khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly lysozyme từ lòng trắng trứng gà

TÓM LƢỢC Đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Lysozyme từ lòng trắng trứng gà” nhằm mục đích xác định nguồn trứng gà có hoạt tính tổng của Lysozyme từ dịch trí

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ths VÕ VĂN SONG TOÀN

Cần Thơ, Tháng 12/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ths VÕ VĂN SONG TOÀN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

MAI CHÍ LINH MSSV: 3112479 LỚP: CNSH K37

Cần Thơ, Tháng 12/2014

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY LYSOZYME

TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG GÀ

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

XÉT DUYỆT CỦA BỘ MÔN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 20

TRƯỞNG BỘ MÔN

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, ngoài những cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, lãnh đạo Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến thầy Võ Văn Song Toàn và cô Dương Thị Hương Giang, người đã cho tôi ý tưởng, động lực và tận tình giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô và các anh chị trong phòng Sinh hóa và Công nghệ Protein - Enzyme đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và những lời khuyên hữu ích để tôi thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học khóa 37 đã động viên, khích lệ và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cần Thơ, ngày tháng năm 20

Ký tên

Mai Chí Linh

TÓM LƢỢC

Đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Lysozyme từ lòng trắng trứng gà” nhằm mục đích xác định nguồn trứng gà có hoạt tính tổng của Lysozyme từ dịch trích lòng trắng trứng gà cao và điều kiện tối ưu để trích ly Lysozyme từ lòng trắng trứng gà Kết quả của quá trình khảo sát nguồn trứng gà cho thấy trứng gà Hisex Brown có hoạt tính Lysozyme tổng cao hơn các nguồn trứng gà như gà Ác, gà Tre, gà Ta, gà Isa Brown và gà Tàu Ri vàng Kết quả khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Lysozyme cho thấy khi lòng trắng trứng pha loãng đệm phosphate 0,1M pH = 7 với tỷ lệ 1 : 0,5 giữa lòng trắng trứng và dung dịch đệm

ở nhiệt độ 50 0

C trong thời gian 25 phút thu được hoạt tính tổng của Lysozyme từ dịch trích lòng trắng trứng cao nhất Kết quả chạy điện di SDS-PAGE cho thấy trọng lượng phân tử của Lysozyme từ lòng trắng trứng gà Hisex Brown là 14,4 kDa

Từ khóa: Trích ly, Lysozyme, gà, hoạt tính, Hisex Brown

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về trứng gà 2

2.1.1 Hình thái và cấu tạo 2

2.1.2 Sơ lược về các protein trong lòng trắng trứng 3

2.2 Sơ lược về enzyme Lysozyme 3

2.2.1 Cấu tạo của Lysozyme 3

2.2.2 Sự tương tác giữa các phân tử 4

2.2.2.1 Sự phân cực 4

2.2.2.2 Liên kết hydro 5

2.2.2.3 Liên kết disulfide 5

2.2.3 Cơ chế hoạt động của Lysozyme 6

2.2.4 Hoạt tính của Lysozyme 8

2.2.4.1 Khả năng tiêu diệt vi sinh vật 8

2.2.4.2 Hoạt tính điều biến miễn dịch 9

2.2.4.3 Hoạt tính chống ung thư 9

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme 10

2.2.5.1 Nhiệt độ 10

2.2.5.2 Độ pH 10

2.2.5.3 Nồng độ muối 10

2.2.6 Ứng dụng của Lysozyme 11

2.2.6.1 Trong sản xuất phô mai 11

2.2.6.2 Trong sản xuất rượu vang 11

2.2.6.3 Trong lĩnh vực y dược 11

2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme Lysozyme 12

2.3.1 Trong nước 12

2.3.2 Ngoài nước 12

2.4 Một số phương pháp phân tích 14

2.4.1 Phương pháp Bradford 14

2.4.2 Phương pháp Shugar 15

2.4.3 Phương pháp SDS-PAGE 16

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Phương tiện nghiên cứu 17

3.1.1 Thời gian và địa điểm 17

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 17

3.1.3 Nguyên vật liệu 17

3.1.4 Hóa chất 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 18

3.2.1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Lysozyme từ lòng trắng trứng gà 18

3.2.1.1 Thí nghiệm 1: Chọn nguồn trứng gà khác nhau để trích ly Lysozyme 18

3.2.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát dung dịch đệm để trích ly Lysozyme 19

3.2.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỷ lệ giữa dung dịch đệm với lòng trắng trứng để trích ly Lysozyme 19

3.2.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ để trích ly Lysozyme 20

3.2.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian để trích ly Lysozyme 21

3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Thành phần cấu tạo và hoạt tính Lysozyme của trứng gà từ các giống gà khác nhau 22

4.1.1 Đặc điểm của từng loại trứng gà 22

4.1.2 Thành phần cấu tạo trứng gà 25

4.1.3 Khảo sát hoạt tính Lysozyme từ các nguồn trứng gà khác nhau 26

4.2 Ảnh hưởng một số yếu tố đến quá trình trích ly Lysozyme 27

4.2.1 Ảnh hưởng của pH 27

4.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa lòng trắng trứng với dung dịch đệm 29

4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 30

4.2.4 Ảnh hưởng của thời gian 32

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC…

Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích 1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Bradford, 1976) 2 Xác định trọng lượng phân tử protein bằng phương pháp điện di SDS - PAGE (Laemmli, 1970)

3 Xác định hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Shugar, 1952)

Phụ lục 2: Số liệu thí nghiệm

Bảng 1: Đường chuẩn BSA

Bảng 2: Đặc điểm của từng loại trứng gà

Bảng 3: Hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu của từng loại trứng gà

Bảng 4: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu

Bảng 5: Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng với đệm đến hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu

Bảng 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu

Bảng 7: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu

Phụ lục 3: Phân tích số liệu

1 Đặc điểm của từng loại trứng

2 Hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và

3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu

4 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng với đệm đến hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu

5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu

6 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng, hàm lượng protein, protein tổng và hoạt tính đặc hiệu

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Thành phần cấu tạo của trứng gà 2

Bảng 2: Đặc điểm của protein trong lòng trắng trứng 3

Bảng 3: Các nguồn trứng gà khác nhau 18

Bảng 4: Các dung dịch đệm 19

Bảng 5: Nhiệt độ trích ly 20

Bảng 6: Thời gian trích ly 21

Bảng 7: Màu sắc và khối lượng của từng loại trứng 22

Bảng 8: Thành phần cấu tạo của trứng gà từ các nguồn trứng gà khác nhau 25

Bảng 9: Hàm lượng protein, protein tổng, hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng và hoạt tính đặc hiệu của từng loại trứng 26

Bảng 10: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng protein, protein tổng, hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng và hoạt tính đặc hiệu 27

Bảng 11: Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng với đệm đến hàm lượng protein, protein tổng, hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng và hoạt tính đặc hiệu 29

Bảng 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein, protein tổng, hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng và hoạt tính đặc hiệu 30

Bảng 13: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng protein, protein tổng, hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng và hoạt tính đặc hiệu 32

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cấu tạo của Lysozyme 3

Hình 2 Sự phân cực của Lysozyme 4

Hình 3 Liên kết hydro trong Lysozyme 5

Hình 4 Liên kết disulfide trong Lysozyme 5

Hình 5 Trung tâm hoạt động của Lysozyme 6

Hình 6 Cơ chế hoạt động của Lysozyme 6

Hình 7 Cơ chế hoạt động của Lysozyme 7

Hình 8 Cơ chế hoạt động của Lysozyme 7

Hình 9 Cơ chế hoạt động của Lysozyme 7

Hình 10 Cơ chế hoạt động của Lysozyme 8

Hình 11 Sự thủy phân vi khuẩn 8

Hình 12 Cơ chế phản ứng của thuốc thử Coomassie Brilliant Blue G-250 15

Hình 13 Cơ chế phản ứng của phương pháp Shugar 16

Hình 14 Cơ chế của phương pháp điện di SDS-PAGE 16

Hình 15 Trứng gà Hisex Brown 22

Hình 16 Trứng gà Tàu Ri vàng 23

Hình 17 Trứng gà Tam Hoàng 23

Hình 18 Trứng gà Ác 23

Hình 19 Trứng gà Tre 24

Hình 20 Trứng gà Ta 24

Hình 21 Trứng gà Isa Brown 24

Hình 22 Kết quả chạy điện di SDS-PAGE từ dịch trích lòng trắng trứng 33

CÁC TỪ VIẾT TẮT

AVL Antiviral Lysozyme

BSA Bovine Serum Albumin

CBB Coomassie Brilliant Blue

DNA Deoxynucleic Acid

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Disodium Salt

HIV-1 Human immunodeficiency virus type 1

M lysodeikticus Microccocus lysodeikticus

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Lysozyme là một enzyme có khả năng tiêu diệt vi khuẩn bằng cách thủy phân liên kết giữa NAM và NAG của thành vi khuẩn Gram dương Lysozyme được tìm thấy nhiều trong tự nhiên như sữa, nước mắt, nước bọt và lòng trắng trứng Lysozyme có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như y dược (sản phẩm Lysozyme LZ 90mg có khả năng trị viêm xoang, viêm phế quản và viêm mũi), lên men rượu vang (tiêu diệt nhiều

vi khuẩn ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu như Acetobacter hoặc

Brettanomyces), sinh học phân tử (trích ly DNA từ vi khuẩn Gram dương)

Lysozyme được trích ly từ nhiều nguồn nguyên liệu đặc biệt là lòng trắng trứng

gà Theo số liệu của Tổng cục Thống kê về sản lượng trứng gia cầm ở nước ta năm

2012 (http://nongnghiep.vn/tang-nhanh-san-luong-trung-post116524.html, ngày 26/11/2014) là 7.299,9 triệu quả, từ năm 2010 đến 2012 đã có mức tăng hằng năm khá cao là 11,6% mỗi năm Theo Tổng cục Chăn nuôi (http://nongnghiep.vn/tang-nhanh-san-luong-trung-post116524.html, ngày 26/11/2014), sản lượng trứng gia cầm trong 2 năm liên tiếp như sau: năm 2014 là 9.153 triệu trứng, năm 2015 là 10.526 triệu trứng, tăng trưởng bình quân năm là 13% Lòng trắng trứng gà chiếm 56,8% khối lượng trứng, chứa hàm lượng lớn protein chiếm 9,7 - 10,6% (Bùi Hữu Đoàn, 2009) và trong

đó Lysozyme chiếm đến 3,4% tổng lượng protein có trong lòng trắng trứng (Nakai và Poweri, 1985) Hiện nay, ở nước ta các nghiên cứu về Lysozyme vẫn còn hạn chế và các sản phẩm Lysozyme chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài nên dẫn đến giá thành cao như bột Lysozyme từ hãng Merck (Đức) khối lượng tịnh là 5 gram có giá 3,5 triệu đồng (chưa tính thuế nhập khẩu và giá trị gia tăng)

Với mục đích là tận dụng nguồn nguyên liệu trứng gà dồi dào ở nước ta, mở ra

nhiều nghiên cứu về ứng dụng Lysozyme Từ đó, đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh

hưởng đến quá trình trích ly Lysozyme từ lòng trắng trứng gà” được thực hiện 1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định nguồn trứng gà có hoạt tính Lysozyme cao và mang tính kinh tế

Xác định điều kiện thích hợp để trích ly Lysozyme từ lòng trắng trứng

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về trứng gà

2.1.1 Hình thái và cấu tạo

Trứng gà có hình bầu dục không cân đối (hình Kassini), tức là bầu dục không đều, một đầu tù và một đầu nhọn Trong thực tiễn, hình dạng trứng được biểu hiện bằng chỉ số hình thái: đó là tỷ số giữa đường kính nhỏ/đường kính lớn, chỉ số này biến thiên từ 0,6 (hình bầu dục nhọn) đến 1 (hình cầu) Cũng có thể dùng tỷ lệ ngược lại là đường kính lớn/đường kính nhỏ, khi đó chỉ số dao động từ 1,0 đến 1,45 (Bùi Hữu Đoàn, 2009)

Trứng gồm có 3 phần: vỏ, lòng trắng và lòng đỏ với các tỷ lệ tương đối 1/6/3 Trung bình vỏ cứng chiếm 9,5%, 63% lòng trắng trứng và 27,5% lòng đỏ (Cotterill, 1977) Dưới đây là thành phần hóa học của trứng gà:

Bảng 1: Thành phần cấu tạo của trứng gà

Cấu tạo Thành phần phần trăm (%) Thành phần chính (%)

Vỏ trứng 9,5 Muối vô cơ (91,8)

Protein (6,4) Nước (1,7) Lipid (0,03)

Lòng trắng trứng 63,0 Protein (9,7-10,6)

Lipid (0,03) Carbohydrate (0,4-0,9) Tro (0,5-0,6)

Lòng đỏ 27,5 Protein (15,7-16,6)

Lipid (32,0-35,0) Carbohydrate (0,2-1,0) Tro (1,1)

(*Nguồn: Li-chan el at., 1995)

Khoảng giữa lòng đỏ và vỏ chứa đầy lòng trắng, do nhiều lớp có độ đậm đặc khác nhau tạo thành Ngay dưới lớp màng của trứng là lớp loãng ngoài (khoảng 23% thể tích), sau đó là lớp đặc giữa (57% thể tích) rồi đến lớp loãng giữa (17% thể tích) và lớp đặc trong (3% thể tích) Lòng trắng trứng có màu vàng nhạt, ngoài ra do có nhiều

CO2 nên hơi đục Đặc tính keo của lớp đặc ở giữa của lòng trắng là do có nhiều sợi

động thì lòng trắng đặc trở thành loãng Môi trường lòng trắng trứng có pH kiềm, ở nhiệt độ 600C thì đông lại, biến thành một khối trắng (Bùi Hữu Đoàn, 2009)

2.1.2 Sơ lƣợc về các protein trong lòng trắng trứng

Lòng trắng trứng chứa 9,7% đến 12% là protein (Vadehra và Nath, 1973; Mine, 1995) và có thể được xem như là một hệ thống gồm từ nhiều protein hình cầu trong dung dịch nước Trong lòng trắng trứng có 7 protein chiếm đa số như là Ovalbumin A1

và A2, Ovoglobulin G1, G2 và G3, Ovamucoid và Conalbumin Thành phần và những tính chất của protein từ lòng trắng trứng được tóm tắt qua bảng dưới đây:

Bảng 2: Đặc điểm của protein trong lòng trắng trứng

Protein Thành phần phần

trăm (%)

Trọng lƣợng phân tử (Da)

Điểm đẳng điện Đặc điểm

(*Nguồn: Nakai và Powrie, 1985)

2.2 Sơ lƣợc về enzyme Lysozyme

2.2.1 Cấu tạo của Lysozyme

Lysozyme (E.C.3.2.17, N-acetyl muramyl

hydrolase) là enzyme có khả năng thủy phân vi

khuẩn được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên

Lysozyme là một protein dạng hình cầu được

cấu tạo bởi một chuỗi polypeptide đơn bao gồm

129 acid amin, trong đó acid amin đầu mút N- là

lysine và leucine là acid amin đầu C- Trong

phân tử của Lysozyme có 4 cầu nối disulfite

(S-S), điều này làm cho Lysozyme có khả năng

Hình 1 Cấu tạo của Lysozyme

Hình 2 Sự phân cực của Lysozyme

(*Nguồn: http://www.proteopedia.org/wiki/index.php/Hen_EggWhite_(HEW)_Lysozyme, ngày 20/10 2014)

và có hình dạng tương tự như hình elip trong không gian nhiều chiều có kích thước là 4,5 x 3 x 3 nm

Lysozyme được tìm thấy trong tự nhiên chủ yếu ở dạng monomer và hoạt động tốt hơn ở dạng dimer hoặc multimer Lysozyme đã được chứng minh tồn tại ở dạng dimeric thuận nghịch, điều đó được xảy ra bởi pH, nồng độ hoặc nhiệt độ (Sophianopoulos, 1969) Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng diamin (1,3-diaminopropane, 1,4-diaminobutane và 1,5-diaminopentane) kiềm hãm sự ức chế và bất hoạt Lysozyme, trong khi đó monoamine gây ức chế (Okanojo et al., 2005)

Sự biến đổi về hóa học và nhiệt độ của Lysozyme đã được chứng minh làm tăng khả năng diệt vi khuẩn lên tế bào Gram âm

2.2.2 Sự tương tác giữa các phân tử

2.2.2.1 Sự phân cực

Bản chất của các acid amin trong chuỗi trình tự polypeptide dẫn tới các vùng phân cực và không phân cực trong cấu trúc của Lysozyme Sự hiện hiện của các vùng phân cực và không phân cực là nguyên nhân dẫn đến việc xác định cấu trúc của phân

tử protein khi gấp nếp Vùng không phân cực và vùng phân cực được đánh dấu lần lượt bằng màu xanh và màu đỏ ở hình 2 Vùng không phân cực biểu hiện tính kỵ nước, phân bố bên trong cấu trúc của Lysozyme; trong khi đó, các phần phân cực phân bố với số lượng lớn trên bề mặt của Lysozyme dẫn tới tăng sự tiếp xúc dung môi tan trong nước và thể hiện tính ái nước của Lysozyme

2.2.2.2 Liên kết hydro

Trong các phân tử protein, liên kết hydro góp phần ổn định phân tử protein Trong hình 3, liên kết hydro được thấy trong cấu trúc bậc hai và được đánh dấu bằng màu cam Qua hình 3 cho thấy liên kết hydro giúp duy trì sự bền vững của phân tử protein

2.2.2.3 Liên kết disulfide

Lysozyme chứa 4 liên kết disulfide do 8 gốc acid amin cystein tham gia, được đánh dấu bằng màu vàng Liên kết disulfide giúp ổn định cấu trúc bậc ba của nhiều phân tử protein Liên kết disulfide xuất hiện ở 4 vị trí trong Lysozyme: Cys6 và Cys127, Cys30 và Cys115, Cys64 và Cys80, Cys76 và Cys94

Hình 3 Liên kết hydro trong Lysozyme

(*Nguồn: http://www.proteopedia.org/wiki/index.php/Hen_EggWhite_(HEW)_Lysozyme, ngày 20/10/2014)

Hình 4 Liên kết disulfide trong Lysozyme

(*Nguồn: http://www.proteopedia.org/wiki/index.php/Hen_EggWhite_(HEW)_Lysozyme, ngày 20/10/2014)

2.2.3 Cơ chế hoạt động của Lysozyme

Trung tâm hoạt động của Lysozyme được cấu tạo bởi 2 acid amin là Asp52 (màu

đỏ) và Glu35 (màu xanh)

Cơ chế hoạt động của Lysozyme gồm có những bước sau đây

- Vi khuẩn Gram dương có thành peptidoglycan được cấu tạo từ

N-acetylmuramic acid (NAM) và N-acetylglucosamine (NAG) bởi liên kết β(1,4)

glucoside

Hình 5 Trung tâm hoạt động của Lysozyme

(*Nguồn: http://www.proteopedia.org/wiki/index.php/Hen_EggWhite_(HEW)_Lysozyme, ngày 20/10/2014)

Hình 6 Cơ chế hoạt động của Lysozyme

- Trung tâm hoạt động của Lysozyme gồm Glu35 và Asp52 Glu35 xúc tác quá

trình chuyển từ dạng acetal sang hemiacetal của gốc NAG Asp52 liên kết với nguyên

tử Cacbon 1 của gốc NAM để đảm bảo hóa trị

- Liên kết β(1,4) glucoside giữa gốc NAM và gốc NAG đã bị phá hủy

- Nước sẽ phản ứng với gốc NAM bằng liên kết giữa nhóm OH- với nguyên tử C1 và làm đứt liên kết giữa Asp52 với Cacbon 1 Proton H+

trở về với Glu35 và cấu trúc enzyme phục hồi

Hình 7 Cơ chế hoạt động của Lysozyme

Hình 8 Cơ chế hoạt động của Lysozyme

Hình 9 Cơ chế hoạt động của Lysozyme

- Trung tâm hoạt động của Lysozyme gồm Glu35 và Asp 52 trở về dạng ban đầu

2.2.4 Hoạt tính của Lysozyme

Hoạt tính Lysozyme từ lòng trắng trứng được ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như hệ thống chăn nuôi gà lấy trứng, chế độ dinh dưỡng và cách bảo quản trứng (Kopec et al., 2005; Swierczewska et al, 2003) Thực hiện sự miễn dịch đối với gia cầm chuẩn bị cho quá trình giao phối có khả năng tăng hoạt tính của Lysozyme (Swierczewska et al., 2005)

2.2.4.1 Khả năng tiêu diệt vi sinh vật

Lysozyme có khả năng diệt vi

khuẩn bằng cách thủy phân liên kết

β(1,4) giữa N-acetylmuraminic acid

và N-acetylglucosamine của

peptidoglycan, thành phần cấu trúc

của vách tế bào vi khuẩn (Salton,

1957), đã được nghiên cứu và ứng

dụng như là một chất bảo quản thực

phẩm tự nhiên (Hughey, 1987;

Losso, 2000) Lysozyme diệt vi khuẩn Gram dương như Bacillus stearothermophillus,

Clotridium tyrobutyricum và Clostridium thermosaccharolyticum Ngoài ra, Lysozyme

có thể diệt các nhóm sinh vật gây hại và vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng khi Lysoyzme kết hợp với EDTA, acid hữu cơ hoặc nicin (Losso, 2000) Tương tự, sự liên kết Lysozyme-polysaccharide cũng được nghiên cứu mở rộng để diệt vi khuẩn Gram

âm (Nakamura, 1994) Ibrahim et al (1994) cũng cho rằng khi perillaldehyde kết hợp

Hình 11 Sự thủy phân vi khuẩn

(*Nguồn: Nichola Jane Lawton, 2006)

Hình 10 Cơ chế hoạt động của Lysozyme

với Lysozyme có khả năng chống lại cả vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus

aureus) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli)

Nhiều nghiên cứu cho rằng tính diệt vi khuẩn của Lysozyme không phụ thuộc vào chức năng xúc tác của Lysozyme (Ibrahim, 2001) Sự thủy phân của Lysozyme cho thấy một vài đoạn ngắn peptide có khả năng diệt vi khuẩn (Pellegrini, 1997) Các peptide này tương ứng với acid amin ở vị trí 98-112 (Pellegrini, 2000), 98-108 và 15-

21 (Mine, 2004) có hoạt tính diệt vi khuẩn như E coli và S aureus, các chuỗi peptide

được tổng hợp này không những phá hủy màng tế bào và còn ngăn chặn sự tổng hợp DNA và RNA Ngoài ra có khả năng ngăn chặn chu trình tan tế bào vi khuẩn có nội độc tố do kháng sinh gây ra Điều này được ứng dụng trong việc ngăn chặn nội độc tố

từ vi khuẩn Gram âm trong điều trị bằng kháng sinh (Liang, 2003)

Lysozyme đã được chứng minh về hoạt tính chống virus Nhiều nghiên cứu ứng dụng mang tính cấp thiết của Lysozyme được tìm thấy có hiệu quả trong ngăn chặn nhiều virus lây nhiễm qua da gồm bệnh mụn gộp và thủy đậu (Sava, 1996) Lee-Huang (1999) phát hiện Lysozyme từ lòng trắng trứng gà cũng có hoạt tính chống HIV loại I

2.2.4.2 Hoạt tính điều biến miễn dịch

Lysozyme còn hoạt động như là tác nhân có khả năng điều biến kháng nguyên và tác nhân kích thích miễn dịch Khi kết hợp với liệu pháp miễn dịch thì Lysozyme có hiệu quả trong điều trị bệnh viêm xoang và ổn định sự phản ứng của thể dịch và tế bào của người bệnh viêm cuống phổi Lysozyme làm tăng hoạt tính kháng sinh trong các tế bào lai và tế bào lympho (Sava, 1996) Ngoài ra, hoạt tính kháng khuẩn của Lysozyme

có thể xảy ra thông qua kích hoạt chức năng của đại thực bào

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme

2.2.5.1 Nhiệt độ

Flemming (1922) cho thấy khả năng thủy phân vi khuẩn của Lysozyme bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và liên quan đến khả năng chịu nhiệt của enzyme Lysozyme từ lòng trắng trứng, nước mắt hoặc mô tế bào bị bất hoạt ở 750C trong 30 phút Bordet (1928) cho rằng Lysozyme trong dung dịch acid acetic 2% vẫn còn hoạt tính ở 1000C trong 45 phút nhưng ở môi trường trung tính thì enzyme này bị mất hoàn toàn hoạt tính ở 1000C trong 45 phút Sandow (1926) cho rằng khả năng chịu nhiệt của Lysozyme thay đổi theo độ pH Lysozyme từ lòng trắng trứng bị bất hoạt trong 15 phút ở nhiệt độ 600C và pH 8,0, nhưng tại nhiệt độ này và pH 5,0, trong khoảng thời gian 60 phút thì enzyme không mất hoạt tính

Khả năng chịu nhiệt của Lysozyme là một đặc điểm rất quan trọng Lysozyme ở nồng độ thấp trong đệm phosphate mất 5% hoạt tính ở 800C trong 30 phút và 25% ở

1000C trong 20 phút Lysozyme khi hòa tan với đệm trung tính hoặc đệm acid có khả năng chịu nhiệt tốt lên tới 1000C trong 30 phút Lysozyme mất hoàn toàn hoạt tính ở

pH > 7 và ở nhiệt độ cao (Smolelis và Hartsell, 1951)

2.2.5.2 Độ pH

Độ pH tối ưu để diệt vi khuẩn Microccocus lysodeikticus là pH 6,2 (Boasson,

1938), pH từ 6,05 đến 6,35 (Thompson, 1941), pH 6,5 (Wilson, 1950) và pH 5,3 (Meyer và Hahnel, 1946)

Nồng độ ion H+ tối ưu để diệt vi khuẩn ở pH 6,6, quá trình diệt vi khuẩn giảm ở

pH > 7,0 và pH < 6,2 (Smolelis và Hartsell, 1951)

2.2.5.3 Nồng độ muối

Lysozyme khi cho vào cơ chất vi khuẩn M lysodeikticus trong môi trường nước

thì Lysozyme không thủy phân được vi khuẩn Khi sử dụng saline như môi trường phản ứng thì Lysoysme thủy phân vi khuẩn Fleming và Allison (1922) cho rằng Sodium chloride 0,5% làm tăng quá trình thủy phân vi khuẩn nhưng ở nồng độ cao hơn thì quá trình bị kìm hãm Boasson (1938) cho rằng nồng độ chất điện phân cao gây ra quá trình kiềm hãm Ngoài ra, Boasson cũng phát hiện rằng hóa trị của ion trong dung dịch pha loãng có tương quan đến quá trình kiềm hãm, hóa trị càng cao thì quá trình kiềm hãm

tăng Feiner et al (1946) cho rằng quá trình thủy phân vi khuẩn tăng lên khi thêm vào các chất như ferrous sulfate, sodium arsenate, tyrothricin

2.2.6 Ứng dụng của Lysozyme

2.2.6.1 Trong sản xuất phô mai

Lysozyme ngăn chặn hiện tượng “late blowing”, đây là hiện tượng trương phồng

do khí CO2 trong quá trình lên men butyric ở quá trình chín phô mai Hiện tượng này làm cho phô mai hình thành những lỗ không đều ảnh hưởng đến mùi vị và phá vỡ cấu trúc phô mai

Lysozyme có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn Clostridium tyrobutyricum, những vi khuẩn

này có khả năng tồn tại ở nhiệt độ sản xuất phô mai và chúng có thể gây ra hiện tương

“late blowing” Với việc sử dụng Lysozyme trong sữa, quá trình sản xuất phô mai được thực hiện mà không xảy ra hiện tượng “late blowing” (Daniela Bassi, 2013)

2.2.6.2 Trong sản xuất rƣợu vang

Lysozyme được sử dụng trong quá trình làm vang rượu để ngăn chặn những vi sinh vật gây hư hỏng như vi khuẩn Gram dương, kiềm hãm quá trình lên men malolactic (MLF) Lysozyme có hiệu quả đối với vang đỏ trong vòng 1 đến 3 ngày Ngược lại, Lysoyzme có thể duy trì hoạt tính trong 6 tháng đối với vang trắng (Bartowsky et al., 2004) Lysozyme không thể thay thế được sulfur dioxide (SO2) vì

không thể ngăn chặn được sự nhiễm vi khuẩn gây hư hỏng như Acetobacter hoặc

Brettanomyces Lysozyme rất quan trọng trong việc kiểm soát những sản phẩm không

tốt cho rượu vang và sự hiện diện của vi sinh gây hư hỏng Nó không ảnh hưởng những loài nấm men Lysoyzme có thể được sử dụng trong rượu vang với nồng độ lên tới 500 mg/L

2.2.6.3 Trong lĩnh vực y dƣợc

Hiện nay, Lysozyme có mặt trong những thành phần thuốc như: Lysozym 90mg,

LZ 90-Lysozyme, Numazym (Lysozyme chloride 90mg)… Tác dụng của thuốc chứa Lysozyme như: kháng viêm bằng cách bất hoạt các yếu tố gây viêm, tiêu diệt vi khuẩn Gram dương do phân giải thành peptidoglycan, kháng virus do tạo phức hợp với virus ngăn chặn sự xâm nhập của virus qua màng tế bào, củng cố hệ thống miễn dịch

2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme Lysozyme

2.3.1 Trong nước

Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Dược TP.HCM (2002) đã nghiên cứu thành công việc tách chiết Lysozyme từ lòng trắng trứng gà Sau thành công của nghiên cứu này, xí nghiệp dược phẩm Trung ương 26 đã đặt vấn đề sử dụng chất Lysozyme chiết tách từ lòng trắng trứng cho sản xuất thuốc dạng viên

Võ Minh Sơn và cộng sự (2013) đã thực hiện nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt tính

của Lysozyme của cá tra sau khi lây nhiễm Edwardsiella ictaluri Gly09M sau khi cho

ăn thức ăn trộn vi khuẩn có chủng Bacillus circulans B3, B subtilis N26.3, và

Pediococcus acidilactici LA61 và hỗn hợp 3 chủng Kết quả là hoạt tính Lysozyme

trong huyết thanh của cá tra được cho ăn thức ăn trộn với LA61 và hỗn hợp tăng cao khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và tăng 1,6 và 2,3 lần so với đối chứng sau 4 tuần cho ăn, theo thứ tự Trong đó hoạt tính Lysozyme ở nghiệm thức hỗn hợp (7,14 ± 0,17 µg/ml) tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p<0,05)

Huỳnh Trường Giang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu vai trò các peptide kháng khuẩn trong hệ miễn dịch của tôm biển Lysozyme là một trong 8 loại peptide kháng khuẩn có ở tôm biển Lysozyme tham gia vào quá trình làm tan các nhóm vi khuẩn gram âm và dương

2.3.2 Ngoài nước

Salton (1957) đã nghiên cứu đặc điểm và khả năng tác động lên vi sinh vật Kết quả cho thấy đặc điểm của Lysozyme được định nghĩa dựa trên ba thí nghiệm: 1 Sự giảm độ đục của thành vi khuẩn; 2 Giải phóng nhiều đường có gốc aldehyde; 3 Giải phóng các acetylamino của glucosamine và hexosamine Sự chứng minh với 3 thí nghiệm này là bằng chứng tốt để đánh giá Lysozyme

Hughley (1987) đã thực hiện nghiên cứu về hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn của Lysozyme đối với vi sinh vật gây hỏng thực phẩm và vi sinh vật gây bệnh được truyền qua thực phẩm Kết quả là Lysozyme đã tiêu diệt những vi khuẩn gây bệnh qua thực

phẩm như Clostridium botilinum và Listeria monocytogenes, tiêu diệt các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm như Clostridium thermosaccharolyticum, Bacillus

stearothermophilus và Clostridium tyrobutyricum Nhiều loài vi sinh vật gây ngộ độc

thực phẩm được phân lập như: Bacillus cereus, Clostridium perfringens,

Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Salmonella typhimurium và Yersinia enterocolitica cũng được tiêu diệt bởi Lysozyme

Pellegrini (1992) đã nghiên cứu đặc điểm tiêu diệt vi khuẩn của Lysozyme và aprotinin chống lại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm Kết quả cho thấy rằng đặc điểm của Aprotinin từ bò và Lysozyme từ lòng trắng trứng gà, khi ủ với nhiều loại

vi khuẩn với Lysozyme hoặc Aprotinin tiêu diệt được vi khuẩn Gram âm cũng như vi khuẩn Gram dương mà không kết hợp với EDTA Sự biết tính 2 protein này bởi dithiothreitol không dẫn tới sự mất hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn Quan sát trên kính hiển

vi điện tử cho thấy khi ủ Lysozyme hoặc Aprotinin với Escherichia coli bị làm tan tế

bào chất

Sava (1996) đã nghiên cứu về phương diện y học và ứng dụng của Lysozyme Kết quả là hiệu quả liệu pháp của Lysozyme được dựa trên khả năng kiểm soát của vi khuẩn và điều chỉnh miễn dịch của vật chủ chống lại sự gây nhiễm và giảm tính miễn dịch Hiện tại, những số liệu cho thấy sự ngăn chặn vi khuẩn gây ung thư và điều trị với bệnh nhân ung thư để cải thiện sự hiệu quả của thuốc điều trị ung thư cho phép vật chủ hồi phục từ việc mất miễn dịch bởi điều trị chống ung thư Tuy nhiên, Lysozyme không được công nhận như là tác nhân điều chỉnh miễn dịch; mặc dù thực tế cho thấy

có khả năng điều chỉnh miễn dịch không khác biệt giữa thí nghiệm trên động vật và người Hy vọng rằng bác sĩ tìm hiểu tiềm năng của Lysozyme và họ tận dụng sự tồn tại của phân tử đơn giản và hữu dụng này

Lee-Huang (1999) nghiên cứu Lysozyme và RNases là thành phần chống HIV từ nội tiết tố Human chorionic gonadotropin Kết quả là trình tự amino acid của một protein được cho là Lysozyme C, hai protein khác là RNAase A và RNAase U Họ kết luận rằng những protein này là AVL (antiviral Lysozyme) và AVR (antiviral

RNAase) Thêm vào sự chặn HIV-1, AVL có khả năng thủy phân Microccoccus

lysodeikticus, AVR phá hủy các RNA bao gồm RNA từ tế bào HIV-1 Họ cũng tìm

thấy Lysozyme từ lòng trắng trứng gà, sữa người, bạch cầu ở người và RNase A từ tuyến tụy của bò, cũng có khả năng chống lại HIV-1

Mine (2004) đã nghiên cứu các đoạn peptide tiêu diệt vi khuẩn bởi enzyme thủy phân Lysozyme từ lòng trắng trứng gà Kết quả cho thấy rằng đoạn peptide với trình tự Ile-Val-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Met-Asn-Ala-Trp có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gram

âm E coli K-12 và tương ứng từ 98-108 Trình tự tiêu diệt vi khuẩn S aureus 23-394

và được xác định His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr-Arg, tương ứng từ 15-21 của Lysozyme Okanojo et al (2005) đã nghiên cứu Diamine ngăn chặn sự kết tủa và bất hoạt của Lysozyme Kết quả cho thấy rằng các tác nhân chống lại sự tủa là 1,3-diaminopropane, 1,4-diaminobutane, and 1,5-diaminopentane Tuy nhiên, nhóm chức diols hoặc monoamines không có khả năng ngăn chặn sự kết tủa và sự bất hoạt Lysozyme Nhiệt độ bất hoạt của Lysozyme với 1,3-diaminopropane được phát hiện khi kết hợp Lysozyme với spermine và arginine ethylester, đã được báo cáo

Renata et al (2008) đã báo cáo đặc điểm và ứng dụng của Lysozyme từ lòng trắng trứng và Lysozyme bị đột biến Kết quả là Lysozyme monomer cho thấy khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gram dương tốt Hiện tượng này đã tìm ra ứng dụng thực tế trong công nghệ thực phẩm và dược Công dụng của Lysozyme trong thực phẩm chủ yếu là chất bảo quản tự nhiên như bảo quản thịt, cá Về ngành dược, Lysozyme được ứng dụng trong việc sản xuất kháng sinh và thuốc giảm đau Lysozyme bị biến tính cho thấy hoạt tính đặc hiệu liên quan đến vi khuẩn Gram âm nhưng không mất hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn Gram dương

Madient et al (2009) đã thực hiện nghiên cứu về hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn từ nhiều thực phẩm có chứa Lysozyme Các thực phẩm được nghiên cứu như lòng trắng trứng gà, nước mắt ở người, giá đậu Bỉ, trái đu đủ và trái sung Kết quả là hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn của Lysozyme từ lòng trắng trứng và nước mắt ở người cao hơn so với những thực phẩm từ thực vật

William et al (2013) đã thực hiện nghiên cứu sự tăng trưởng của heo mười ngày tuỗi bằng cách chia đàn heo ra thành 3 nhóm lần lượt sử dụng những thức ăn có chứa những chất sau: Lysozyme, thuốc kháng sinh carbadox cùng với đồng sulfate và mẫu đối chứng Kết quả cho thấy thức ăn chứa Lysozyme giúp heo tăng trưởng giống các thuốc kháng sinh thông thường

2.4 Một số phương pháp phân tích

2.4.1 Phương pháp Bradford

Mục đích: Xác định hàm lượng protein có trong mẫu

Nguyên tắc: Phương pháp Bradford dựa trên sự liên kết giữa chất nhuộm

Coomassie Brilliant Blue G250 (CBB) và protein Khi kết hợp với protein thì thuốc

nhuộm chuyển sang màu xanh dương và hấp thụ cực đại 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch

2.4.2 Phương pháp Shugar

Mục đích: Xác định hoạt tính Lysozyme

Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào sự thay đổi của bước sóng OD 450nm khi cho

dung dịch chứa Lysozyme vào cơ chất là vi khuẩn Gram dương trong khoảng thời gian

từ 2 đến 5 phút Khi cho Lysozyme vào cơ chất vi khuẩn, Lysozyme tiêu diệt vi khuẩn Gram dương làm cho OD 450nm giảm

Đơn vị hoạt tính enzyme được biểu hiện quan đơn vị Unit (U), mỗi đơn vị hoạt tính của Lysozyme được định nghĩa là lượng enzyme làm giảm độ hấp thu OD 450nm 0,001/phút/mL dịch chứa Lysozyme

Hoạt tính đặc hiệu của Lysozyme là số đơn vị hoạt tính enzyme có trong 1mg Protein (U/mg)

Hình 12 Cơ chế phản ứng của thuốc thử Coomassie Brilliant Blue G-250

(*Nguồn: Bradford, 1976 , ngày 11/11/2014)

2.4.3 Phương pháp SDS-PAGE

Mục đích: Xác định trọng lượng của những phân tử protein hoặc những đoạn

peptide có trong mẫu

Nguyên tắc: Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate -

Polyacrylamide Gel Electrophoresis) còn được gọi là phương pháp điện di trên gel acrylamide không liên tục và mẫu protein được gây biến tính (discontinuos and denaturing) SDS là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein Dưới tác động của điện trường protein chuyển bên trong lớp gel về cực dương và sự dịch chuyển này chỉ phụ thuộc vào kích thước Từ đó xác định được trọng lượng phân

tử của protein

Hình 13 Cơ chế phản ứng của phương pháp Shugar

(*Nguồn: http://www.medschool.lsuhsc.edu/microbiology/DMIP/dmex01.htm , ngày 12/7/2014)

Hình 14 Cơ chế của phương pháp điện di SDS-PAGE

(*Nguồn: Laemmli, 1970 ngày 11/11/2014)

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

3.1.3 Nguyên vật liệu

Trứng gà Hisex Brown được mua từ trang trại của ông An Địa chỉ: ấp Ngãi Hòa,

xã Hòa Bình, huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long

Trứng gà Tam Hoàng được mua từ cửa hàng ông Nguyễn Văn On Địa chỉ: 15F Phó Cơ Điều, phường 8, thành phố Vĩnh Long, tỉnh Vĩnh Long

Trứng gà Ác và gà Ta được mua tại cửa hàng Hột Vịt Vũ Sò Địa chỉ: chợ phường 1, thành phố Bạc Liêu, tỉnh Bạc Liêu

Trứng gà Tre được mua từ hộ dân Địa chỉ: số 1096, tổ 39, khu vực Lân Thạnh 1, phường Tân Lộc, quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ

Trứng gà Tàu Ri vàng và gà Isa Brown được mua từ Trung tâm giống Hậu Giang Địa chỉ: 128 Quốc lộ 61, ấp 12, xã Vị Thắng, đường quốc lộ 1A, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang

3.1.4 Hóa chất

Microccocus lysodeikticus đông khô (Sigma), Bovin Serum Albumin (Merck),

Ethanol (Việt Nam), Phosphoric acid (Merck), Acrylamide (Bio Rad), mercaptoethanol (Merck), Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), Sodium Dedocyl Sulfate (Sigma), Sodium Chloride (Merck), di-Potassium hydrogenphosphate (Merck), Sodium dihydrogenphosphate (Merck), Tris (Merck), Coomassie Brilliant Blue G250

β-(Merck), Acid chlohyride (Probalo), Ammonium persulfate (Bio Rad), Potassium hydroxide (Merck)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Lysozyme từ lòng trắng trứng gà

3.2.1.1 Thí nghiệm 1: Chọn nguồn trứng gà khác nhau để trích ly Lysozyme

Mục đích: Xác định loại trứng gà có hoạt tính Lysozyme cao nhất và mang tính kinh tế từ các nguồn trứng gà khác nhau

Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (nguồn trứng gà) với 7 mức

Gà Tam hoàng

+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1)

+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1)

+ Hoạt tính đặc hiệu

+ Hoạt tính tổng

+ Protein tổng

3.2.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát dung dịch đệm để trích ly Lysozyme

+ Sử dụng trứng gà được xác định ở thí nghiệm 1 để trích ly Lysozyme

+ Lấy lòng trắng trứng gà (3 trứng có khối lượng và kích thước) pha loãng với từng loại dung dịch đệm theo bảng 4

+ Tỷ lệ lòng trắng trứng và dung dịch đệm là 1 : 1 ở nhiệt độ 40C trong 10 phút

- Chỉ tiêu đánh giá:

+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1)

+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1)

Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (tỷ lệ pha loãng) với 5 mức độ

và lặp lại 3 lần

Tiến hành thí nghiệm:

+ Sử dụng loại trứng gà được xác định ở thí nghiệm 1

+ Lấy lòng trắng trứng (3 trứng có khối lượng và kích thước) pha loãng với dung dịch được xác định ở thí nghiệm 2

pH 5

Đệm phosphate 0,1M

pH 6

Đệm phosphate 0,1M

pH 7

Đệm phosphate 0,1M

pH 8

Chỉ tiêu đánh giá:

+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1)

+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1)

+ Sử dụng loại trứng gà được xác định ở thí nghiệm 1

+ Lấy lòng trắng trứng (3 trứng có khối lượng và kích thước) pha loãng với từng loại dung dịch được xác định ở thí nghiệm 2

+ Tỷ lệ pha loãng giữa đệm và lòng trắng trứng được xác định ở thí nghiệm 3 và trích ly ở nhiệt độ theo bảng 5 trong thời gian 10 phút

- Chỉ tiêu đánh giá:

+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1)

+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1)

3.2.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian để trích ly Lysozyme

Mục đích: Xác định thời gian thích hợp để trích ly Lysozyme

Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố (thời gian) với 6 mức độ, 3 lần lặp lại

+ Sử dụng loại trứng gà được xác định ở thí nghiệm 1

+ Lấy lòng trắng trứng (3 trứng có khối lượng và kích thước) pha loãng với từng loại dung dịch đệm được xác định ở thí nghiệm 2

+ Tỷ lệ pha loãng giữa đệm và lòng trắng trứng được xác định ở thí nghiệm 3 và trích ly ở nhiệt độ được xác định ở thí nghiệm 4 trong thời gian theo bảng 6

Chỉ tiêu đánh giá:

+ Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (Phụ lục 1)

+ Hoạt tính Lysozyme bằng phương pháp Shugar (Phụ lục 1)

Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và xử lý thống

kê bằng phần mềm STATGRAPHICS Centurion XV.1.2

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thành phần cấu tạo và hoạt tính Lysozyme của trứng gà từ các giống gà khác nhau 4.1.1 Đặc điểm của từng loại trứng gà

Bảng 7: Màu sắc và khối lượng của từng loại trứng

Giống gà Màu sắc vỏ Khối lượng trung bình (g)

*Ghi chú: Khối lượng trung bình của từng loại trứng gà: CV = 6,4%.

Qua bảng trên cho thấy khối lượng của trứng gà Hisex Brown (59,1 g) lớn nhất

và có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5% so với các loại trứng gà được thu thập Trứng gà Ác (28,3 g) và trứng gà Tre (28,8 g) có khối lượng thấp nhất

Hình ảnh một số loại trứng gà:

Hình 15 Trứng gà Hisex Brown

Hình 16 Trứng gà Tàu Ri vàng

Hình 17 Trứng gà Tam Hoàng

Hình 18 Trứng gà Ác

Hình 19 Trứng gà Tre

Hình 20 Trứng gà Ta

Hình 21 Trứng gà Isa Brown

*Chú thích: g: Khối lượng, %: Thành phần phần trăm.

Theo Cotterill et al (1977) nghiên cứu thành phần cấu tạo của trứng gà gồm vỏ trứng chiếm 9,5%, lòng trắng trứng chiếm 63% và lòng đỏ chiếm 27,5% với tỷ lệ tương đối giữa vỏ trứng, lòng trắng trứng và lòng đỏ là 1/6/3 Theo bảng 8, tỷ lệ tương đối giữa vỏ trứng, lòng trắng trứng và lòng đỏ của trứng gà Hisex-Brown là 1,2/6/2,8; trứng gà Tam hoàng là 1,2/6/2,8 và trứng gà Isa Brown là 1,3/6,4/2,4 (bảng 14, phụ lục 2) Tỷ lệ tương đối của trứng gà từ giống gà nói trên phù hợp với nghiên cứu của Cotterill et al (1977) Tuy nhiên, tỷ lệ tương đối giữa các thành phần cấu tạo trứng gà

ta là 1,5/3,9/4,6, gà ác là 1,4/4,6/4, gà tre 1,3/4/4,7 và gà Tàu ri vàng là 1,2/4,9/3,9 khác với nghiên cứu của Cotterill et al (1977) Theo Bùi Thị Kiều Vân (2008), khối lượng vật chất có trong trứng gà như vỏ trứng, lòng trắng trứng, hàm lượng nước và lòng đỏ trứng là tính trạng số lượng, nó phụ thuộc vào giống, nguồn thức ăn và đặc biệt là điều kiện bảo quản trứng

4.1.3 Khảo sát hoạt tính Lysozyme từ các nguồn trứng gà khác nhau

Bảng 9: Hàm lƣợng protein, protein tổng, hoạt tính Lysozyme, hoạt tính tổng và hoạt tính đặc hiệu của từng loại trứng

*Chú thích: TT : Thể tích dịch trích lòng trắng trứng

*Ghi chú: Hàm lượng protein: CV = 3,94%, protein tổng: CV = 3,94%, hoạt tính Lysozyme:

CV = 4,98%, protein tổng: CV = 4,98% và hoạt tính đặc hiệu: CV = 5,6%

Các giá trị có cùng ký tự trên đường biểu diễn sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%

Kết quả quá trình khảo sát hoạt tính tổng từ dịch trích của các nguồn trứng gà như gà Hisex Brown, gà Tàu Ri vàng, gà Ta, gà Ác, gà Tre, gà Isa Brown và gà Tam Hoàng cho thấy hoạt tính tổng của Lysozyme từ trứng gà Tam Hoàng cao nhất là 986.667 U có khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê mức độ 5% so với các loại trứng gà còn lại

Protein tổng từ trứng gà Tàu Ri vàng (655 mg), gà Ta (726 mg) và gà Isa Brown (800 mg) cao nhất và có khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê mức độ 5% so với nghiệm thức còn lại Tuy nhiên, hoạt tính tổng từ trứng gà của giống gà kể trên không cao như trứng gà Hisex Brown và gà Tam Hoàng Điều này chứng tỏ lượng protein tổng trứng

gà từ các giống gà không có tương quan với hoạt tính Lysozyme

Hoạt tính đặc hiệu Lysozyme từ giống gà Hisex Brown và gà Tam Hoàng có hoạt tính đặc hiệu cao nhất lần lượt là 1.327 U/mg và 1.429 U/mg, khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 5% so với các giống gà còn lại Điều này chứng tỏ trong 1 mg protein từ lòng trắng trứng của giống gà Hisex Brown và gà Tam Hoàng có hàm lượng Lysozyme nhiều hơn so với giống gà khác, có hàm lượng protein phi Lysozyme nhiều

Giống gà Thể tích

(mL)

Hàm lƣợng protein (mg/mL)

Protein tổng (mg)

Hoạt tính Lysozyme (U/mL)

Hoạt tính tổng (U)

Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)

hơn Theo Kopec et al (2005) cho rằng hoạt tính Lysozyme từ trứng gà bị ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố như hệ thống chăn nuôi gà đẻ trứng, thức ăn, cách lưu trữ trứng gà Ngoài ra, Świerczewska et al (2005) cho rằng thực hiện miễn dịch đối với gia cầm chuẩn bị cho quá trình giao phối được cho là có khả năng làm tăng hoạt tính Lysozyme Trong quá trình thu mẫu, gà Hisex Brown và gà Tam Hoàng được nuôi ở dạng quy mô công nghiệp, cung cấp thức ăn đầy đủ và có hệ thống miễn dịch bằng cách tiêm vắc xin để phòng tránh bệnh Do đó, đây là một trong những nguyên nhân

để dẫn tới hoạt tính Lysozyme từ 2 giống gà này cao hơn so với những giống gà khác Kết quả trên phù hợp với kết quả nghiên cứu của Seyhun Gemili (2007) khi cho rằng hoạt tính đặc hiệu và hoạt tính tổng lần lượt là 824 U/mg và 1.092.000 U từ lòng trắng trứng pha loãng 3 hoặc 3,3 lần với dung dịch NaCl 0,5M sau đó được điều chỉnh

về pH 4

Qua thí nghiệm này đã chọn được 2 giống gà có hoạt tính Lysozyme, hoạt tính đặc hiệu và hoạt tính tổng cao đó là giống gà Hisex Brown và gà Tam Hoàng Tuy nhiên, giá trứng từ 2 giống gà này trên thị trường thì khác nhau: gà Hisex Brown 2.000 đồng/trứng và gà Tam hoàng là 4.000 đồng/trứng Vì vậy, trứng của giống gà Hisex Brown được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo nhằm tiết kiệm chi phí cho nguồn nguyên liệu

4.2 Ảnh hưởng một số yếu tố đến quá trình trích ly Lysozyme

Hàm lượng protein (mg/mL)

Protein tổng (mg)

Hoạt tính Lysozyme (U/mL)

Hoạt tính tổng (U)

Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)

*Ghi chú: Hàm lượng protein: CV = 5,16%, protein tổng: CV = 5,16%, hoạt tính Lysozyme:

CV = 7,2%, hoạt tính tổng: CV = 7,2% và hoạt tính đặc hiệu: CV = 6,91%.

Các giá trị có cùng ký tự trên đường biểu diễn sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Điểm đẳng điện của protein là một đặc điểm quan trọng bởi vì tại điểm đẳng điện protein tan ít Vì vậy, đối với các pH lớn hơn và nhỏ hơn điểm đẳng điện làm protein tan tốt hơn Theo Powrie và Nakai (1985), điểm đẳng điện của Lysozyme là 10,7; do

đó, thí nghiệm này khảo sát các pH, nhỏ hơn điểm đẳng điện của Lysozyme, lần lượt

là 5, 6, 7, 8 và dung dịch nước để tránh trường hợp Lysozyme bị kết tủa và mất hoạt tính Qua bảng 10 cho thấy ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly Lysozyme, hoạt tính tổng khi lòng trắng trứng được trích ly bằng pH 7 là cao nhất (5.480.000 U/trứng)

và có khác biệt ý nghĩa về mặt thống ở mức độ 5% so với nước, pH 5 và pH 6 Hoạt tính của Lysozyme ổn định trong môi trường acid và trung tính (Jauregui, 1974) Như được biết Lysozyme tồn tại ở dạng monomer trong dung dịch acid (pH < 5) nhưng tồn tại ở dạng dimer trong khoảng pH từ 5 đến 10, và bị tủa khi pH > 10 (Sophianopoulos, 1964) Khi ở dạng dimer, Lysozyme được ứng dụng vào diệt vi khuẩn và virus gây bệnh

Qua bảng 10 cũng cho thấy rằng sự tương quan thuận giữa hàm lượng protein và hoạt tính Lysozyme; cụ thể là, ở pH 7 và pH 8 đạt hàm lượng protein và hoạt tính cao nhất lần lượt là 3.824 mg/trứng và 3.906 mg/trứng Điều này có thể giải rằng thích rằng tại pH 7 và pH 8 khả năng hòa tan protein từ tốt hơn so với pH 5, pH 6 và nước Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Flavia et al (2007) cho rằng khả năng hòa tan protein tăng lên khi tăng pH, khả năng hòa tan protein tốt nhất tại pH 9 và thấp nhất tại pH 4,6 Đặc điểm cơ bản của Lysozyme là liên kết với các protein trong lòng trắng trứng (Saravanan, 2009)

Hoạt tính đặc hiệu của các nghiệm thức không khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê

ở mức độ 5%; có thể giải thích nguyên nhân là do khi hoạt tính (U/mL) tăng thì hàm lượng protein (mg/mL) cũng tăng theo Vì vậy, hoạt tính Lysozyme trong 1 mg protein không thay đổi

Qua thí nghiệm này có thể thấy rằng lòng trắng trứng khi được trích ly bằng đệm phosphate 0,1M pH 7 có hoạt tính tổng cao nhất là 5.480.000 U/trứng Trong khi đó, hoạt tính đặc hiệu không có khác biệt so với các nghiệm thức khác Vì vậy, đệm phosphate 0,1M pH 7 được chọn để tiến thành thí nghiệm tiếp theo