể loại được L-cystin dễ dàng. Đồng thời tại pH này, CMC không tồn tại ở dạng muối hydroclorid mà tồn tại dưới dạng muối nội phân tử.
Phương pháp kết tủa sử dụng NaOH (phương pháp 2) so với phương pháp kết tủa từ môi trường kiềm (phương pháp 3) khác nhau về thứ tự hòa tan và kết tủa lại. Phương pháp 2 cho sản phẩm ở dạng bột tinh thể kết tinh đẹp, xốp nhưng cho hiệu suất không cao, thời gian kết tinh dài. Chúng tôi lựa chọn phương pháp tinh chế 3 - cho hiệu suất cao nhất, thời gian kết tủa ngắn và sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng dược điển.
4.3. Về khẳng định cấu trúc
4.3.1. Về phổ hồng ngoại
Phân tích phổ hồng ngoại cho phép phân tích được các dải hấp phụ đặc trưng của dao động hóa trị và dao động biến dạng của các nhóm chức và các liên kết điển hình trong cấu trúc phân tử của chất được ghi phổ.
Phổ đồ của CMC cho thấy phân tử CMC tồn tại ở dạng ion lưỡng cực nên có các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm NH3
+
(3039, 2723, 2639 cm-1) và nhóm COO- carboxylat (1685 cm-1). Nhóm COOH còn lại cho dải hấp thụ tại 1736 cm-1 (C=O acid).
4.3.2. Về phổ khối lượng
CMC có khối lượng phân tử là 179,2 đvC. Kết quả phân tích phổ khối lượng của CMC cho thấy có pic phân tử có số khối phù hợp với khối lượng phân tử của chất (m/z = 177,9 ([M-H]-) và m/z = 180,0 ([M+H]+)).
4.3.3. Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho phép nhận biết được các dạng proton và số lượng proton của từng chất tạo thành.
51
Phổ đồ của sản phẩm cho thấy bộ tín hiệu đặc trưng của hệ chứa carbon bất đối dạng: -CH-CH2- tại : 3,0 (1H); 3,11 (1H); 3,86 (1H) với các hằng số tương tác spin – spin của các doublet doublet đặc trưng (4,0 Hz; 8,5 Hz và 15,0 Hz). Proton ứng với nhóm –CH2-S cho tín hiệu tại 3,27 ppm. Không quan sát thấy proton của NH2 và các nhóm COOH là do có sự trạo đổi các hydro này với dung môi đo phổ D2O.
4.3.4. Về phổ cộng hưởng từ carbon 13
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C cho phép nhận biết các dạng carbon và số lượng carbon trong chất tạo thành
Phổ 13C-NMR cho thấy các tín hiệu phù hợp với khung carbon của CMC, trong đó C=O acid có độ chuyển dịch hóa học là 177,63 ppm cao hơn C=O carboxylat (172,99 ppm).
Từ kết quả phân tích các phổ đồ ở trên, chúng tôi kết luận: sản phẩm tổng hợp được là carbocistein.
4.4. Về theo dõi độ ổn định
Kết quả theo dõi độ ổn định của carbocistein cho thấy, trong điều kiện thường và điều kiện lão hóa cấp tốc nguyên liệu đều ổn định và đạt yêu cầu về hàm lượng theo tiêu chuẩn dược điển Anh BP 2013.
Dữ liệu hàm lượng trong điều kiện dài hạn và cấp tốc ít biến đổi, ít dao động theo thời gian. Sản phẩm carbocistein giữ được các chỉ tiêu chất lượng trong suốt thời gian nghiên cứu 12 tháng (hàm lượng giảm khoảng 0,5% so với ban đầu). Vì thế có thể kết luận rằng sản phẩm đạt yêu cầu về độ ổn định trong 12 tháng. Sau đó, cần tiếp tục tiến hành thêm các nghiên cứu theo dõi độ ổn định trong điều kiện thường từ tháng 12 để xác định rõ ràng về tuổi thọ của sản phẩm.
52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã xây dựng được qui trình bán tổng hợp carbocistein qui mô 10 kg/mẻ từ nguyên liệu L-cystein hydroclorid monohydrat. Sản phẩm đã được khẳng định cấu trúc qua kết quả phân tích SKLM và phổ IR, MS, 1
H-NMR, 13C-NMR. 2. Nghiên cứu được phương pháp tinh chế sản phẩm đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh BP 2013. Hiệu suất tinh chế trung bình đạt trên 95% và hiệu suất toàn quy trình trung bình đạt trên 86%.
Kiến nghị
Với các kết quả đạt được chúng tôi hy vọng đã góp phần vào việc nghiên cứu qui trình tổng hợp carbocistein có hiệu quả, đơn giản, phù hợp với điều kiện sản xuất ở Việt Nam, nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp Dược nước nhà. Để tiếp tục phát triển những thành quả đạt được, chúng tôi có đề xuất như sau:
- Áp dụng qui trình để đưa vào sản xuất - Nghiên cứu phương pháp cải thiện hiệu suất
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Mạnh Bình, Nguyễn Quang Đạt (2007), Hóa học hữu cơ tập I, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 112-130.
2. Bộ Y Tế (2009), Các bệnh đường hô hấp, tr. 90-94.
3. Bộ Y Tế (2009), Hóa học hữu cơ, Tập II, Nhà xuất bản Y học, tr. 203-211. 4. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ
nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, tr. 27-29, 296- 320.
5. Dương Văn Khoa ( 2014), Nghiên cứu bán tổng hợp carbocystein qui mô 1,0 kg/mẻ, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
6. N. D Luyện., Đ. N. S. Huyền, C. V. Thu , T. M. Koongs, Đ. T. T. Hải, N. V. Hân, Đ. T. Xuân, L. T. T. Hòa và cs (2011), Nghiên cứu chiết tách L-cystin từ tóc, phụ phẩm móng, sừng, lông gia súc và bán tổng hợp N-acetyl-L- cystein làm nguyên liệu sản xuất thuốc, Báo cáo khoa học cấp Nhà nước- Chương trình Hóa dược, Bộ Công thương.
7. Nguyễn Đình Triệu (2005), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý tập II, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 61-204.
Tiếng Anh
8. Armstrong M. D., Lewis J. D. (1951), "Growth experiments with thioether derivatives of cysteine and homocysteine", Journal of Biological Chemistry, 189(1), pp. 461-466.
9. Asti C., Melillo G., Caselli G.F., Daffonchio L., Clavenna G., Omini C., Hernandez A. (1995), "Effectiveness of carbocysteine lysine salt monohydrate on models of airway inflammation and hyperresponsiveness",
Pharmacological research, 31(6), pp. 387-392.
10. Braga P. C., Borsa M. , al et (1982), "Pharmacokinetic behaviour of S- carbocysteine-lys in patient with chronic bronchitis", Clin Ther 1982, 4, pp. 480-488.
11. Brown D. T. (1988), "Carbocysteine", Drug intelligence & clinical pharmacy, 22(7-8), pp. 603-608.
12. Decramer M., Janssens W. (2010), "Mucoactive therapy in COPD", Eur. Respir. Rev. , 19(116), pp. 134-140.
13. Decramer M., Janssens W. (2010), "Mucoactive therapy in COPD",
European Respiratory Review, 19(116), pp. 134-140.
14. Earl P., Max T. (1949), "Processes for preparing substituted propanoic acid",
US Patent 2460785.
15. González G. J., García G. V., Montiel L. V., et al (1998), "Industrial synthesis of cysteine derivatives", European Research Conference: Organic Electrochemistry: Moving towards Clean and Selective Synthesis.
16. Goodman L., Ross L. O., Baker B.R. (1958), "Potential Anticancer Agents. V. Some Sulfur-Substituted Derivatives of Cysteine", The Journal of Organic Chemistry, 23(9), pp. 1251-1257.
17. Hooper C., Calvert J. (2008), "The role for S-carboxymethylcysteine (carbocisteine) in the management of chronic obstructive pulmonary disease", International journal of chronic obstructive pulmonary disease, 3(4), pp. 659-669.
18. Inc Merck and Co., The Merck Index. 2001: USA.
19. Ishibashi Y., Imai S., Inouye Y., et al (2006), "Effects of carbocisteine on sialyl-Lewis x expression in an airway carcinoma cell line stimulated with tumor necrosis factor-α", European journal of pharmacology, 530(3), pp. 223-228.
20. Ishibashi Y., Kobayashi F., Idesawa A., et al (2004), "Effects of carbocisteine on altered activities of glycosidase and glycosyltransferase and expression of Muc5ac in SO2-exposed rats", European journal of pharmacology, 487(1), pp. 7-15.
21. Ishiwata K. I., Nakamura T., Shimada M., et al (1989), "Production of S- (carboxymethyl)-l-cysteine from l-serine with tryptophan synthase", Journal of fermentation and bioengineering, 68(2), pp. 84-87.
22. Macciò A., Madeddu C., Panzone F., Mantovani G. (2009), "Carbocysteine: clinical experience and new perspectives in the treatment of chronic inflammatory diseases", Expert opin. Pharmacother, 10(4), pp. 693-703. 23. Maierhofer A., Wagner H. (1978), "Process for the production of high purity
S-carboxymethyl-L-cysteine", The Unites States Patent Office.
24. Maurice L., Saint G. L., Michel L., et al (1967), "Nail strengthener containing S-carbocystein-methyl-cystein and salts thereof", The Unites States Patent Office.
25. Michaelis L., Schubert M. P. (1934), "The reaction of iodoacetic acid on mercaptans and amines", Journal of Biological Chemistry, 106(1), pp. 331- 341.
26. Nakayasu K., Tanaka J. (1984), "Process for producing S- carboxymethylcysteine", United Kingdom Patent 2140009-A.
27. Pinamonti S., Venturoli L., Leis M., Chicca M., Barbieri A., Sostero S., Ravenna F., Daffonchio L., Novellini R., Ciaccia A. (2001), "Antioxidant activity of carbocysteine lysine salt monohydrate", Panminerva medica, 43(3), pp. 215-220.
28. Sanjay b., Dinesh S., Neha S. (2012), "Stability Testing of Pharmaceutical Products", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 02(03), pp. 129-138. 29. The Bristish Pharmacopoeia Commission Bristish Pharmacopoeia, the
edition on CD-rom, Editor. 2007.
30. Waring R.H., Mitchell S.C. (1982), "The metabolism and elimination of S- carboxymethyl-L-cysteine in man", Drug Metabolism and Disposition, 10(1), pp. 61-62.
31. WHO Expert Committee (2013), Asean guideline on stability study of drug product Version 6.0.
32. Yamaya M., Nishimura H., Shinya K., et al (2010), "Inhibitory effects of carbocisteine on type A seasonal influenza virus infection in human airway epithelial cells", American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, 299(2), pp. 160-168.
33. Yokozeki K., Eguchi C., Kamimura A., Koji K. (1988), "Asymmetric Synthesis of S-Carboxymethyl-L- cysteine by a Chemico- enzymatic Method", Agric. Biol. Chem, 52(9), pp. 2368-2368.
34. Zheng J. P., Kang J., Huang S. G., et al (2008), "Effect of carbocisteine on acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (PEACE Study): a randomised placebo-controlled study", The Lancet, 371(9629), pp. 2013-2018.
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: Phổ hồng ngoại của Carbocistein được tổng hợp từ L-cystein hydroclorid monohydrat.
PHỤ LỤC 2: Phổ khối lượng [M-H]- của Carbocistein được tổng hợp từ L- cystein hdroclorid monohydrat.
PHỤ LỤC 3 : Phổ khối lượng [M+H]+ của Carbocistein được tổng hợp từ L- cystein hdroclorid monohydrat
PHỤ LỤC 4: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của Carbocistein. PHỤ LỤC 5: Phổ cộng hưởng từ carbon của Carbocistein.