Tách và tinh chế dẫn xuất curcumin trích ly từ củ nghệ vàng

Tách và tinh chế dẫn xuất curcumin trích ly từ củ nghệ vàng

  ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TÁCH VÀ TINH CHẾ DẪN XUẤT CURCUMIN TRÍCH LY TỪ CỦ NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L.) SVTH : NGUYỄN THỊ MẠC PHƯỢNG CBHD : PGS TS. TRẦN THỊ VIỆT HOA ThS. PHAN THỊ HOÀNG ANH KS. LÊ XUÂN TIẾN TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2008   Đại học Quốc gia Tp.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ----------- -- -------------- Số:_______/BKĐK KHOA: KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ NHIỆM VỤ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP HỌ VÀ TÊN : Nguyễn Thị Mạc Phượng MSSV : 60302187 NGÀNH : Kỹ thuật hữu cơ LỚP : HC03CHC 1. Đầu đề luận án: Tách và tinh chế các dẫn xuất curcuminoid trích từ củ nghệ vàng Curcuma longa L. 2. Nhiệm vụ: • Tổng quan về curcuminoid, phương pháp tinh chế,cô lập ba thành phần curcuminoid. • Tinh chế, cô lập ba thành phần curcuminoid bằng phương pháp kết tinh lại và sắc ký cột. • Xác định độ tinh khiết của ba thành phần curcuminoid cô l ập được bằng TLC, điểm chảy, HPLC. • Xác định cấu trúc của ba thành phần curcuminoid bằng phổ UV-Vis, MS, NMR. • Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH và MDA. 3. Ngày giao nhiệm vụ luận án: 08/2007 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 31/12/2007 5. Họ và tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn PGS.TS Trần Thị Việt Hoa …………………………………… ThS. Phan Thị Hoàng Anh …………………………………… KS. Lê Xuân Tiến …………………………………… Nội dung và yêu cầu của Luận án tốt nghiệp đã được thông qua Bộ môn Ngày………tháng ……năm 2007 Ngày………tháng ……năm 2007 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) TS. Phan Thanh Sơn Nam ThS. Phan Thị Hoàng Anh PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): Đơn vị: Ngày bảo vệ: Điểm tổng kết: Nơi lưu trữ luận án:   i  LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn cô Trần Trần Thị Việt Hoa, cô Phan Thị Hoàng Anh, thầy Lê Xuân Tiến, Bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ, đã hướng dẫn tận tình tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn phòng thí nghiệm hữu cơ đã hỗ trợ dụng cụ, máy móc thiết bị và cảm ơn cô Nguyễn Thị Thu Hương trưởng bộ môn dược lý hóa sinh trường Đại học Y Dượ c TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Xin cảm ơn các bạn lớp Hữu cơ 03 đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên trong thời gian làm thí nghệm tại trường. Cảm ơn gia đình và người thân đã động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn. TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 01 năm 2008 Xin chân thành cảm ơn      ii            TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn này đã tiến hành phân lập ba thành phần curcuminoid có trong bột curcuminoid thương phẩm và xác định cấu trúc, hoạt tính của chúng. Các kết quả thu được từ thực nghiệm: 1. Phân lập ba thành phần curcuminoid trong hỗn hợp curcuminoid ban đầu bằng phương pháp TLC, CC, HPLC. 2. Xác định độ tinh khiết, cấu trúc và một số tính chất hóa học của các curcuminoid phân lập được. Khảo sát hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminoid và ba thành phần curcuminoid pheo hai phương pháp DPPH và MDA. Kết quả tất cả các mẫu đều có hoạt tính sinh học trong hai phép thử này.   iii  LỜI MỞ ĐẦU Từ xa xưa, ở các nuớc Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc và các nuớc Đông Nam Á, nghệ đã được sử dụng như môt loại gia vị truyền thống và một loại thuốc gia truyền sử dụng trong gia đình. Nghệ được biết đến là một loại cây có tác dụng dược lý rất tốt chữa nhiều bệnh khác nhau. Curcuminoid là một hỗn hợp gồm ba dẫn xuất diferuloylmethane đã đuợc nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước chứng minh là thành phần chủ yếu đem lại hoạt tính sinh học của củ nghệ. Hoạt tính của các curcuminoid thành phần có thể khác nhau và khác với curcuminod hỗn hợp. Do vậy, việc tách các thành phần này ra khỏi hỗn hợp là cần thiết cho việc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính dược học của nghệ. Nội dung đề tài luận văn này xin trình bày việc tách chiết các curcuminoid thành phần từ bột curcuminoid thương phẩm và khảo sát cấu trúc, tính chất hóa học cũng như hoạt tính kháng oxy hóa của các đơn thành phần, đem đến hiểu biết sâu hơn về curcuminoid và khả năng ứng dụng các thành phần của curcumioid trong thực phẩm và dược phẩm.   iv  DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ LIỆU Bảng 1.1. Kết quả khảo sát một số hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng TLC   Bảng 1.2. Khối lượng và thành phần hỗn hợp curcuminoid sau 3 lần kết tinh (khối lượng mẫu ban đầu 500mg )  Bảng 1.3. Kết quả tách các curcuminoid từ hỗn hợp bằng cột sắc ký silica gel (khối lượng mẫu khô nạp lên cột 100mg )  Bảng 1.4 Kết quả phổ NMR của các chất curcumin, DMC và BDMC   Bảng 2.1. Hỗn hợp phản ứng   Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hệ dung môi (trichloromethane:methanol )  Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hệ dung môi (dichloromethane:methanol)   Bảng 3.3. Kết quả kết tinh curcuminoid thô 3 lần trong hỗn hợp methanol:nước Bảng 3.4. Kết quả tính diện tích peak, % diện tích peak các curcuminoid thành phần   Bảng 3.5. Kết quả cột định lượng hỗn hợp curcuminoid sau kết tinh   Bảng 3.6. Kết quả cột định lượng hỗn hợp curcuminoid trong nước cái dưới lọc   Bảng 3.7 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của curcumin Bảng 3.8 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của DMC   Bảng 3.9 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của BDMC   Bảng 3.10. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcumin theo phương pháp DPPH   Bảng 3.11. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, DMC và BDMC theo phương pháp DPPH Bảng 3.12. Hoạt tính bắt gốc tự do của trolox theo phương pháp DPPH Bảng 3.13. Giá trị IC 50 của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC   Bảng 3.14. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid thô, curcumin, DMC và BDMC theo phương pháp MDA Bảng 3.15. Hoạt tính bắt gốc tự do trolox theo phương pháp MDA   Bảng 3.16. Giá trị IC 50 của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC và BDMC     v  DANH SÁCH CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cây nghệ Hình 1.2. Cấu trúc các thành phần của curcuminoid Hình 1.3. Các đồng phân của curcumin Hình 1.4. Cấu trúc không gian của curcumin dạng enol và diketone Hình 1.5. Sự phân ly các proton của curcumin Hình 1.6. Các trạng thái của curcumin thay đổi theo pH Hình 1.7. Phản ứng phân hủy curcumin trong môi trường kiềm Hình 1.8. Cấu trúc phức Cu-curcumin (1:1) và (1:2) giữa đồng acetate và curcumin Hình 1.9. Sơ đồ biểu hiện hai hướng phản ứng của curcumin với gốc tự do Hình 1.10. Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin Hình 1.11. Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, HPLC hỗn h ợp các curcuminoid, curcumin, DMC và BDMC và cấu trúc của các curcuminoid xác định được Hình 1.12. Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin Hình 1.13. Cấu trúc các chất 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione, 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) và 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene- 3,5-dione Hình 1.14. Cơ chế phản ứng đánh bắt gốc tự do của curcumin và các chất tương tự curcumin không chứa nhóm phenol Hình 1.15. Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ 1 đến 6 Hình 1.16. Cơ chế của curcumin chống lại sự oxy hóa lipid chưa bão hòa (EtLO: ethyl linoleate, EtLOOH: ethyl linoleate hydroperoxide, EtLOO • : gốc ethyl linoleate hydoperoxyl) Hình 1.17. Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy Hình 2.1. Sơ đồ tiến hành thực nghiệm Hình 2.2. Bột curcuminoid ban đầu Hình 2.3. Sắc ký bản mỏng (TLC): (A) Triển khai bản mỏng (B) Cách đo khoảng cách trên bản mỏng sau khi triển khai để tính giá trị R f Hình 2.4. Các bước thực hiện sắc ký cột Hình 2.5. Dung dịch curcumin, DMC, BDMC dùng để đo phổ UV-Vis   vi  Hình 2.6. Dãy hỗn hợp sau phản ứng Hình 2.7. Phương pháp định lượng MDA Hình 3.1. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH 3 Cl:CH 3 OH Hình 3.2. Kết quả TLC của curcumin với hệ dung môi CH 2 Cl 2 :CH 3 OH Hình 3.3. Kết quả TLC của các mẫu hỗn hợp curcuminoid ban đầu (M) và hỗn hợp curcuminoid sau lần kết tinh thứ nhất (I), thứ hai (II) và thứ ba (III) Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp curcuminoid: (A)ban đầu; (B) sau kết tinh Hình 3.5. Kết quả TLC của hỗn hợp curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của curcumin, DMC, BDMC Hình 3.7. (A) curcumin; (B) demethoxycurcumin (DMC); (C) bisdemethoxycurcumin (BDMC) Hình 3.8. Phổ UV-Vis của curcumin Hình 3.9. Phổ UV-Vis của DMC Hình 3.10. Phổ UV-Vis của BDMC Hình 3.11 Curcumin C 21 H 20 O 6 (M=368) Hình 3.12: Demethoxyurcumin C 20 H 18 O 5 (M=338) Hình 3.13 Bisdemethoxycurcumin C 19 H 16 O 4 (M=308) Hình 3.14. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC theo phương pháp DPPH Hình 3.15. Liên kết hydro nội phân tử giữa hydro của nhóm phenol với ortho-methoxy trong cấu trúc curcumin Hình 3.16. Hoạt tính bắt gốc tự do của curcuminoid ban đầu, curcumin, DMC, BDMC theo phương pháp MDA       vii  DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Cur : curcumin DMC : demethoxycurcumin BDMC : bisdemethoxycurcumin TLC : sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography) HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) MS : phổ khối lượng (Mass spectrometry) IR : phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) UV-Vis : phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – visible spectroscopy) IC 50 : Nồng độ cần thiết để tác động lên 50% chất cần khảo sát (Effective concentration 50) Oleoresin : nhựa dầu Chương 1: Tổng quan 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về curcumin Curcumin là hợp chất được chiết từ củ nghệ (Curcuma longa L) – một loài cây phân bố ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở châu Á và được dùng như một loại gia vị. Curcumin có dạng bột màu vàng, là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng của nghệ.[6] Curcumin tương đối trơ và không gây độc đối với cả động vật lẫn con người ngay cả với lượng lớn. Theo nghiên cứu, curcumin không gây độc với người với lượng lên tới 10g /ngày. [2] Chính nhờ tính an toàn đó mà curcumin là chất có tiềm năng sử dụng trong ngành dược. Curcumin đã được sử dụng trong thuốc truyền thống để chữa các bệnh như : bệnh vàng da, bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh về da, bong gân, viêm, bệnh cúm [5]. Trong những năm gần đây, người ta rất quan tâm đến nhiều tác dụng dược lý khác của curcumin nh ư: tính chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống đông máu…[2] Hình 1.1 Cây nghệ (1) Củ nghệ; (2) Thân và lá nghệ; (3) Bột nghệ. 1.1.1. Các thành phần và các dạng đồng phân của curcumin Thành phần của curcuminoid trên thị trường ngoài curcumin thực chất còn có một số loại chất màu khác cùng đem lại màu vàng cho nghệ gọi chung là curcuminoid. Curcuminoid là các dẫn xuất dicinnamoylmethane. Curcuminoid gồm3 thành phần chính: [6] 1) Curcumin [1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione] (công thứ c phân tử: C 21 H 20 O 6 , khối lượng phân tử : 368) (Cur) (1) (2) (3) [...]... (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) (C) Cấu trúc của các curcuminoid xác định được curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) [18] 1.2 Hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất curcuminoid Từ xa xưa, ở các nước Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á, nghệ (Curcuma longa L.) đã được sử dụng làm gia vị, chất bảo quản và màu thực phẩm Nghệ còn là vị thuốc... Bằng phổ 1H và 13 C NMR, các curcuminoid này được xác định tương ứng là curcumin, DMC và BDMC Các kết quả trên chứng tỏ nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid có oleoresin nghệ và khẳng định đó chính là curcumin, DMC và BDMC Péret-Almeida và các đồng sự [1] đã tách được và xác định một số tính chất hóa lý của từng curcuminoid riêng biệt Nghiên cứu đã khảo sát một số hệ dung môi để tách 3 thành... 60 F254 và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Kết quả cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm thu được vào khoảng 95-99% 13 Chương 1: Tổng quan Hình 1.11 (A) Kết quả sắc kí bản mỏng TLC, các mẫu từ trái sang lần lượt là hỗn hợp các curcuminoid: curcumin (curcumin I), DMC (curcumin II) và BDMC (curcumin III) (B) Kết quả HPLC của các chất theo thứ tự từ trên xuống: hỗn hợp các curcuminoid, curcumin (curcumin. .. 55.7 55.7 - W Chearwae và các đồng sự [18] cũng đã tách được các tách được ba thành phần nói trên từ củ nghệ Đầu tiên, bột nghệ được trích ly từ củ nghệ bằng dung môi ethanol trong 24h sau đó được loại béo bằng petroleum ether để thu được curcumin thô Phân tích HPLC cho thấy bột curumin này chứa ba chất khác nhau với hàm lượng tương ứng là 78%, 16% và 5% Các curcuminoid này được tách bằng sắc kí cột... hỗn hợp của 3 curcuminoid: curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC) Trong đó curcumin chiếm chủ yếu (khoảng 77%), tiếp theo là DMC (17%) và BDMC (3%) [14] Các thành phần này có cấu trúc hóa học khác nhau nên cũng có màu sắc và tính chất hóa học khác nhau Curcumin tinh khiết rất hiếm và đắt trong khi DMC và BDMC vẫn chưa có trên thị trường Do đó, việc tách các curcuminoid... và nhựa tồn tại trong bột nghệ (turmeric) có thể vẫn tồn tại trong curcumin Đó là các sesquiterpene ketone và các alcolhol như : α-turmeron, β-turmeron, curlon, zingiberen, ar-turmeron, turmenorol A, turmeronol B [3] 1.1.2 Tính chất hóa lý của curcumin 1.1.2.1 Tính chất vật lý [6] Curcumin được trích từ củ nghệ vàng Curcuma Longa L., có dạng bột màu vàng, điểm chảy 184-185°C Curcumin là chất màu tan... Độ tinh khiết của các curcuminoid riêng lẻ được xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC và xác định điểm chảy Kết quả phân tích HPLC cho các peak đơn chứng tỏ nghiên cứu đã tách thành công các curcuminoid thành các đơn chất tinh khiết Kết quả đo điểm chảy của các chất curcumin, DMC và BDMC tương ứng là 184, 172 và 222°C [1] Hình 1.10 Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin [1] Các curcuminoid... thư đồng thời ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Khả năng làm giảm quá trình di căn này curcumin phụ thuộc vào nguồn gốc của khối u và loại khối u ác tính [22, 24] 1.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa Như đã nói ở phần giới thiệu chung về hoạt tính của curcumin, curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng Một vài hoạt tính sinh học đó bắt nguồn từ tính kháng oxy hóa của curcumin Curcumin là một chất... Chương 1: Tổng quan Bột curcuminoid thương phẩm đầu tiên được kết tinh lại trong hệ dung môi methanol:nước Sau đó, cả curcumin sau kết tinh và nước cái dưới lọc đểu được chạy sắc ký cột để tách lấy các curcuminoid thành phần Qua sắc ký cột, curcuminoid sau kết tinh cho nhiều curcumin và curcuminoid trong nước cái cho nhiều DMC và BDMC Các curcuminoid thành phần cô lập được xác định độ tinh khiết bằng TLC,... nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh in vitro curcumin ức chế sự phát sinh của nhiều tác nhân gây oxy hóa (ROS) như: anion superoxide, H2O2, gốc nitrite đồng thời làm giảm lượng ROS in vivo Các dẫn xuất của curcumin là demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin cũng có hoạt tính kháng oxy hóa.[22] Cấu trúc curcumin có hydrogen của nhóm phenol và hydrogen của nhóm methyl giữa mạch đều có khả năng tạo . Curcumin là ch t màu tan trong d u, ethanol, methanol, dichloromethane, acetone, hầu như kh ng tan trong n c ở môi tr ng acid v trung t nh, tan trong. t nh ch t hóa h c kh c nhau. Curcumin tinh khi t r t hiếm v đ t trong khi DMC v BDMC v n ch ưa c tr n thị tr ng. Do đó, vi c t ch c c curcuminoid