Tách và tinh chế dẫn xuất curcumin trích ly từ củ nghệ vàng

Tách và tinh chế dẫn xuất curcumin trích ly từ củ nghệ vàng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TÁCH VÀ TINH CHẾ DẪN XUẤT CURCUMIN

TRÍCH LY TỪ CỦ NGHỆ VÀNG

(Curcuma longa L.)

ThS PHAN THỊ HOÀNG ANH

KS LÊ XUÂN TIẾN

- -

Số: _/BKĐK

KHOA: KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ

NHIỆM VỤ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP

HỌ VÀ TÊN : Nguyễn Thị Mạc Phượng MSSV : 60302187 NGÀNH : Kỹ thuật hữu cơ LỚP : HC03CHC

1 Đầu đề luận án:

Tách và tinh chế các dẫn xuất curcuminoid trích từ củ nghệ vàng Curcuma longa L

2 Nhiệm vụ:

• Tổng quan về curcuminoid, phương pháp tinh chế,cô lập ba thành phần curcuminoid

• Tinh chế, cô lập ba thành phần curcuminoid bằng phương pháp kết tinh lại và sắc ký cột

• Xác định độ tinh khiết của ba thành phần curcuminoid cô lập được bằng TLC, điểm chảy, HPLC

• Xác định cấu trúc của ba thành phần curcuminoid bằng phổ UV-Vis, MS, NMR

• Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH và MDA

3 Ngày giao nhiệm vụ luận án: 08/2007

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 31/12/2007

5 Họ và tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn

PGS.TS Trần Thị Việt Hoa ………

ThS Phan Thị Hoàng Anh ………

Nội dung và yêu cầu của Luận án tốt nghiệp đã được thông qua Bộ môn

Ngày………tháng ……năm 2007 Ngày………tháng ……năm 2007

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

TS Phan Thanh Sơn Nam ThS Phan Thị Hoàng Anh

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN

Người duyệt (chấm sơ bộ):

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Trần Trần Thị Việt Hoa, cô Phan Thị Hoàng Anh, thầy

Lê Xuân Tiến, Bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ, đã hướng dẫn tận tình tôi trong suốt quá trình

thực hiện luận văn

Xin cảm ơn phòng thí nghiệm hữu cơ đã hỗ trợ dụng cụ, máy móc thiết bị và cảm ơn

cô Nguyễn Thị Thu Hương trưởng bộ môn dược lý hóa sinh trường Đại học Y Dược

TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm

Xin cảm ơn các bạn lớp Hữu cơ 03 đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên trong thời gian làm thí nghệm tại trường

Cảm ơn gia đình và người thân đã động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn

TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 01 năm 2008

Xin chân thành cảm ơn

         

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Luận văn này đã tiến hành phân lập ba thành phần curcuminoid có trong bột curcuminoid thương phẩm và xác định cấu trúc, hoạt tính của chúng

Các kết quả thu được từ thực nghiệm:

1 Phân lập ba thành phần curcuminoid trong hỗn hợp curcuminoid ban đầu bằng phương pháp TLC, CC, HPLC

2 Xác định độ tinh khiết, cấu trúc và một số tính chất hóa học của các curcuminoid phân lập được

Khảo sát hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminoid và ba thành phần curcuminoid pheo hai phương pháp DPPH và MDA Kết quả tất cả các mẫu đều có hoạt tính sinh học trong hai phép thử này

LỜI MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, ở các nuớc Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc và các nuớc Đông Nam Á, nghệ đã được sử dụng như môt loại gia vị truyền thống và một loại thuốc gia truyền sử dụng trong gia đình Nghệ được biết đến là một loại cây có tác dụng dược lý rất tốt chữa nhiều bệnh khác nhau Curcuminoid là một hỗn hợp gồm ba dẫn xuất diferuloylmethane đã đuợc nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước chứng minh là thành phần chủ yếu đem lại hoạt tính sinh học của củ nghệ Hoạt tính của các curcuminoid thành phần có thể khác nhau và khác với curcuminod hỗn hợp Do vậy, việc tách các thành phần này ra khỏi hỗn hợp là cần thiết cho việc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính dược học của nghệ

Nội dung đề tài luận văn này xin trình bày việc tách chiết các curcuminoid thành phần

từ bột curcuminoid thương phẩm và khảo sát cấu trúc, tính chất hóa học cũng như hoạt tính kháng oxy hóa của các đơn thành phần, đem đến hiểu biết sâu hơn về curcuminoid

và khả năng ứng dụng các thành phần của curcumioid trong thực phẩm và dược phẩm

DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 1.1 Kết quả khảo sát một số hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng TLC 

Bảng 1.2 Khối lượng và thành phần hỗn hợp curcuminoid sau 3 lần kết tinh (khối lượng mẫu ban đầu 500mg) 

Bảng 1.3 Kết quả tách các curcuminoid từ hỗn hợp bằng cột sắc ký silica gel (khối lượng mẫu khô nạp lên cột 100mg) 

Bảng 1.4 Kết quả phổ NMR của các chất curcumin, DMC và BDMC 

Bảng 2.1 Hỗn hợp phản ứng 

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hệ dung môi (trichloromethane:methanol) 

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hệ dung môi (dichloromethane:methanol)  

Bảng 3.3 Kết quả kết tinh curcuminoid thô 3 lần trong hỗn hợp methanol:nước

Bảng 3.4 Kết quả tính diện tích peak, % diện tích peak các curcuminoid thành phần Bảng 3.5 Kết quả cột định lượng hỗn hợp curcuminoid sau kết tinh 

Bảng 3.6 Kết quả cột định lượng hỗn hợp curcuminoid trong nước cái dưới lọc 

Bảng 3.7 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của curcumin

Bảng 3.8 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của DMC 

Bảng 3.9 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của BDMC 

Bảng 3.10 Hoạt tính bắt gốc tự do của curcumin theo phương pháp DPPH 

Bảng 3.11 Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, DMC và BDMC theo phương pháp DPPH

Bảng 3.12 Hoạt tính bắt gốc tự do của trolox theo phương pháp DPPH

Bảng 3.13 Giá trị IC50 của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC 

Bảng 3.14 Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid thô, curcumin, DMC và BDMC theo phương pháp MDA

Bảng 3.15 Hoạt tính bắt gốc tự do trolox theo phương pháp MDA 

Bảng 3.16 Giá trị IC50 của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC 

DANH SÁCH CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cây nghệ

Hình 1.2 Cấu trúc các thành phần của curcuminoid

Hình 1.3 Các đồng phân của curcumin

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone

Hình 1.5 Sự phân ly các proton của curcumin

Hình 1.6 Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH

Hình 1.7 Phản ứng phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

Hình 1.8 Cấu trúc phức Cu-curcumin (1:1) và (1:2) giữa đồng acetate và curcumin Hình 1.9 Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do

Hình 1.10 Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin

Hình 1.11 Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, HPLC hỗn hợp các curcuminoid, curcumin, DMC và BDMC và cấu trúc của các curcuminoid xác định được

Hình 1.12 Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin

Hình 1.13 Cấu trúc các chất 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione, 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) và 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene-3,5-dione

Hình 1.14 Cơ chế phản ứng đánh bắt gốc tự do của curcumin và các chất tương tự curcumin không chứa nhóm phenol

Hình 1.15 Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ 1 đến 6

Hình 1.16 Cơ chế của curcumin chống lại sự oxy hóa lipid chưa bão hòa (EtLO: ethyl linoleate, EtLOOH: ethyl linoleate hydroperoxide, EtLOO•: gốc ethyl linoleate hydoperoxyl)

Hình 1.17 Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy Hình 2.1 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm

Hình 2.2 Bột curcuminoid ban đầu

Hình 2.3 Sắc ký bản mỏng (TLC): (A) Triển khai bản mỏng (B) Cách đo khoảng cách trên bản mỏng sau khi triển khai để tính giá trị Rf

Hình 2.4 Các bước thực hiện sắc ký cột

Hình 2.6 Dãy hỗn hợp sau phản ứng

Hình 2.7 Phương pháp định lượng MDA

Hình 3.1 Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH3Cl:CH3OH

Hình 3.2 Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH

Hình 3.3 Kết quả TLC của các mẫu hỗn hợp curcuminoid ban đầu (M) và hỗn hợp curcuminoid sau lần kết tinh thứ nhất (I), thứ hai (II) và thứ ba (III)

Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp curcuminoid: (A)ban đầu; (B) sau kết tinh Hình 3.5 Kết quả TLC của hỗn hợp curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC của curcumin, DMC, BDMC

Hình 3.7 (A) curcumin; (B) demethoxycurcumin (DMC); (C) bisdemethoxycurcumin (BDMC)

Hình 3.8 Phổ UV-Vis của curcumin

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Cur : curcumin

DMC : demethoxycurcumin

BDMC : bisdemethoxycurcumin

TLC : sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography)

MS : phổ khối lượng (Mass spectrometry)

IR : phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

UV-Vis : phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – visible spectroscopy)

IC50 : Nồng độ cần thiết để tác động lên 50% chất cần khảo sát (Effective concentration 50)

Oleoresin : nhựa dầu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về curcumin

Curcumin là hợp chất được chiết từ củ nghệ (Curcuma longa L) – một loài cây phân

bố ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở châu Á và được dùng như một loại gia

vị Curcumin có dạng bột màu vàng, là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng của

nghệ.[6]

Curcumin tương đối trơ và không gây độc đối với cả động vật lẫn con người ngay cả với lượng lớn Theo nghiên cứu, curcumin không gây độc với người với lượng lên tới 10g /ngày [2]

Chính nhờ tính an toàn đó mà curcumin là chất có tiềm năng sử dụng trong ngành dược Curcumin đã được sử dụng trong thuốc truyền thống để chữa các bệnh như : bệnh vàng da, bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh về da, bong gân, viêm, bệnh cúm [5] Trong những năm gần đây, người ta rất quan tâm đến nhiều tác dụng dược lý khác của curcumin như: tính chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống đông máu…[2]

Hình 1.1 Cây nghệ (1) Củ nghệ; (2) Thân và lá nghệ; (3) Bột nghệ

1.1.1 Các thành phần và các dạng đồng phân của curcumin

Thành phần của curcuminoid trên thị trường ngoài curcumin thực chất còn có một số loại chất màu khác cùng đem lại màu vàng cho nghệ gọi chung là curcuminoid Curcuminoid là các dẫn xuất dicinnamoylmethane Curcuminoid gồm3 thành phần chính: [6]

1) Curcumin [1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione]

(1)

(2) (3)

H H O

O

H3C

O H

O HH

(công thức phân tử: C20H18O5, khối lượng phân tử : 338)

3) Bis-demethoxy curcumin

[1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione]

(công thức phân tử : C19H16O4, khối lượng phân tử : 308) (BDMC)

Trong đó, curcumin chiếm chủ yếu, khoảng 77% đối với sản phẩm thương mại, tiếp

theo là DMC (17%) và BDMC (3%) [14]

OH O

H

1) R1 = R2 = OCH3 : Curcumin (Cur) 2) R1 = OCH3 ; R2 = H : Demethoxy curcumin (DMC) 3) R1 = R2 = H : Bis-demethoxy curcumin (BDMC)

Hình 1.2 Cấu trúc các thành phần của curcuminoid

Mỗi thành phần kể trên còn có các đồng phân hình học: s-cis-diketone,

s-trans-diketone, cis-cisenol Ngoài ba thành phần chính ở trên, mỗi thành phần nhỏ còn có

thể chia thành các thành phần nhỏ hơn là các đồng phân hình học của chúng

Curcumin tồn tại ở 3 dạng đồng phân: cis-diketone, trans-diketone và enol

Hình 1.3 Các đồng phân của curcumin: (1) s-cis-diketone; (2) s-trans-diketone; (3)

enol

Cấu trúc cis-diketone bền hơn dạng trans-diketone và tỉ lệ cis-trans này phụ thuộc vào

điều kiện dung môi [18]

Trong môi trường acid hay trung tính, curcumin tồn tại dưới dạng cân bằng enol –

ketone đối xứng và ổn định Dạng ketone tồn tại ở dạng rắn còn dạng enol tồn tại ở

dạng lỏng Cân bằng này phụ thuộc vào loại dung môi và pH [18]

Chương 1: Tổng quan

O H

R1

O

OH

R2O

H

Dạng enol bền hơn ketone nhờ có liên kết hydro nội phân tử và phân tử ở dạng liên hợp Ở dạng dung dịch, dạng enol chiếm ưu thế Cấu trúc của dạng enol hoàn toàn phẳng và cho phép cộng hưởng bên trong 2 phần benzene Kết quả là curcumin dạng enol thể hiện một mũi hấp thu mạnh ở vùng nhìn thấy Ngược lại, cấu trúc của dạng ketone lại xoắn nên hấp thụ ở vùng tử ngoại gần [2]

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone

Dạng đồng phân enol có 3 proton có thể ion hóa tương ứng với 1 nhóm enolic và 2 nhóm phenolic Khi phân ly, dạng enol phân ly thành 2 loại anion Một loại hình thành

do sự phân ly proton của nhóm enolic có bước sóng hấp thu cực đại là 429 nm và loại kia do sự phân ly proton của nhóm phenolic có bước sóng hấp thu cực đại là 531 nm [2]

Hình 1.5 Sự phân ly các proton của curcumin

Enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và enolic proton có tính acid trội nhất trong ba proton Enolic proton đóng vai trò quan trọng đối với quá trình phân ly và trao đổi proton liên quan đến cơ chế loại bỏ gốc tự do của curcumin Điều đó có nghĩa

là trong suốt quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do, proton enolic là proton đầu

C H

OCH 3

O H

O O

-e

H 3 CO O H

C H

OCH3

O H

O O

Ngoài ra các thành phần kể trên, một lượng nhỏ các chất dầu và nhựa tồn tại trong bột nghệ (turmeric) có thể vẫn tồn tại trong curcumin Đó là các sesquiterpene ketone và các alcolhol như : α-turmeron, β-turmeron, curlon, zingiberen, ar-turmeron, turmenorol A, turmeronol B [3]

1.1.2 Tính chất hóa lý của curcumin

ƒ Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng khoảng từ 420 – 430 nm

1.1.2.2 Tính chất hóa học

a Sự điện ly

Trong môi trường pH <1, curcumin có màu đỏ thể hiện trạng thái proton hóa H4A+ Ở

pH từ 1 – 7, hầu hết các diferulolylmethane đều ở dạng trung hòa H3A, có khả năng hòa tan rất thấp và dung dịch có màu vàng Ở pH > 7.5, màu dung dịch chuyển sang

đỏ Giá trị hằng số phân ly pKa của 3 proton dạng acid của curcumin ( dạng H2A-,

HA2, A3-) được xác định tương ứng là 7.8, 8.5 và 9.0 [3]

Hình 1.6 Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH

H3CO

O H

OH+

OCH3OH

O H

H3CO

O

OH

OCH3OH

O H

O

O dihydrocurcumin O

H

H3CO

O

OH OCH3H

O tetrahydrocurcumin O

H

H3CO

O

OH OCH3OH

hexahydrocurcumin

Trong đó tetrahydrocurcumin (THC) cũng là một chất có hoạt tính chống oxy hóa có khả năng loại bỏ gốc tự do như gốc tert-butoxyl và peroxyl [7]

c Phản ứng phân hủy trong môi trường kiềm

Curcumin tương đối bền ở pH acid nhưng lại nhanh chóng bị phân hủy ở pH kiềm Đầu tiên ferulic acid và ferulolylmethane được tạo thành Sau đó, eruolylmethane nhanh chóng tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu vàng đến vàng nâu Tiếp theo, eruolylmethane tiếp tục thủy phân tạo ra vanillin và aceton và lượng các chất này tăng theo thời gian ủ [3]

O H OCH3

OH OCH3

O

OH OCH3

O H O

Hình 1.7 Phản ứng phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

Người ta ứng dụng sự thủy phân này của curcumin để sản xuất vanillin và các loại hương thiên nhiên khác [9]

Erika Pfeiffer [20] tiến hành ủ các hỗn hợp curcumin có tỉ lệ 3 thành phần curcuminoid khác nhau trong hệ đệm phosphate pH 7.4 trong điều kiện có và không có huyết thanh Kết quả cho thấy curcumin bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường không có huyết thanh Độ bền của các curcuminoid cũng khác nhau: kém bền nhất là curcumin và bền nhất là BDMC Kết quả HPLC cho thấy sản phẩn phân hủy của quá

trình này là: vanillin, ferulic acid, feruolylmethane và

trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal

d Phân hủy dưới tác dụng ánh sáng [3]

Curcumin không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch[3] Curcumin bị phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng ngay cả ở dạng rắn Sản phẩm phân hủy là vanillin, vanillin acid, ferulic aldehyde và ferulic acid [11]

OH‐ 

OH ‐  

Sản phẩm ngưng tụ

Khi bị chiếu xạ, curcumin bị đóng vòng hoặc phân hủy thành vanillic acid, vanillin và ferulic acid ( Sasaki et al, 1998)[3]

Khi có mặt của oxy và ánh sáng, curcumin bị phân hủy tạo thành 4-vinyl guaialcol và vanillin:

OHC

OCH3O

H

+

CH

OCH3OH

CH2

+ H3C CO CH3 + CO2

e Phản ứng tạo phức với kim loại

Curcumin là hợp chất β-diketone nên cũng có tính chất hóa học của một β-diketone Proton của nhóm methyl ở dạng keto và proton của nhóm hydroxyl ở dạng enol của hợp chất β-diketone có tính acid Khi các hydro này bứt ra, diketone sẽ tạo thành anion 1,3-diketonate Diketonate anion này có thể tạo phức vòng càng với các kim loại chuyển tiếp và những nguyên tố phân nhóm chính Muối kim loại thường được sử dụng cho phản ứng tạo phức là muối acetate, clorua, nitrate, sulfate, carbonate của các kim loại chuyển tiếp như: Cu, Fe, Mn, Zn, V, Ga, In, Ni, Co, Pd, Hg [15] Các phức này cũng có hoạt tính loại bỏ gốc tự do được ứng dụng trong ngành dược [14]

H3CO

O H

O O

Hình 1.8 Cấu trúc phức Cu-curcumin (1:1) và (1:2) giữa đồng acetate và curcumin

f Phản ứng của nhóm phenolic OH [13]

Một trong những hoạt tính đáng chú ý của curcumin là khả năng loại bỏ gốc oxygen hoạt động và các gốc nitrogen tự do Đó là do curcumin có 2 nhóm o-methoxy phenolic OH đính vào mạch heptadience-dione Các electron chưa liên kết của nhóm

OH liên hợp với vòng benzen làm cho H của nhóm này linh động hơn Điều đó giải thích cho tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin

H3CO O H

OCH3OH R*

H3CO

O

OCH3OH

H3CO O H

OCH3O

H3CO O H

OCH3OH

H3CO O H

OCH3OH Curcumin

Hình 1.9 Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do [13] 1.1.3 Phương pháp phân lập 3 thành phần của curcumin

Như đã đề cập ở phần trên, curcumin trên thị trường là hỗn hợp của 3 curcuminoid: curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC) Trong đó curcumin chiếm chủ yếu (khoảng 77%), tiếp theo là DMC (17%) và BDMC (3%) [14] Các thành phần này có cấu trúc hóa học khác nhau nên cũng có màu sắc và tính chất hóa học khác nhau Curcumin tinh khiết rất hiếm và đắt trong khi DMC và BDMC vẫn chưa có trên thị trường Do đó, việc tách các curcuminoid thành những đơn chất riêng biệt là cần thiết cho việc nghiên cứu và có ý nghĩa kinh tế Nhiều nghiên cứu đã đưa ra các phương pháp nhằm phân lập các thành phần này trong hỗn hợp curcumin thô ban đầu

Rasmussen và các đồng sự [15] đã đưa ra phương pháp tách các curcuminoid đơn giản

và hiệu quả sử dụng sắc kí lớp mỏng (TLC) silica gel đã được tẩm dihydrogen phosphate Tuy phương pháp này có thể tách và xác định các curcuminoid thành phần nhưng vẫn còn hạn chế do không định lượng được hàm lượng mỗi curcuminoid có trong hỗn hợp

Marsin [4] đã sử dụng phương pháp HPLC CO2 siêu tới hạn với pha động là hệ đệm acetonitrile/acetate [4] Một phương pháp khác của Xian-Guo He là tách và xác định curcumin sử dụng cột Supelcosil LC-18 với pha động là ammonium acetate/ acetic acid và acetonitrile[16] Taylor và McDowell đã tách được 3 thành phần curcuminoid

sử dụng cột polymer non-silica với pha động là dung dịch acetonitrile 55%

Opa Vajragupta và các đồng sự [17] đã tách hỗn hợp curcuminoid ra các thành phần đơn lẻ bằng phương pháp sắc kí Bột curcumin trước tiên được hòa tan trong acetone, sau đó được tách bằng sắc kí silica gel với hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH:AcOH (98:5:2) Theo phương pháp này, curcumin được rửa giải trước, sau đó là hỗn hợp của curcumin với DMC, kế đó là BDMC tinh DMC tinh khiết được tách lần thứ hai cũng bằng phương pháp sắc kí với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH (95:5) Độ tinh khiết của các thành phần được kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng TLC, các phổ cộng hưởng từ NMR, phổ hồng ngoại IR, khối phổ ion nguyên tử ESI-MS và phân tích nguyên tố EA

Guddadarangavvanahally K.Jayaprakasha và các đồng sự [4] đã tách ba thành phần của curcumin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Các curcuminoid được tách từ oleoresin sử dụng cột sắc kí silicagel sau khi rửa với hexane để loại béo Đầu tiên, tinh dầu nhựa nghệ thương phẩm (CRIO) được hấp phụ lên silica gel, sau đó được nạp lên cột sắc ký silica gel và rửa với dung môi hexane Tiếp đó, cột được rửa với benzene và ethyl acetate với độ phân cực tăng dần Curumin thu được với hệ dung môi benzene:EtOAc (82:18 v/v), trong khi DMC và BDMC đươc rửa tương ứng bằng các

hệ benzene:EtOAc (70:30 v/v), benzene:EtOAc (58:42 v/v) Các phân đoạn thu được qua cột được cô chân không và kết tinh lại Hiệu suất tách tương ứng của các chất curcumin, DMC và BDMC tương ứng là đạt 2.2, 4.46 và 3.4%

Các chất thu được cho một chấm đơn trên sắc kí bản mỏng (TLC) silica gel với hệ dung môi chloroform/methanol (98:2) Giá trị Rf tương ứng là 0.55, 0.50, 0.43 Các chất này cũng cho một mũi đơn trên HPLC Nhiệt độ nóng chảy đo được của curumin, DMC và BDMC tương ứng là 186 -187, 175 -176 và 231 - 232°C [4] Bằng phổ 1H và

13C NMR, các curcuminoid này được xác định tương ứng là curcumin, DMC và BDMC Các kết quả trên chứng tỏ nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid có oleoresin nghệ và khẳng định đó chính là curcumin, DMC và BDMC

Péret-Almeida và các đồng sự [1] đã tách được và xác định một số tính chất hóa lý của từng curcuminoid riêng biệt Nghiên cứu đã khảo sát một số hệ dung môi để tách 3 thành phần trên bằng sắc kí bản mỏng silica gel 60G (Merk, Darmstadt, Germamy) (4.5 x 10 mm)

Bảng 1.1 Kết quả khảo sát một số hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng TLC [1]

Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tách các curcuminoid bằng sắc kí cột silica gel 60G được tẩm natri hydrogen phosphate và dung môi rửa giải dichloromethane Hỗn hợp các curcumin trước khi tách bằng sắc kí cột được kết tinh 3 lần curcumin trong hỗn hợp methanol:nước (5:1 v/v) Kết quả cho thấy sau các lần kết tinh, hàm lượng curcumin tăng lên rõ rệt Sau lần kết tinh thứ nhất, hàm lượng curcumin tăng lên 56.9%, còn lại là các curcuminoid khác Đến hết lần kết tinh thứ ba, hàm lượng này lên đến 92.2%, còn lại là DMC và hầu như không còn BDMC trong hỗn hợp Tuy nhiên, hiệu suất của quá trình này rất thấp, lượng curcumin thu được chỉ còn 40% so với ban đầu

Bảng 1.2 Khối lượng và thành phần hỗn hợp curcuminoid sau 3 lần kết tinh (khối

lượng mẫu ban đầu 500mg) [1]

Lần kết tinh Khối lượng

(mg)

Thành phần (%) Curcumin DMC BDMC

Bảng 1.3 Kết quả tách các curcuminoid từ hỗn hợp bằng cột sắc ký silica gel (khối

lượng mẫu khô nạp lên cột 100mg) [1]

Phân đoạn Tổng thể tích (ml) Thành phần Khối lượng

đo điểm chảy của các chất curcumin, DMC và BDMC tương ứng là 184, 172 và 222°C [1]

Hình 1.10 Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin [1]

Các curcuminoid thu được còn được định tính bằng phổ các phổ tử ngoại, phổ khả kiến, hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và bằng phương pháp đo màu Các kết quả đo đã xác định các chất thu được chính là curcumin, DMC và BDMC

Bảng 1.4 Kết quả phổ NMR của các chất curcumin, DMC và BDMC [1]

Hình 1.11 (A) Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, các mẫu từ trái sang lần lượt là hỗn

hợp các curcuminoid: curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) (B) Kết quả HPLC của các chất theo thứ tự từ trên xuống: hỗn hợp các curcuminoid, curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) (C) Cấu trúc của các curcuminoid xác định được curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) [18]

1.2 Hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất curcuminoid

Từ xa xưa, ở các nước Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á, nghệ (Curcuma

longa L.) đã được sử dụng làm gia vị, chất bảo quản và màu thực phẩm Nghệ còn là

vị thuốc trong gia đình để chữa các bệnh khác nhau: rối loạn mật, chứng biếng ăn, ho, viêm gan, xoang … Những thập niên gần đây, người ta ngày càng chú ý nhiều đến hoạt tính sinh học của nghệ và curcumin Nhiều công trình đã nghiên cứu hoạt tính và tác dụng dược lý của curcumin Kết quả cho thấy, curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng, bao gồm: hoạt tính chống viêm, chống ung thư, chống đột biến, chống đông máu, chống vi khuẩn, chống nấm, chống virus, làm lành vết thương, giảm cholesterol; chữa một số bệnh như: Alzheimer, đái tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS

… [6, 22]

1.2.1 Hoạt tính chống ung thư

Curcumin có khả năng ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển khối u

Hình 1.12 Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin [23]

Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do và

bị biến đổi thành các tế bào ung thư Curcumin có thể ngăn chặn quá trình này bằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa khác nhau như: gốc hydroxyl OH•, gốc peroxyl ROO•, singlet oxygen, nitric oxide NO và peroxynitrite ONOO¯ [18, 24] Curcumin có khả năng bảo vệ lipid, hemoglobin và AND khỏi quá trình oxy hóa Curcumin tinh khiết có hoạt tính kháng các ion oxy hóa mạnh hơn demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin [24] Kết quả nghiên cứu của Conney [24] cho thấy curcumin còn có tác dụng ức chế các chất gây ung thư benzo[a]pyrene (BaP) và 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) trên da chuột Curcumin được chứng minh là có khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Khả năng làm giảm quá trình di căn này curcumin phụ thuộc vào nguồn gốc của khối u và loại khối u ác tính [22, 24]

1.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa

Như đã nói ở phần giới thiệu chung về hoạt tính của curcumin, curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng Một vài hoạt tính sinh học đó bắt nguồn từ tính kháng oxy hóa của curcumin Curcumin là một chất kháng gốc oxy hóa tự do mạnh Các nghiên

cứu trên thế giới đã chứng minh in vitro curcumin ức chế sự phát sinh của nhiều tác

nhân gây oxy hóa (ROS) như: anion superoxide, H2O2, gốc nitrite đồng thời làm giảm

lượng ROS in vivo Các dẫn xuất của curcumin là demethoxycurcumin và

bisdemethoxycurcumin cũng có hoạt tính kháng oxy hóa.[22]

Cấu trúc curcumin có hydrogen của nhóm phenol và hydrogen của nhóm methyl giữa mạch đều có khả năng tạo nên hoạt tính kháng oxy hóa Tuy nhiên, vẫn còn nhiều tranh cãi xung quanh việc hoạt tính của curcumin thực chất do hydrogen ở vị trí nào đem lại

Liang Shen [2] cho rằng enolic proton hoạt động hơn phenolic proton và là proton có

Tế bào

bình thường

Tế bào ung thư

Khối u tăng trưởng

Khối u di căn

Curcumin

trình phân ly và trao đổi proton liên quan đến cơ chế loại bỏ gốc tự do của curcumin Điều đó có nghĩa là trong suốt quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do, proton enolic là proton đầu tiên tách ra [2]

     

1,7-diphenyl-1,6-Wright, J S [19] lại chỉ ra rằng vai trò của nhóm phenol và methyl đối với khả năng kháng oxy hóa của curcumin phụ thuộc vào loại gốc tự do và môi trường phản ứng Nghiên cứu cho rằng curcumin bắt gốc tự do curcumin theo cơ chế HAT (H-atom transfer):

Cur – H : phân tử curcumin

FR – H : gốc tự do sau khi nhận thêm một nguyên tử H Cur• : gốc curcumin hình thành do mất nguyên tử H của O-H hoặc C-H

Ví dụ: DPPH• + trans-diketo curcumin → DPPH2 + trans-diketo curcumin

K Indira Priyadarsini [13] cho rằng hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin là do cả nhóm phenol lẫn nhóm methyl Quá trình phản ứng của chất oxy hóa với curcumin diễn ra theo hai hướng: (1) sự dịch chuyển electron sau khi phân tử curcumin mất một proton; (2) sự tách ra của hydro ở nhóm phenol.(Hình 1.10)

Khi nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng phản ứng với monocation của 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sunfonic acid (ABTS•+) trên curcumin và một vài chất có cấu tạo tương tự curcumin mà không chứa nhóm phenol, W M Weber [5’] đã kết luận curcumin phản ứng đánh bắt gốc tự do và tạo thành gốc phenoxy bền theo cả hai cơ chế sau:

(1) Tách trực tiếp hydrogene ở nhóm phenol

(2) Ion hóa proton của nhóm methyl ở giữa mạch, sau đó thông qua sự dịch chuyển electron tạo thành gốc carbon trung tâm và đồng phân hóa hình thành gốc phenoxy

H

OCH3

C C C

O H

OCH3

C C C

OCH3

C C C

H

OCH3

C C C

H O

H+

H+O

OCH3

C C C

C C C

O O

R H

C C C

O O R

C C C

O O

R ABTS

Hình 1.14 Cơ chế phản ứng đánh bắt gốc tự do của curcumin (trên) và các chất

tương tự curcumin không chứa nhóm phenol (dưới).[26]

Toshiya Masuda [27] cho rằng quá trình bắt gốc tự do của curcumin xảy ra theo cơ chế:

S – OO• + AH  SOOH + A• (1)

A• + X• → nonradical material (2) Trong đó: S: chất được oxy hóa

AH: chất chống oxy hóa có nhóm phenolic

A• : gốc kháng oxy hóa

Quá trình (1) là thuận nghịch, quá trình thứ (2) là bất thuận nghịch, sản phẩm cuối cùng là hợp chất bền

Chuỗi phản ứng trong dây chuyền phản ứng chống gốc tự do của curcumin cũng kết thúc bằng phản ứng ghép đôi giữa A• và X• Khi có mặt các lipid không bão hòa, gốc lipid hydroperoxyl đóng vai trò là X• và tạo thành một vài đồng phân peroxide bằng phản ứng ghép đôi với gốc curcumin

Toshiya Masuda [27] đã xác định được 6 sản phẩm của quá trình kháng oxy hóa của curcumin với sự có mặt của linoleate Các sản phẩm được đánh dấu từ 1 đến 6 trên hình 1.15

Hình 1.15 Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ 1 đến 6 [27]

Hình 1.16 Cơ chế của curcumin chống lại sự oxy hóa lipid chưa bão hòa (EtLO: ethyl

linoleate, EtLOOH: ethyl linoleate hydroperoxide, EtLOO • : gốc ethyl linoleate hydoperoxyl)[27]

Cơ chế kháng oxy hóa của curcumin với sự hiện diện của linoleate được biểu diễn trên hình 1.16 Curcumin bắt giữ gốc tự do bằng nhóm phenolic và chuyển thành gốc tự do curcumin Gốc tự do curcumin phản ứng với gốc peroxyl của ethyl linoleate tạo thành một sản phẩm ghép nối thông qua liên kết peroxyl Sản phẩm này không bền nên tiếp tục phản ứng Diels-Alder cho sản phẩm cuối cùng là một trong 6 sản phẩm đã nêu ở trên Linoleate

tạo ra 4 gốc đồng phân peroxyl trong suốt quá trình tự oxy hóa, gồm: 9-trans diene 13-hydroperoxide, 9-cis-11-trans-diene 13-hydroperoxide, 10-trans-12 cis-diene 9- hydroperoxide, và 10-trans-12-trans-diene 9-hydroperoxide Phản ứng ghép đôi tương

11-trans-ứng giữa các gốc peroxyl này và gốc curcumin tạo ra các sản phẩm trung gian Các sản phẩm này tiếp tục biến đổi thành một trong số 6 sản phẩm cuối cùng kể trên thông qua phản ứng Diels-Alder.[27]

Khả năng kháng oxy hóa của curcumin còn thể hiện ở khả năng tạo phức với các ion kim loại gây độc cho cơ thể động vật như: Pb, Cd, Fe Do đó, giảm những tổn thương thần

kinh và mô động vật nhờ giảm quá trình oxy hóa lipid gây ra bởi các kim loại trên não [28, 29]

Hoạt tính kháng oxy hóa không giống nhau giữa các curcuminoid có trong nghệ Hoạt

tính in vitro của các chất này thay đổi theo thứ tự curcumin > demethoxycurcumin >

bisdemethoxycurcumin [30] Sở dĩ như vậy là do ảnh hưởng của nhóm methoxyl ở vị trí ortho tồn tại trong cấu tạo Nhóm methoxyl ở vị trí ortho tạo liên kết hydro nội phân tử với hydro của nhóm phenol làm cho hydro này tách ra dễ dàng hơn [25] Điều đó giải thích vì sao hoạt tính của curcumin cao hơn các curcuminoid còn lại: DMC chỉ còn một nhóm ortho-methoxy và BDMC không còn ortho-methoxy nào

O H

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Mục đích nghiên cứu

- Tách 3 thành phần riêng biệt trong hỗn hợp curcuminoid thương phẩm

- Xác định độ tinh khiết, cấu trúc hóa học của mỗi thành phần

- Xác định hoạt tính sinh học từng thành phần tách được

2.2 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm

Hình 2.1 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm

Sắc kí cột (CC)

Sắc kí cột (CC)

Xác định cấu trúc, định lượng

Xác định hoạt tính sinh học

Bột curcuminoid thương phẩm đầu tiên được kết tinh lại trong hệ dung môi methanol:nước Sau đó, cả curcumin sau kết tinh và nước cái dưới lọc đểu được chạy sắc

ký cột để tách lấy các curcuminoid thành phần Qua sắc ký cột, curcuminoid sau kết tinh cho nhiều curcumin và curcuminoid trong nước cái cho nhiều DMC và BDMC Các curcuminoid thành phần cô lập được xác định độ tinh khiết bằng TLC, đo điểm chảy, HPLC và xác định cấu trúc bằng đo phổ UV-Vis, MS, NMR Hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminod ban đầu và các curcuminoid thành phần được xác định bằng phương pháp DPPH và MDA

Hóa chất, nguyên liệu :

- Bột curcuminoid thô (Viện dược liệu, Bộ Y Tế, Hà Nội)

- Methanol 99.9% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP Hồ Chí Minh)

- Nước cất

Hình 2.2 Bột curcuminoid ban đầu

- Thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đục

- Cho tiếp thêm một lượng nhỏ methanol khuấy cho đến khi dung dịch trong trở lại

- Giữ lạnh hỗn hợp ở 5°C trong 2h

- Đem hỗn hợp sau kết tinh lọc chân không

- Bột curcumin trên lọc được hút chân không, chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo

- Nước cái dưới lọc đem đi cô quay thành dạng bột khô, hút chân không, chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo

2.3.2 Sắc ký bản mỏng (TLC)

2.3.2.1 Mục đích

- Xác định hệ dung môi để chạy sắc ký cột

- Kiểm tra thành phần, độ tinh khiết của các hỗn hợp, các phân đoạn sắc ký cột

2.3.2.2 Nguyên tắc

Sắc ký bản mỏng là sắc ký hấp phụ được tiến hành trên một bản mỏng, chất hấp phụ là silica gel hay oxyde nhôm cộng thêm bột bó để trải một lớp mỏng bám trên bề mặt tấm kính

Phương pháp này có ưu điểm: hiệu ứng tách tốt, nhạy hơn các phương pháp khác, thời gian tiến hành nhanh, lượng chất phân tích nhỏ và dụng cụ đơn giản

2.3.2.3 Phương pháp thực hiện

Dụng cụ, hóa chất:

- Bình sắc ký bản mỏng

- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)

9 Bản mỏng khảo sát hệ dung môi: 2x10cm

9 Bản mỏng chạy các mẫu curcuminod sau kết tinh và mẫu sau khi qua cột sắc ký: 5x10cm

Chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm

- Dung môi:

9 dichloromethane 99.5% (Shantou Vilong Chemical Factory)

9 trichloromethane 99.7% (Shantou Vilong Chemical Factory)

9 methanol 99.9% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP Hồ Chí Minh)

9 acetone 99.7% (Công ty giải pháp hóa học Vina, quận Tân Bình, TP Hồ Chí Minh)

Các bước tiến hành:

- Hoạt hóa silica gel bằng cách sấy bản mỏng ở nhiệt độ 110°C trong 1h, sau đó để cân bằng ẩm trong bình hút ẩm 30 phút

- Chấm chất cần phân tích lên bản mỏng:

9 Hòa tan một ít mẫu curcumin vào một lượng vừa đủ acetone

9 Vuốt ống mao quản bằng ngọn lửa đèn cồn, rửa ống mao quản 2 lần bằng acetone

9 Dùng ống mao quản, hút một lượng mẫu đã hòa tan rồi chấm lên bản mỏng