Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng trích ly và tinh chế dẫn xuất curcuminoid từ củ nghệ vàng curcuma longa l

Công nghệ tách chiết Curcuminoid từ củ nghệ vàng bằng dung môi hữu cơBột nghệ khô được chiết bằng ligroin để loại chất béo và tinh dầu.. Chất rắn sau khi sấy khô, hòa tan vào cồn tuy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận này

là trung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa luận này

đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã đượcghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2014

Người viết báo cáo

Trần Thị Chung

học Nông nghiệp Hà Nội.

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Phan Thị Phương Thảo – người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ trong khoa Côngnghệ thực phẩm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóaluận này

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo trường Đại họcNông nghiệp Hà Nội đã truyền đạt cho tôi kiến thức bổ ích và nhiều kinhnghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã quantâm, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Trần Thị Chung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU viii

PHẦN THỨ NHẤT MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – Yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây nghệ 3

2.1.1 Nguồn gốc - phân bố 3

2.1.2 Đặc điểm 4

2.1.3 Thành phần hóa học 4

2.1.4 Dược tính 5

2.2 Tìm hiểu về curcuminoid 6

2.2.1 Giới thiệu về curcuminoid 6

2.2.2 Đặc điểm của curcuminoid 6

2.2.3 Các thành phần và các dạng đồng phân của curcuminoid 7

2.2.4 Tính chất hóa học 8

2.2.5 Tính chất vật lý 10

2.2.6 Ứng dụng của curcuminoid 10

2.2.7 Các phương pháp thu nhận curcuminoid của các tác giả đi trước 12

2.2.8 Quy trình trích ly Curcuminoid 13

2.3.Tình hình tách chiết và kết tinh curcuminoid từ củ nghệ vàng tại Việt Nam14 2.4 Phương pháp trích ly và tinh chế 15

2.4.1 Phương pháp trích ly 15

2.4.2 Phương pháp kết tinh lại 17

2.5 Tìm hiểu về HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) 20

2.5.1 Sơ lược về HPLC 20

2.5.2 Tìm hiểu về hệ thống HPLC 21

PHẦN THỨ BA ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Đối tượng nghiên cứu 25

3.1.1 Nguyên liệu 25

3.1.2 Hóa chất 25

3.1.3 Dụng cụ 25

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.3.1 Khảo sát chung về nguyên liệu 26

3.3.2 Khảo sát khả năng trích ly curcuminoid từ bột nghệ của một số loại dung môi 26

3.3.3 Lựa chọn phương pháp tinh chế curcuminoid cho hiệu suất và chất lượng tốt nhất .26

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Phương pháp phân tích các thành phần hóa học 26

3.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

3.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng curcuminoid 32

3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 32

PHẦN THỨ TƯ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả khảo sát chung về nguyên liệu 33

4.2 Kết quả khảo sát khả năng trích ly curcuminoid từ bột nghệ của một số loại dung môi 33

4.2.1 Kết quả khảo sát loại dung môi và thời gian trích ly 33

4.2.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 35

4.3 Kết quả khảo sát lựa chọn phương pháp tinh chế curcuminoid 37

4.3.1 Nghiên cứu lựa chọn dung môi tinh chế curcuminoid 37

4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình tinh chế curcumin 38

4.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 39

4.4.2 Phương pháp hóa học 40

4.4.3 Phương pháp định lượng curcuminoid bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC 41

PHẦN THỨ NĂM KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của củ nghệ vàng 4Bảng 4.1 Hàm lượng các thành phần chính trong nguyên liệu của nghệ vàng .33Bảng 4.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tới khả năng trích ly củaetylacetat 35Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu và dung môi tới khả năng trích ly củaacetone/etylacetat:2/5 35Bảng 4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình tinh chế curcumin 39Bảng 4.6 Bảng kết quả định tính curcuminoid bằng các phản ứng với các dungdịch 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây nghệ vàng 3

Hình 2.2 Curcumin 7

Hình 2.3 Demethoxy curcumin 7

Hình 2.4 Bis-demethoxy curcumin 7

Hình 2.5 Sơ đồ trích ly curcuminoid [10] 13

Hình 2.6 Sơ đồ thiết bị HPLC 21

Hình 3.1 Hệ thống máy cô quay chân không 31

Hình 4.1 Ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian tới quá trình trích ly 34

Hình 4.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tới quá trình trích ly 36

Hình 4.3 Ảnh curcuminoid tinh chế 38

Hình 4.4 Peak sắc kí đồ curcuminoid trong bột nghệ 41

Hình 4.5 Peak sắc kí đồ curcuminoid trong sản phẩm trích ly 42

Hình 4.6 Peak sắc kí đồ curcuminoid trong sản phẩm tinh chế 43

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

Từ lâu , con người đã biết sử dụng tất cả mọi thành phần của cây nghệ đểlàm thuốc chữa bệnh, làm gia vị, làm phẩm màu cho việc chế biến thực phẩm.Trong y học cổ truyền, con người còn biết dùng nghệ để chữa các bệnh như:bệnh vàng da, bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh về da, bong gân, viêm, bệnh cúm.Trong y học hiện đại, đã có hàng ngàn công trình nghiên cứu về thành phần hóahọc cũng như chiết tách các chất trong củ nghệ và người ta đã phát hiện ra rằng,hoạt chất Curcuminoid trong nghệ có tác dụng kháng nấm, diệt khuẩn, diệt kýsinh trùng, chống viêm nhiễm và bảo vệ da Ngoài ra, Curcuminoid được coi làchất tiêu biểu cho các chất phòng chống ung thư thế hệ mới: hiệu lực, an toàn vàkhông gây tác dụng phụ, chỉ tác động lên tế bào ung thư mà không ảnh hưởngđến tế bào lành tính và có khả năng loại bỏ các loại men gây ung thư nhưCOX-1, COX-2 có trong thức ăn, nước uống Hiện nay do hoạt tính sinh họcquý giá của hợp chất này nên việc tách chiết và sử dụng của curcuminoid đangđược nhiều nước tiếp tục nghiên cứu [20].

Curcuminoid đã được Vogel tìm ra từ năm 1842, nhưng phải 100 nămsau một phòng thí nghiệm ở Đức mới lần đầu tiên tách chiết được nó Ngày nay,việc tách chiết chất này trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp sắc ký đã trởnên quen thuộc, hầu như phòng thí nghiệm nào có đủ điều kiện là làm được Ởnước ta, phòng thí nghiệm của Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay là Đạihọc Khoa học tự nhiên) do GS Phan Tống Sơn đứng đầu, đã tách chiết thànhcông curcuminoid từ cuối thập niên 70 của thế kỷ trước Nhưng để chiết xuấtcurcuminoid trên quy mô công nghiệp thì hoàn toàn không dễ dàng, đòi hỏinhiều điều kiện cực kỳ khó khăn Bắt đầu từ năm 1990 cho đến năm 1998, côngtrình nghiên cứu “Chiết xuất hoạt chất curcumin từ nghệ vàng” của TS.PhạmĐình Tỵ đã được nghiệm thu và được các nhà chuyên môn đánh giá cao Nhóm

nghiên cứu của TS.Phạm Đình Tỵ đã tạo ra 2 chế phẩm TNV-999 vàTNV-999-AC gọi chung là bột đường tinh nghệ chứa Curcumin độ tinh khiết92,5% [8] Năm 2012, chị Bùi Hải Yến khóa 53 đã thực hiện đề tài “Tìm hiểucác phương pháp tách chiết curcumin từ củ nghệ vàng”, tuy nhiên đề tài này mớichỉ là bước đầu trong việc tìm ra phương pháp phù hợp nhất để tách chiết đượcsản phẩm có hàm lượng curcumin cao Do đó, để thu được kết quả tốt và mở

rộng hướng nghiên cứu, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số yếu

tố ảnh hưởng đến khả năng trích ly và tinh chế dẫn xuất Curcuminoid từ củ nghệ vàng Curcuma Longa L”

1.2 Mục đích – Yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu khả năng trích ly của một số loại dung môi và kết tinh dẫn

xuất curcuminoid từ củ nghệ vàng Curcuma longa L

1.2.2 Yêu cầu

Xác định các chỉ tiêu hóa lý của củ nghệ tươi và bột nghệ

Xác định loại dung môi phù hợp trích ly curcuminoid từ bột nghệ

Xác định phương pháp tinh chế curcuminoid

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây nghệ

2.1.1 Nguồn gốc - phân bố

Nghệ - curcuma là một chi thuộc họ gừng (Zingiberaceae) Curcuma là

tên Latin xuất phát từ từ “Kourkoum”, một từ mang gốc Ả Rập nghĩa là “có màuvàng” Ngày nay nghệ vàng được trồng ở Ấn Độ, Pakistan, Malaysia, Myanmar,Việt Nam, Thái Lan, Philippines, Nhật, Trung Quốc, Hàn Quốc, Sri Lanka,Nepal, những hòn đảo ở Nam Thái Bình Dương, Đông và Tây Phi, các đảo ởbiển Caribbean, Châu Mỹ, nhưng Ấn Độ vẫn là nơi sản xuất và xuất khẩu nghệ

vàng chủ yếu hiện đại [3]

2.1.2 Đặc điểm

Nghệ là cây thân thảo mộc, cao 0.6 – 1m Lá có hình dải trái xoan, dài45cm, rộng 18cm, hai mặt nhẵn Cuống lá có bẹ mang lông Hoa mọc từ giữacác lá, hợp thành bông hình trụ, mang cán dài Lá bắc có màu trắng hay hơi lục,các lá bắc trên phớt nhạt tím, đài không đều, tràng hao hình ống không đều, thùygiữa lớn hơn và có mũi nhọn, bầu có lông, vòi nhẵn, quả nang 3 ô mở bằng van

Thân rễ gọi là khương hoang, rễ củ gọi là uất kim Củ chắc và nặng, dài

2 – 5cm, đường kính 1 – 3cm Mặt ngoài xám nâu, nhăn nheo, đôi khi còn lạivết thâm của nhánh và rễ phụ Củ có mùi thơm hắc, vị cay Cắt ngang củ thấy rõhai vùng: vỏ và trụ giữa Trụ giữa chiếm chừng 2/3 bán kính củ [18]

2.1.3 Thành phần hóa học

Thành phần trong củ nghệ vàng gồm có: chất màu curcumin(Curcuminoids), tinh dầu nghệ dễ bay hơi, chất xơ, chất khoáng, protein, chấtbéo, lượng ẩm và carbohydrate [20]

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của củ nghệ vàng Thành phần của củ nghệ vàng Turmeric

Curcumin (Curcuminoids) 2 – 8 %Tinh dầu (Volatile essential oil) 3 – 7 %

2.1.4 Dược tính

Củ nghệ được biết đến với nhiều công dụng khác nhau, đặc biệt được Ấn

Độ và nhiều nước cả phương Đông lẫn phương Tây sử dụng như một loại dượcliệu trị bách bệnh Theo hội đồng nghiên cứu Trung ương, củ nghệ có thể chữađược nhiều bệnh Củ nghệ có thể chữa bệnh hen suyễn, ho, trị cảm, nghiện rượu,mụn và các bệnh ngoài da, củ nghệ có thể giảm viêm nhiễm, trị to gan và nhiễmtrùng bàng quang, rối loạn kinh nguyệt, tăng cường sức khỏe cho tim Củ nghệngâm với nước và mật ong giúp lợi tiểu hoặc nghiền nghệ với bơ đã qua lọc sạch

có thể chữa bệnh tiểu đường Ngoài ra củ nghệ còn giúp trị đau răng và ngừa sâurăng, giảm đau bao tử, giúp tiêu hóa và tạo cảm giác thèm ăn Nhỏ nước nghệ đãđun sôi vào mũi chữa đau đầu và chữa mất ngủ [3]

Củ nghệ không chỉ có công dụng giúp liền sẹo như nhiều người đã biết,

mà còn mang lại rất nhiều tác dụng hữu ích, đặc biệt đối với sức khỏe conngười Giúp giảm cân, lưu thông và lọc máu, giúp cơ thể chống lại các vi khuẩnsống ký sinh trong ruột, đặc biệt tốt cho hệ tiêu hóa, mới đây người ta đã chứngminh được rằng có thể sử dụng nghệ để chống ung thư và nghệ có khả năngkháng viêm, giảm nguy cơ nhiễm trùng, có thể dùng nghệ để khử trùng và làmmau lành vết thương [17]

Khi gặp rắc rối về tiêu hóa, nghiên cứu cho thấy nghệ có thể kích thíchtiêu hóa và giải phóng các enzyme tiêu hóa, phá vỡ liên kết cacbonhydrat và cácchất béo Chính vì thế, trong trường hợp bị đau bụng một cốc trà nghệ sẽ giúpích rất nhiều

Chất curcuminoid có tự nhiên trong củ nghệ từng được các nhà khoa họcchứng minh là một chất chống oxy hóa cực mạnh có lợi cho sức khỏe, có lợi chotim mạch, chống cholesterol và ung thư

Nghệ có thể làm giảm hàm lượng cholesterol độc hại trong máu và có khảnăng chống lại chứng xơ vữa động mạch, curcuminoid có trong nghệ cho phépgiảm nguy cơ mắc bệnh nhồi máu cơ tim, đặc biệt là ở những người hay ngáyngủ Nếu chất curcuminoid được ứng dụng thành công đối với con người, nó sẽmở ra một hướng đi mới cho cách phòng và điều trị bệnh nhồi máu cơ tim đồngthời bảo vệ sức khỏe tim mạch chúng ta Khác với hầu hết các hợp chất tự nhiên

khác với hiệu quả hạn chế, chất curcuminoid có tác dụng trực tiếp lên nhân tếbào bằng cách ngừa sản sinh quá nhiều protein bất thường

Curcuminoid có tác dụng kháng ung thư, cô lập và tiêu hủy tế bào ungthư Curcuminoid là một thành phần đặc biệt làm nên màu vàng đặc trưng củanghệ có khả năng tiêu diệt hai loại protein trong các tế bào ung thư, các proteinnày chính là nguồn duy trì sự tồn tại của chúng Nghệ cũng giúp ngăn chặnkhông cho tế bào ung thư lan tràn đi khắp nơi trong cơ thể (chống di căn) Ngoài

ra nghệ cũng rất an toàn và không có phản ứng phụ Các bác sĩ ở bệnh việnUniversity of Texas MD Anderson Cancer Center, một bệnh viện chuyên vềchữa trị các bệnh ung thư vào bậc lớn nhất thế giới, sau khi đã bỏ ra nhiều nămnghiên cứu và thử nghiệm, đều đồng thanh xác nhận rằng: thuốc bào chế bằng

củ nghệ có tác dụng chống oxy hóa cực mạnh rất công hiệu để chống lại sự pháhoại của gốc tự do và giúp tăng cường hệ thống miễn nhiễm cho nên họ đãkhuyên bệnh nhân ung thư nên dùng nghệ hằng ngày [3,1]

Có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh củ nghệ, bột nghệ vàcurcuminoid có công dụng tốt đối với sức khỏe, tuy nhiên chúng ta không nênxem đây là thần dược, vì nó chỉ có tác dụng khi uống đều đặn và vừa phải trongmột thời gian dài [20]

2.2 Tìm hiểu về curcuminoid

2.2.1 Giới thiệu về curcuminoid

Danh pháp IUPAC: heptadiene-3,5-dione [19,20]

(1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6 Công thức phân tử: C21H20O6

- Phân tử gam: 368,38 g/mol

- Điểm nóng chảy: 183oC

2.2.2 Đặc điểm của curcuminoid

Curcuminoid là hợp chất được chiết từ củ nghệ (Curcuma Longa L) – mộtloài cây phân bố ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở Châu Á và đượcdùng như một loại gia vị Curcuminoid có dạng bột màu vàng, là thành phần chủyếu tạo nên màu vàng cho nghệ [11]

Curcuminoid tương đối trơ và không gây độc đối với cả động vật lẫn conngười ngay cả với lượng lớn Theo nghiên cứu của Liang Shen và Hong-Fang Ji

năm 2007, curcuminoid không gây độc với người với lượng lên tới 10g/ngày[12].

2.2.3 Các thành phần và các dạng đồng phân của curcuminoid

Thành phần của curcumin trên thị trường ngoài thực chất còn có một sốloại chất màu khác cùng đem lại màu vàng cho nghệ gọi chung là curcuminoid.Curcuminoid là các dẫn xuất dicinnamoylmethane Curcuminoid gồm 3 thànhphần chính [19]:

1) Curcumin 3,5-dione] (công thức phân tử: C21H20O6, khối lượng phân tử: 368) (Cur)

[1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-Hình 2.2 Curcumin

2)

Demethoxycurcumin1-(4-Hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione](DMC) (công thức phân tử:

C20H18O7, khối lượng phân tử: 338)

Hình 2.3 Demethoxy curcumin

3) Bis-demethoxy 3,5-dione](công thức phân tử: C19H16O7, khối lượng phân tử: 308) (BDMC)

curcumin[1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-Hình 2.4 Bis-demethoxy curcumin

Mỗi thành phần kể trên còn có các đồng phân hình học: s-cis-diketone,s-transdiketone, cis-cisenol.Ngoài ba thành phần chính ở trên, mỗi thành phầnnhỏ còn có thể chia thành các thành phần nhỏ hơn là các đồng phân hình học củachúng Curcuminoid tồn tại ở 3 dạng đồng phân: cis-diketone, trans-diketone vàenol.

2.2.4 Tính chất hóa học

2.2.4.1 Sự điện ly

Trong môi trường pH < 1, curcuminoid có màu đỏ thể hiện trạng tháiproton hóa H4A+ Ở pH từ 1 – 7, hầu hết các diferulolylmethane đều ở dạngtrung hòa H3A, có khả năng hòa tan rất thấp và dung dịch có màu vàng Ở

pH > 7.5, màu dung dịch chuyển sang đỏ Giá trị hằng số phân ly pKa của 3proton dạng acid của curcuminoid (dạng H2A-; HA2; A3-) được xác định tươngứng là 7.8; 8.5 và 9.0 [12]

2.2.4.3 Phản ứng thủy phân trong môi trường kiềm

Curcuminoid tương đối bền ở pH acid nhưng lại nhanh chóng bị thủyphân ở pH kiềm Đầu tiên ferulic acid và ferulolylmethane được tạo thành Sau

đó, eruolylmethane nhanh chóng tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu vàng đếnvàng nâu Tiếp theo, erulylmethane tiếp tục thủy phân tạo ra vanillin và aceton

và lượng cá chất này tăng theo thời gian ủ

Người ta ứng dụng sự thủy phân này của curcumin để sản xuất vanillin vàcác loại hương thiên nhiên khác

Erika Pfeiffer tiến hành ủ các hỗn hợp curcuminoid có tỷ lệ 3 thành phầncurcuminoid khác nhau trong hệ đệm phosphate pH = 7.4 trong điều kiện có vàkhông có huyết thanh Kết quả cho thấy curcuminoid bị thủy phân nhanh chóngtrong môi trường không có huyết thanh Độ bền của các curcuminoid cũng khácnhau: kém bền nhất là curcumin và bền nhất là BDMC (Bis-demethoxy

curcumin) Kết quả HPLC cho thấy sản phẩm phân hủy của quá trình này là:vanillin, feruolylmethane và trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal [12].

2.2.4.4 Phân hủy dưới tác dụng ánh sáng

Curcuminoid không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch .Curcuminoid bị phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng ngay cả ở dạng rắn Sảnphẩm phân hủy là vanillin, vanillin acid, ferulic aldehyde và ferulic acid [15]

Khi bị chiếu xạ, curcuminoid bị đóng vòng hoặc phân hủy thành vanillicacid, vanillin và ferulic acid [11]

2.2.4.5 Phản ứng với kim loại

Curcuminoid là hợp chất β-diketone cho nên cũng có tính chất hóa họccủa một β-diketone Proton của nhóm methyl ở dạng keto và proton của nhómhydroxyl ở dạng enol của hợp chất β-diketone có tính acid Khi các hydro nàybứt ra diketone sẽ tạo thành anion 1,3-diketonate Diketonate anion này có thểtạo phức vòng càng với các kim loại chuyển tiếp và những nguyên tố phân nhómchính Muối kim loại thường được sử dụng cho phản ứng tạo phức là muốiacetate, clorua, nitrate, sulfate, carbonate của các kim loại chuyển tiếp như: Cu,

Fe, Mn, Zn, V, Ga, In, Ni, Co, Pd, Hg Các phức này cũng có hoạt tính loại bỏgốc tự do được ứng dụng trong ngành dược [13]

2.2.4.6 Phản ứng với nhóm OH

-Một trong những hoạt tính đáng chú ý của curcuminoid là khả năng loại

bỏ gốc oxygen hoạt động và các gốc nitrogen tự do Đó là do thành phần củacurcuminoid có 2 nhóm o-methoxy phenolic OH- đính vào mạch heptadience-dione Các electron chưa liên kết của nhóm OH- liên hợp với vòng benzen làmcho H+ của nhóm này linh động hơn Điều đó giải thích cho tính acid và khảnăng phản ứng với các gốc tự do của curcuminoid [14]

2.2.5 Tính chất vật lý

Curcuminoid được trích ly từ củ nghệ vàng Curcuma Longa L, có dạng

bột màu vàng, điểm nóng chảy 184-185oC

Curcuminoid là chất màu tan trong dầu, ethanol, methanol,dichloromethane, acetone, hầu như không tan trong nước ở môi trường acid vàtrung tính, tan trong môi trường kiềm

Dung dịch curcuminoid trong dung môi hữa cơ có độ hấp phụ cực đại ởbước sóng từ 420 – 430 nm [15]

2.2.6 Ứng dụng của curcuminoid

2.2.6.1 Sử dụng trong y học

Củ nghệ bắt đầu được sử dụng trong y học tại Ấn Độ từ khoảng năm

1900 - TCN để chữa rất nhiều loại bệnh Nghiên cứu của các nhà khoa học vàocuối thế kỷ 20 đã xác định curcuminoid đóng vai trò quan trọng trong các hoạttính sinh học của củ nghệ Nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh như: viêmtủy, ung thư tụy, hội chứng loạn sản tủy, ung thư ruột kết, bệnh vẩy nến, bệnhAlzheimer

Ngoài ra theo nghiên cứu cũng cho thấy curcuminoid có tính chất chốngung thư, chống ôxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máucục bộ và kháng viêm Khả năng kháng viêm có thể là do sự ngăn chặn tổng hợpsinh học của eicosanoit [19]

Curcuminoid là chất huỷ diệt ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế huỷdiệt từng bước các tế bào ác tính Chúng làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngănchặn hình thành các tế bào ung thư mới Trong khi đó các tế bào lành tính không

bị ảnh hưởng Curcuminoid còn có khả năng loại bỏ các loại men gây ung thưnhư COX-1, COX-2 có trong thức ăn, nước uống, vô hiệu hoá các gốc tự dohình thành trong quá trình tự vệ của cơ thể, do bức xạ độc hại cũng như do cácloại sốc thần kinh, thể lực, các độc tố hoá học (dioxin, furan…)

Curcuminoid giúp cơ thể phòng ngừa và chống ung thư Trên thế giới,curcuminoid được coi như vừa là thuốc, vừa là thực phẩm điều trị gần 20 loạiung thư khác nhau Riêng đối với ung thư máu các nhà khoa học cho biếtcurcuminoid có tác dụng tăng hồng cầu, chống suy kiệt sức lực…

Curcuminoid là một chất có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan B, C

và nhiễm HIV do chúng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn như virut HP,viêm gan B, C… rất cao

Rất nhiều bằng chứng cho thấy curcuminoid phát triển chức năng tinhthần, một điều tra trên 1010 người châu Á ăn bột cari vàng (thành phần chính là

bột nghệ) ở độ tuổi 60-93 cho thấy những người ăn ít nhất 1 lần trong 6 thángcho kết quả MMSE cao hơn so với những người không ăn Theo quan điểm củacác nhà khoa học, và một con số rất lớn các nghiên cứu cho thấy curcumin cótác dụng tốt cho não, các notron, giảm stress, trầm cảm, trạng thái lo âu [19].

2.2.6.2 Sử dụng trong mỹ phẩm

Một số nghiên cứu đã chứng minh curcuminoid chống ôxy hoá gấp 300lần vitamin E do đó curcuminoid được ứng dụng trong mỹ phẩm để chống lãohóa da, ngăn ngừa sự hình thành các nếp nhăn, vết nám, làm cho da mịn màng,tươi trẻ

Ngoài ra curcuminoid còn có tác dụng điều hoà huyết áp, hạ mỡ máu,ngăn chặn béo phì, xoá bỏ tàn nhang, đồi mồi, trứng cá, chống rụng tóc giúpmau chóng mọc tóc, làm cho da dẻ hồng hào, tăng cường sắc đẹp, sức lực và cảtuổi thọ…[17]

Curcuminoid có tác dụng làm mau liền sẹo do bị thương, sẹo không bịthâm Trên thị trường hiện nay curcuminoid thường được thêm vào mỹ phẩm kếthợp với vitamin A, E để thành kem, sữa rửa mặt [17]

2.2.6.3 Sử dụng trong công nghiệp màu thực phẩm

Màu vàng của củ nghệ vàng là tổ hợp các chất màu vàng trong nhómcurcuminoid, trong đó 3 chất màu chính là curcumin, demethoxycurcumin vàbisdemethoxycurcumin Curcuminoid là phẩm màu thực phẩm tự nhiên có kýhiệu E100(i), nó đóng vai trò quan trọng trong hai nền công nghiệp lớn: Côngnghiệp dược phẩm và công nghiệp thực phẩm, được dùng để nhuộm màu chonhiều loại thực phẩm khác nhau như dầu, mỡ, nhũ tương mỡ, kem, sản phẩm rauquả, bánh kẹo, bánh mì, thịt, cá, trứng và các sản phẩm từ thịt, cá, trứng, gia vị,súp, nước sốt, đồ uống, đồ ăn tráng miệng [18]

2.2.7 Các phương pháp thu nhận curcuminoid của các tác giả đi trước

Cho đến nay, trên thế giới người ta đưa ra hàng chục công nghệ sản xuấtCurcuminoid từ củ nghệ vàng Sau đây là một số công nghệ chính mà chúng tôi

đã thử nghiệm và đánh giá quá thực tế kết hợp với lý thuyết [13,14]

2.2.7.1 Công nghệ tách chiết Curcuminoid từ nghệ vàng bằng cách tạo phức

với axetat chì

Bột nghệ được chiết bằng alcol etylic Chiết phẩm alcol cô đặc được xử lývới axetat chì 10% để tách Curcuminoid ra khỏi phần nhựa đi theo alcol, dướidạng phức chì – Curcumin.

Xử lý phức CCM Pb(OR)2 với axit sunfric loãng rồi tách Curcuminoid

ra khỏi sulfat chì bằng alcol etylic sẽ thu được Curcuminoid thô Tinh chếCurcuminoid thô bằng ete etylic và carbon disulfur lần lượt sẽ thu được sảnphẩm tinh Curcuminoid

CCM Pb(OR)2 + H2SO4 = CCM + PbSO4 + 2HOR

2.2.7.2 Công nghệ tách chiết Curcuminoid từ nghệ vàng bằng dầu béo

Dựa vào đặc điểm Curcuminoid tan tốt trong dầu, trong rượu, không tantrong nước, công nghệ này cho phép tách hoạt chất bằng rượu hoặc cồn, tinh chếbằng cồn

Công nghệ này có ưu việt ở chỗ không phải dùng đến dung môi độc hại,nhưng hiệu suất thấp [14]

2.2.7.3 Công nghệ tách chiết Curcuminoid từ nghệ vàng bằng kiềm và axit

Sau khi loại chất béo và tinh dầu bằng xăng nhẹ, bột nghệ được chiết bằngmetanol Chiết phẩm metanol được xà phòng hóa bởi dung dịch sút 80% Sau

đó, người ta tủa Curcuminoid bằng cách trung hòa, dùng axit chlohydric loãng

Kết tủa được rửa bằng dung dịch natri bicarbonat NaHCO3 10% Cuốicùng tủa được kết tinh lại bằng methanol [14]

2.2.7.4 Công nghệ tách chiết Curcuminoid từ củ nghệ vàng bằng dung môi hữu cơ

Bột nghệ khô được chiết bằng ligroin để loại chất béo và tinh dầu Sau đó,người ta chiết bằng ete etylic để thu được hỗn hợp Curcuminoid và nhựa Cuốicùng Curcuminoid được tách ra và tinh chế bằng cồn alcol etylic [14]

2.2.8 Quy trình trích ly Curcuminoid

Ete dầuhoả 600C

Dung môi hữa cơ, 600C, 10h

Hình 2.5 Sơ đồ trích ly curcuminoid [8]

Bột nghệ 1

Bột nghệ 2

Xử lý ban đầu, sấy khô ở 600C

Nhựa + tinh dầu

Curcuminoid thô (nhựa + tinh dầu)

Curcuminoi

d tinhNghệ vàng

Bã

Thuyết minh quy trình

- Cân 40g bột nghệ đã sấy khô (có màu vàng sáng) cho vào túi giấy lọc,sau đó cho vào phần hình trụ của bộ chiết soklet

- Tiến hành chiết soxhlet với dung môi hexan để loại bỏ chất béo vàhidrocacbon, bã được sấy khô và chiết soxhlet với dung môi

- Pha dung môi theo các tỷ lệ như bố trí thí nghiệm, dùng đũa thủy tinhkhuấy nhẹ hỗn hợp dung môi cho vào bình cầu của bộ chiết, thể tích dung môiđạt 2/3 thể tích bình cầu Lắp ống sinh hàn hồi lưu và tiến hành đun ở nhiệt độsôi của từng loại dung môi

- Khi đun hơi hỗn hợp dung môi bay lên hòa tan curcuminoid được góitrong túi giấy lọc rơi xuống bình qua ống dẫn hơi ngưng tụ Đun trong khoảngthời gian như phần bố trí thí nghiệm ta thu được dịch chiết có màu nâu đỏ

- Lấy dịch chiết ra khỏi bình cầu và thu hồi dung môi bằng phương pháp

cô quay chân không

Sau khi tách chiết, curcuminoid thô thu được còn lẫn nhiều tạp chất, đem

đi tinh chế lại để thu được curcuminoid tinh

Loại bỏ tạp chất: Dùng hỗn hợp các dung môi như phần bố trí thí nghiệmhòa tan curcuminoid thô, lọc và bỏ dịch lọc Phần chất rắn đem sấy khô ở 60oC

Chất rắn sau khi sấy khô, hòa tan vào cồn tuyệt đối, để loại bỏ những tạpchất không tan được trong hỗn hợp dung môi trên Lọc, ta thu đượccurcuminoid, sau sấy ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút thu được tinh thểcurcuminoid màu vàng, có ánh kim

2.3 Tình hình tách chiết và kết tinh curcuminoid từ củ nghệ vàng tại Việt

Nam

Ở nước ta, phòng thí nghiệm của Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay

là Đại học Khoa học tự nhiên) do GS Phan Tống Sơn đứng đầu, đã tách chiếtthành công curcuminoid từ cuối thập niên 70 của thế kỷ trước Nhưng để chiếtxuất curcuminoid trên quy mô công nghiệp thì hoàn toàn không dễ dàng, đòi hỏinhiều điều kiện cực kỳ khó khăn [8]

Bắt đầu từ năm 1990 cho đến năm 1998, công trình nghiên cứu “Chiếtxuất hoạt chất curcumin từ nghệ vàng” của TS.Phạm Đình Tỵ đã được nghiệm

thu và được các nhà chuyên môn đánh giá cao Nhóm nghiên cứu củaTS.Phạm Đình Tỵ đã tạo ra 2 chế phẩm TNV-999 và TNV-999-AC gọi chung làbột đường tinh nghệ chứa Curcumin độ tinh khiết 92,5% Phối hợp với Học việnquân y, nhóm nghiên cứu đã thử thành công độ an toàn và hiệu lực củaCurcumin Bột đường tinh nghệ đã được đang ký chất lượng tại Sở y tế Hà Nộilàm thực phẩm chữa bệnh Bước đầu đã có nhiều bệnh nhân bị ung thư, bị mắcbệnh viêm đại tràng, dạ dày, thiểu nǎng gan, mật ǎn tinh bột nghệ này có chuyểnbiến tích cực rất rõ rệt Một số người sau khi điều trị bằng tinh nghệ, khối u áctính đã bị thu hẹp, thể trạng tốt hơn Tiếp theo đó, năm 2007 có đề tài “Nghiêncứu tách chiết curcumin từ củ nghệ vàng bằng phương pháp trích ly siêu âm”của các nhà khoa học Trần Trung Kiên, Nghiêm Xuân Sơn, Phùng Lan Hương,Phạm Văn Thiêm, Bộ môn Quá trình thiết bị hóa – Thực phẩm, Trường Đại HọcBách Khoa Hà Nội [6].

Năm 2012, đề tài “Nghiên cứu trích ly hợp chất curcumin trong củ nghệvàng ở huyện Krông Bông, Tỉnh Đăk Lăk”, của Trần Quang Huy,Đào Hùng Cường Tại Khoa Hóa, Trường Đại Học Sư Phạm, Đại Học Đà Nẵngcũng đã thành công [20]

độ sôi của dung môi Cơ sở vật lí của phương pháp là dựa vào định luật Nemst:

Khi thêm một cấu tử thứ ba vào hệ dung dịch có hai cấu tử không tanhoàn toàn vào nhau hoặc tan có giới hạn thì sự hòa tan của cấu tử này vào haicấu tử theo một tỷ lệ nhất định ở nhiệt độ không đổi, gọi là hằng số phân bốNemst K:

K =

C1, C2 là nồng độ của các cấu tử trong dung môi

S1, S2 là nồng độ của hai cấu tử

K càng lớn khi càng lớn thì việc lấy chất rắn ra rất khó khăn, phải dùngdung môi chiết nhiều lần.

Cùng một lượng dung môi để chiết, cần phải chia nhiều lần chiết Có thểtính được lượng chất còn lại sau lần chiết thứ n dựa vào hằng số Nemst:

Gn = G0(

Gn là lượng chất còn lại sau n lần chiết

G0 là lượng chất ban đầu có trong thể tích V

S là số ml thể tích dung môi cho vào

Như vậy, muốn Gn càng nhỏ thì n phải lớn và S phải nhỏ, nghĩa là chấtđịnh chiết ra còn lại trong định chiết ra còn lại trong dung dịch càng nhỏ thìcũng một lượng dung môi cần phải chiết nhiều lần [2]

2.4.1.2 Lựa chọn dung môi khi chiết.

Dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau:

- Dung môi chiết phải hòa tan chất định chiết lớn hơn dung môi cũ

- Không trộn lẫn với dung môi cũ, nghĩa là có tỉ khối khác nhiều vớidung môi cũ

- Dung môi này dễ tách ra khi tinh chế lại và ít có khả năng tạo nhũtương và ít độc

Khi lựa chọn dung môi chiết phải chú ý đến độ tan của chất vào dungmôi Độ tan của chất phụ thuộc vào bản chất của chất tan, bản chất của dungmôi, nhiệt độ và bề mặt tiếp xúc giữa chất tan và dung môi Vì vậy, khi chiếtngười ta thường lắc kĩ Tuy nhiên, nếu có hiện tượng tạo huyền phù , nhũ tươngkhi lắc thì phải phá sự tạo huyền phù

2.4.1.3 Kĩ thuật chiết chất rắn

Phương pháp đơn giản là ngâm chiết chất rắn trong dung môi hoặc hòatan trong dung môi ở nhiệt độ thường hay nhiệt độ sôi của dung môi, sau đó lọchoặc gạn lấy dung dịch Muốn lấy chất từ dung dịch thì cất đuổi dung môi ởmáy cô quay chân không bằng các phương pháp thông thường Sự chiết chấttrong hỗn hợp rắn phụ thuộc nhiều vào độ hòa tan của các chất trong dung môi

và nhiệt độ Để tăng khả năng chiết, người ta thường phải nghiền nhỏ chất rắnrồi ngâm chiết ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ sôi của dung môi.

Trong phòng thí nghiệm thường chiết bằng bộ chiết Soklet để chiết liêntục Chất rắn định chiết đã nghiền nhỏ được gói trong giấy lọc (túi vải) đặt vàophần hình trụ trên bình cầu của máy chiết Cho dung môi vào bình cầu (tùythuộc vào lượng chất chiết mà cho lượng dung môi khoảng ½ thể tích bình cầu),lắp ống sinh hàn hồi lưu ở trên rồi đun sôi dung môi Hơi nước bay lên và hòatan chất rắn trong bọc giấy lọc rơi xuống bình cầu trong ống dẫn hơi ngưng tụ

Cứ như vậy nồng độ của chất tan trong dung môi tăng dần theo thời gian đun hồilưu Nếu chất tinh chế hòa tan vào dung môi thu được dung dịch chất tinh chiếttrong bình cầu, cô quay đuổi dung môi rồi kết tủa lại chất rắn Nếu trong hỗnhợp chất rắn, các chất bẩn hòa tan vào dung môi thì phần chất rắn sẽ được làchất sạch Nếu chất tan là chất phụ và chất tinh chế sẽ còn lại trong bình chiếtchỉ việc lấy chất rắn trong giấy lọc ra, làm khô sẽ thu được chất sạch

2.4.2 Phương pháp kết tinh lại

2.4.2.1 Định nghĩa

Đây là phương pháp quan trọng nhất để tinh chế các chất rắn Cơ sở lýthuyết của phương pháp là dựa vào sự khác nhau về độ tan của các chất trongmột dung môi hay hệ dung môi ở các nhiệt độ khác nhau, cũng như sự khácnhau về độ tan vào dung môi của chất tinh chế và chất bẩn ở cùng một nhiệt độ.Quá trình chung là hòa tan chất rắn thành dịch bão hòa ở nhiệt độ sôi của dungmôi và khi để lạnh thì chất rắn kết tinh lại dưới dạng tinh khiết [2]

2.4.2.2 Chọn dung môi

Người ta phải chọn dung môi hay hệ dung môi thích hợp để hòa tan chấttinh chế ở nhiệt độ sôi và không tan hoặc hòa tan ít ở nhiệt độ lạnh, còn tạp chấtthì hiện tượng ngược lại Sau khi lọc nóng loại bỏ tạp chất thì chất rắn sẽ kết tinhlại sạch hơn

Việc lựa chọn dung môi kết tinh rất quan trọng Dung môi kết dính phảikhông tương tác hóa học với chất kết tinh ở nhiệt độ thường cũng như ở nhiệt độsôi Dung môi phải có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của chất tinhchế ít nhất là 10oC và lại phải giải phóng khi lọc cũng như khi rửa Việc lựachọn dung môi hay hệ dung môi phải dựa vào mối quan hệ cấu tạo phân tử củachất kết dính và dung môi, thường thường chất phân cực thì hòa tan vào dung

môi phân cực và ngược lại Khi chất kết tinh rõ cấu tạo thì phải thử hòa tantrong dung môi từ không phân cực đến dung môi phân cực Cách làm như sau:lấy một vài tinh thể vào ống nghiệm, nhỏ một ít dung môi vào rồi đun sôi, quansát độ tan cho đến khi tinh thể tan hết, nếu đảm bảo yêu cầu trên thì chất sẽ kếttinh lại khi lạnh Dung môi được xem là tốt nếu cứ 0,1g chất kết tinh tan trong1ml dung môi nóng.

Khi không chọn được dung môi thì bắt buộc phải chọn hệ dung môi.Nguyên tắc: lấy một ít dung môi hòa tan chất kết tinh ngay ở nhiệt độ thường,sau đó chọn một dung môi không hòa tan hay kém hòa tan chất tinh chế nhưngphải tan trong dung môi trên Cách làm như sau: Lấy một vài tinh thể vào ốngnghiệm, thêm dung môi cho đến khi tan hết, ghi lại thể tích dung môi Nhỏ từ từdung môi không tan chất tinh chế vào hỗn hợp trên cho đến khi vẩn đục, ghi lạithể tích dung môi, đun hỗn hợp cho tan hết, lọc nóng nguội, chất rắn sễ kết tinhlại Tỉ lệ hai thể tích đã đo được coi là tỉ lệ thể tích dung môi đã chọn Thườngchọn hệ dung môi ethanol – nước; etanol – benzene; axeton – ete dầu hỏa; acidaxetic – nước,…

Nếu có nhiều chất có độ tan khác nhau ở nhiệt độ khác nhau vào mộtdung dịch, người ta dùng phương pháp kết tinh phân đoạn Ở một nhiệt độ xácđịnh, một chất nào đó tan quá bão hòa sẽ kết tinh lại khi để lạnh, còn chất kiachưa bão hòa sẽ ở lại trong dung dịch

Nếu dung môi hòa tan chất kết tinh, còn chất bẩn không hòa tan, người ta

sẽ lọc nóng để loại bỏ chất bẩn, còn chất kết dính ở lại trong dung dịch sẽ kếttinh khi để lạnh [2]

2.4.2.3 Các thao tác khi kết tinh

- Chuẩn bị dung dịch kết tinh hay dung dịch nước cái

Cho một lượng chất cần kết tinh vào bình cầu hai cổ lắp ống sinh hànhồi lưu và phễu chiết đựng dung môi hoặc bình tam giác có sinh hàn hồilưu, thêm đá bọt rồi cho dung môi vào ít hơn một lượng ít theo lượng tínhtoán, đun sôi Nếu sôi mà chưa tan hết thì thêm một ít dung môi vào chođến khi chất tan hoàn toàn, chất bẩn sẽ không tan

Nếu dùng hỗn hợp dung môi thì cho dung môi tan tốt vào trước chođến khi chất rắn tan hoàn toàn rồi thêm dần dung môi hòa tan vào cho đếnkhi chất rắn kết tủa rồi tan ở nhiệt độ sôi Nếu dung dịch có màu, phải thêmchất tẩy màu như than hoạt tính, than xương hay silicagel với tỉ lệ 1/20 hay1/50 Khi cho chất khử màu phải để dung dịch lạnh, không được thêm chấtkhử màu khi dung dịch đang nóng để tránh dung dịch bị trào ra ngoài Sau

đó, đun sôi lại dung dịch trong 2 – 3 phút

- Lọc nóng dung dịch

Lọc dung dịch đang nóng để loại bỏ chất bẩn, chất phụ không tan rakhỏi dung dịch Cần lọc nóng bằng phễu, lọc nhanh để tránh chất kết tinh ởtrên phễu

- Tách lọc tinh thể

Tinh thể tinh khiết được lọc nhanh trên phễu Bucsne ở áp suất thấp.Khi lọc cần rửa lại khi kết tủa bằng dung môi lạnh Một số trường hợpngười ta sẽ gạn, lắng Trong trường hợp chất háo nước và dễ bị oxi hóa thìdùng phương pháp riêng

- Làm khô tinh thể

- Có thể làm khô tinh thể trong không khí hay tủ sấy thường hoặcsấy chân không Chú ý làm khô trong tủ sấy cần để nhiệt độ thấp hơn nhiệt

độ nóng chảy của chất khoảng 20oC Cũng có thể làm khô tinh thể bằng gió củamáy sấy tóc [2, 5]

2.5 Tìm hiểu về HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao)

2.5.1 Sơ lược về HPLC

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đàu tiên bằng tiếng anh của phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography),trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High pressure LiquidChromatography)

Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến

từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càngphát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạomáy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong ngày kiểm nghiệm đặc biệt làứng dụng cho các ngành kiểm nghiệm thuốc và nó hiện là công cụ đắc lực trongphân tích các thuốc đa phần cho phép định tính và định lượng

Khái niệm: Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong

đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phânchia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, haymột chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay phânloại theo kích cỡ [4, 10]

2.5.2 Tìm hiểu về hệ thống HPLC

Máy HPLC gồm các bộ phân cơ bản tóm tắt trên sơ đồ sau:

Hình 2.6 Sơ đồ thiết bị HPLC

- Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao ápcho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo

tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ dung môi của 4 đường là 100%

- Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dungmôi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa 3 và 2 đường để cho hệ phađộng luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trìnhrửa giải ổn định

- Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradialdung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn

Lưu ý:

+ Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và cóghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích

+ Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng

la hóa chất tinh khiết phân tích

Sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký haynhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích

Trong trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

3 Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký:Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 250 at – 250 at (1at = 0,98 bar) và pumpphải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 – 9,999 ml/phút

Máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar (khoảng

420 at) Tốc độ dòng chảy 0,1 – 9,999 ml/phút

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2Pisstone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.

Chất nhồi cột tùy theo loại cột và kiểu sắc ký

Thông thường chất ngồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc Silicagel đãđược Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữa cơ (pha đảo), ngoài ra người tacòn dùng các loại hạt khác nhau như: Nhôm oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặcthấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt

6 Detector

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệughi trên sắc đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chấtcần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và thỏa mãn điều kiệntrong một cùng nồng độ nhất định của chất phân tích

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các loại Detector sau:

- Detector quang phổ tử ngoại 200 – 380nm để phát hiện UV

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – VIS): 190 – 900nm đểphát hiện các chất hấp thụ quang Đây là loại thông dụng nhất.

- Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang

tự nhiên cũng như các dẫn xuất có huỳnh quang, là loại Detector có độ chọn lọccao nhất

- Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array (Detector tán xạ bay hơi)các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấpthụ cực đại của các chất

7 Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang

- Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký

đồ, thời gian lưu, diện tích peak, chiều cao

- Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thểlưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ

số phân giải trong quá trình đồng thời xử lí, tính toán các thông số theo yêu cầucủa người sử dụng

8 In kết quả

Sau khi phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ragiấy để hoàn thiện hồ sơ

PHẦN THỨ BA ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường: cốc thủy tinh, đũa thủy

tinh, phễu, giấy lọc,…

- Cân điện tử

- Máy li tâm

- Máy đo HPLC

- Máy đo quang phổ

- Máy cô quay chân không

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Bộ môn Hóa Sinh-Công nghệ sinh học thực phẩm và Bộ môn Công nghệchế biến Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội

Thời gian bắt đầu từ 15/07/2013 – 30/05/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát chung về nguyên liệu

Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Xác định độ tro của nguyên liệu

Xác định các thành phần hóa học chính của nguyên liệu: hàm lượngxenluloza và hàm lượng lipid

3.3.2 Khảo sát khả năng trích ly curcuminoid từ bột nghệ của một số loại dung môi

Nghiên cứu lựa chọn dung môi tối ưu cho quá trình trích ly curcuminoid.Nghiên cứu lựa chọn thời gian tối ưu cho quá trình trích ly curcuminoidbằng dung môi hữu cơ.

Nghiên cứu chọn lựa tỷ lệ nguyên liệu/dung môi phù hợp

3.3.3 Lựa chọn phương pháp tinh chế curcuminoid cho hiệu suất và chất lượng tốt nhất

Nghiên cứu lựa chọn dung môi phù hợp cho tinh chế curcuminoid

Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi phù hợp cho quá trìnhtinh chế

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp phân tích các thành phần hóa học

3.4.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu

Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy khô đếnkhối lượng không đổi [5]

Cách tiến hành: sấy khô chén sứ trong 15 phút ở nhiệt độ 1050C và đặttrong bình hút ẩm Cân từ 3 – 5g mẫu trong chén Ghi lại cả khối lượng của chén

và mẫu Sấy khô trong lò ở nghiệt độ 1050C cho đến khi đạt khối lượng khôngđổi Để nguội trong bình hút ẩm và ghi lại trọng lượng của mẫu khô Tính toántheo công thức:

W (%) =

Trong đó: D: trọng lượng mẫu khô (g)

M: trọng lượng mẫu tươi (g)

3.4.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số theo TCVN 5611-1991

Đốt cháy và nung mẫu ở nhiệt độ nhất định cho đến khi khối lượng khôngđổi [5]

Cách tiến hành: đặt chén nung vào lò đã được đốt nóng giữ trong 60 phútở nhiệt độ 525 + 25oC, sau đó lấy ra và đặt vào bình hút ẩm Khi nhiệt độ trong

bình hút ẩm ngang với nhiệt độ môi trường xung quanh thì cân chén nung vớisai số không vượt quá ± 0,001g

Tiến hành: Đặt chén nung vào lò đã được đốt nóng giữ trong 60 phút ởnhiệt độ 525 + 25oC, sau đó lấy ra và đặt vào bình hút ẩm Khi nhiệt độ trongbình hút ẩm ngang với nhiệt độ môi trường xung quanh thì cân chén nung vớisai số không vượt quá ± 0,001g Cân mẫu chè sai số không lớn hơn 0,001g, chomẫu chè vào chén nung đã được chuẩn bị sẵn như trên Chén nung có mẫu chèđược đặt lên bếp điện và nung nóng đến nhiệt độ 100ᵒC đến khi mất nước hoàntoàn Đặt chén vào lò nung ở nhiệt độ 525 + 25oC khoảng 60 phút, làm nguộitrong bình hút ẩm đến nhiệt độ môi trường và cân Quá trình này được lặp đi lặplại cho đến khi hiệu của 2 lần cân cuối cùng không quá 0,001g Ghi lại giá trịkhối lượng nhỏ nhất

Tính kết quả: Hàm lượng tro (X) tính bằng phần trăm so với khối lượngchất khô được xác định theo công thức:

X (%) = {(m1.100.100) : [m(100 – W)]}

Trong đó:

m: Khối lượng mẫu cân (g)

m1: Khối lượng tro sau khi nung (g)

W: Hàm lượng nước (%)

3.4.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng xenluloza

Phương pháp định lượng xenluloza dựa vào tính chất của nó trong mộthợp chất bền với tác dụng của axit mạnh và kiềm, không bị phân hủy dưới tácdụng của axit yếu [5]

Cách tiến hành: Cân 0,5 – 1g mẫu đã nghiền nhỏ, sấy khô đến trọng lượngkhông đổi ở 100 – 105ᵒC, cho vào bình nón dung tích 250ml.Thêm vào bình16,5 ml hỗn hợp (15 ml HNO3 + 15 ml CH3COOH đặc) Lắp ống làm lạnh hồilưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút Để nguội, pha loãng hỗn hợp bằngnước nóng Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng Rưa kết tủa xenlulozanhiều lần bằng nước cất nóng, mỗi lần rửa từ 10 – 15ml Rửa bằng rượu etylic96% từ 1 – 2 lần Sau đó rửa bằng ete etylic Sây cắn lọc chứa xenluloza ở nhiệt

độ 100 – 105oC đến khối lượng không đổi (khoảng 2 – 3 h)

Hàm lượng xenluloza được tính theo công thức: (%)

X  m.(100a.10000- W)

Trong đó:

X: hàm lượng xenluloza (%)

a: khối lượng xenluloza thu được (g)

m: khối lượng nguyên liệu đem phân tích (g)

W: độ ẩm nguyên liệu (%)

3.4.1.4.

Phương pháp xác định hàm lượng lipit

Dựa vào tính hòa tan của dầu trong các dung môi hữa cơ (eter, benzene,clorofooc…) để chiết rút dầu ra khỏi nguyên liệu và xác định dầu bằng phươngpháp cân khối lượng [9]

- Chuẩn bị bộ Shoxlet để chiết dầu: Đặt bình hứng lên nồi cách thuỷ Lắpbình chiết khớp với miệng của bình hứng; đặt bao đựng mẫu vào đáy của bìnhchiết Có thể đặt nhiều bao mẫu nhưng không để vượt quá chiều cao ốngXiphon Lắp ống sinh hàn khớp với miệng bình chiết Đặt phễu thuỷ tinh lênmiệng ống sinh hàn Lắp các ống cao su theo nguyên tắc bình thông nhau, mởmáy nước để nước máy chảy vào hệ thống sinh hàn Đổ ete qua phễu thuỷ tinhsao cho lượng ete đủ ngập mẫu và chiếm khoảng 2/3 dung tích của bình đun

Kiểm tra toàn bộ hệ thống Shoxlet Nếu máy đã được lắp kín, dung môikhông thoát ra ngoài, hoàn thành công tác chuẩn bị.

- Chiết dầu: Bật bếp cách thuỷ ở nhiệt độ 45 – 500C để đun sôi ete ở bìnhhứng Khi ete ở bình bắt đầu sôi, điều chỉnh dòng nước máy chảy qua hệ thốngsinh hàn Hơi ete theo ống đi lên phía trên của bình chiết vào ống sinh hàn, gặplạnh, ngưng thành giọt chảy xuống bình chiết hoà tan lipit trong mẫu Khi mựcete có chứa dầu vượt quá chiều cao ống Xiphon, ete được hút xuống bình đun

Ở bình hứng ete lại được đun sôi và bay hơi, tiếp tục theo ống lên bình chiết, lặplại các quá trình như trên

Thời gian chiết rút dầu từ 7 – 8h Sau đó tháo bình ra, hứng vài giọt etelên lam kính, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để hơi ete bay hết, soi kính, nếu lamkính trong suốt chứng tỏ dầu trong mẫu đã được chiết hết Tắt bếp cách thuỷ,khoá máy nước, tháo ống sinh hàn, dùng đũa thuỷ tinh gắp gói mẫu ra khỏi bìnhchiết, đặt trên đĩa Petri để trong tủ hở hay nơi thoáng gió để ete bay hơi Sấy khôgói mẫu ở nhiệt độ 1050C cho đến khi khối lượng không đổi (khoảng 30 phút),

để nguội trong bình hút ẩm Cân xác định khối lượng gói mẫu đã chiết rút dầu ở

độ khô tuyệt đối (Cc)

- Kết quả được tính theo công thức:

W) - C.(100

0 Cc).100.10 -

(Cm



X

Trong đó:

X: hàm lượng dầu có trong mẫu ở độ khô tuyệt đối (% chất khô)

Cm: Khối lượng gói mẫu ở độ khô tuyệt đối (g)

Cc: Khối lượng gói mẫu đã chiết dầu ở độ khô tuyệt đối (g)

C: Khối lượng mẫu đem phân tích (g)

W: Độ ẩm nguyên liệu (%)

3.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.4.2.1 Lựa chọn dung môi cho quá trình trích ly curcuminoid

Để khảo sát khả năng trích ly curcuminoid từ bột nghệ chúng tôi dựa trênnguyên tắc: Khi nghiên cứu ảnh hưởng của một yếu tố nhất định thì các thínghiệm đều được tiến hành ở cùng các điều kiện công nghệ (trừ yếu tố đangđược khảo sát) Sau khi đã chọn được giá trị thích hợp của các yếu tố đã đượcnghiên cứu thì giá trị đã lựa chọn được cố định trong các thí nghiệm tiếp theo đểkhảo sát ảnh hưởng của các yếu tố còn lại

Các yếu tố công nghệ được khảo sát là: loại dung môi, tỷ lệ nguyênliệu/dung môi, thời gian trích ly

Việc lựa chọn các giá trị thích hợp của các yếu tố công nghệ dựa vào kếtquả đo mật độ quang của dịch chiết curcuminoid

Thí nghiệm 1: Xác định loại dung môi trích ly

Chuẩn bị 5 mẫu và tiến hành khảo sát với 5 loại dung môi khác nhau:Acetone, etylaxetat, acetone/etylaxetat với các tỷ lệ 1/5; 2/5; 3/5

Thí nghiệm 2: Xác định thời gian trích ly

Chuẩn bị 8 mẫu và tiến hành khảo sát thời gian trích ly là : 5h; 6h; 7h; 8h;9h; 10h; 11h

Thí nghiệm 3: Xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Chuẩn bị 4 mẫu, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi khảo sát là: 40g/180ml; 40g/200ml; 40g/220ml; 40g/240ml.

3.4.2.2 Lựa chọn phương pháp tinh chế curcuminoid

Để lựa chọn phương pháp tinh chế curcuminoid cho hiệu suất và chấtlượng tốt nhất, chúng tôi dựa trên nguyên tắc: Với mỗi yếu tố nhất định thì cácthí nghiệm đều được tiến hành ở cùng một điều kiện thí nghiệm Sau đó chúng

ta sẽ lựa chọn yếu tố cho giá trị thích hợp so với các yếu tố còn lại

Nguyên tắc của phương pháp: Sử dụng thiết bị cô quay chân không đểlàm giảm thể tích dung môi tại áp suất thấp

Hình 3.1 Hệ thống máy cô quay chân không

Tiến hành lựa chọn với các loại dung môi: Hỗn hợp acetone/ete dầu hỏatỷ lệ 1:1, cồn tuyệt đối, methanol và nước, hexan/ete dầu hỏa tỷ lệ 1:9

Hiệu suất thu hồi curcuminoid sẽ là căn cứ chủ yếu để lựa chọn giá trịthích hợp cho các yếu tố được khảo sát và được tính theo công thức:

Trong đó:

H: Hiệu suất thu hồi curcuminoid (%)

m: Khối lượng curcuminoid thu được (g)

M: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)

M m.100



H

Thí nghiệm 1: Lựa chọn hỗn hợp dung môi acetone/ ete dầu hỏa tỷ lệ 1:1.Thí nghiệm 2: Lựa chọn cồn tuyệt đối.

Thí nghiệm 3: Lựa chọn dung môi methanol và nước

Thí nghiệm 4: Lựa chọn hỗn hợp dung môi hexan/ete dầu hỏa tỷ lệ 1:9.Sau khi lựa chọn được loại dung môi tinh chế curcuminoid cho hiệu suấttốt nhất, chúng tôi sẽ tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của tỷ lệnguyên liệu/dung môi tới hiệu suất tinh chế curcuminoid

Các mức tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nghiên cứu: 1:1g/ml; 1:2g/ml; 1:3g/ml; 1:4g/ml; 1:5g/ml

Dịch curcuminoid thu được từ quá trình trích ly được cho vào bình cầu, từ

đó tiến hành cô quay trong điều kiện chân không Khi sôi, dung môi bay hơi điqua hệ thống làm lạnh và ngưng tụ thành dòng chảy xuống một bình cầu khác.Sau khi dung môi được loại bỏ hết thì còn lại curcuminoid thô trong bình cầu.Sau đó, chúng ta lấy curcuminoid thô này đem kết tinh với các tỷ lệ trên Lọcqua giấy lọc và sấy ở nhiệt độ 60oC thu được curcuminoid tinh chế

3.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng curcuminoid

Curcuminoid thu được sẽ được

đem đi phân tích sắc ký bằng máy sắc

ký lỏng cao áp HPLC của hãng Agilent

1200 series tại Viện Hoá học các hợp

chất thiên nhiên (18A Hoàng Quốc

Việt, Nghĩa Đô, Cầu Giấy, Hà Nội)

Mẫu sắc ký được chạy trong

cột C18, nhiệt độ 350C, thể tích mẫu

phân tích là 5µl, bước sóng hấp thu

UV-VIS 428nm, dung môi ACN/

H2O theo tỷ lệ 65/35 Ảnh 3.2 Máy HPLC – Agilent 1200

3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được tính toán bằng phần mềm Excel

Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình IRISTAT 4.0