khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI BÃ MÍA CỦA TỔ HỢP VI KHUẨN

TRONG ĐIỀU KIỆN HIẾU KHÍ

PGs Ts TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3092416

Lớp: CNSH TT K35

Cần Thơ, 12/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI BÃ MÍA CỦA TỔ HỢP VI KHUẨN

TRONG ĐIỀU KIỆN HIẾU KHÍ

PGs Ts TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3092416

Lớp: CNSH TT K35

Cần Thơ, 12/2013

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGs Ts Trần Nhân Dũng

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

- -

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được sự động viên khích lệ to lớn cả về vật chất lẫn tinh thần từgia đình, sư hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô và bạn bè Đó chính là động lực giúp tôi vượt qua các khó khăn hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Xin được gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Trần Nhân Dũng và ThS Võ Văn Song Toàn, hai thầy cố vấn tận tuỵ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi Xin gửi lời tri ân sâu sắc của tôi đến các thầy

Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả qu Thầy Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền dạy cho tôi, giúp tôi có những kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực hiện đề tài

Cám ơn các cô chú công nhân viên của viện đã giúp đỡ trong quá trình làm việc trong và ngoài giờ để tôi hoàn thành đề tài đúng tiến độ qui định

Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên Bùi Thị Thiên Lý, Phan Văn Dư, Hà Công Thắng, em Nguyễn Vi Khánh K37, em Nguyễn Thị Như Anh VSV K36 và các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme đã nhiệt tình giúp đỡ và chia

s nhiều kinh nghiệm qu áu trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này

Cuối lời, kính chúc mọi người luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, vui v và thành đạt Xin trân trọng cám ơn!

Cần Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2013

Bùi Hoàng Đăng Long

- -

TÓM LƯỢC:

Đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí” được tiến hành với mục tiêu chọn lọc tổ hợp vi khuẩn cùng với điều kiện tối ưu cho quá trình phân giải bã mía Các dòng vi khuẩn thuộc bốn nhóm vi khuẩn nội sinh dạ cỏ trâu (TM9, TM11), cừu (CD11, CD43), và dê (DD7, DD9) được phối hợp với các dòng vi khuẩn dạ cỏ bò (BM13, BM21, BM49), và khảo sát khả năng phân giải bột bã mía trong điều kiện hiếu khí Kết quả cho thấy sự kết hợp giữa nhóm vi khuẩn dạ cỏ bò (BM13, BM21, BM49) với nhóm vi khuẩn dê (DD7, DD9) theo tỉ lệ 4,5% (v/v) : 1,5% (v/v) cho hiệu quả phân giải bã mía cao nhất với các chỉ tiêu DM, CF và đường khử lần lượt là 6,31%,13,61% và 0,14 mM đường khử sau 5 ngày nuôi cấy Tổ hợp vi khuẩn chọn lọc cho thấy hiệu quả phân giải tối ưu

ở điều kiện pH 6,0, nhiệt độ ủ 38 o

C, thời gian phân giải 7 ngày và có bổ sung NH 4 Cl vào môi trường Trong điều kiện tối ưu hóa tổng hợp, tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc có khả năng phân giải các chỉ tiêu DM, CF, cellulose, hemicellulose, lignin và đường khử lần lượt là 11,31%, 6,51%, 7,14%, 3,25% và 0,26mM

Từ khóa: Bã mía, Dạ cỏ, Điều kiện hiếu khí, Khả năng phân giải, Tổ hợp vi khuẩn

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vii

CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về bã mía và các thành phần trong bã mía 3

2.1.1 Tổng quan về ã mía 3

2.1.2 Thành phần và cấu trúc của ã mía 3

2.2 Tổng quan về hệ tiêu hoá gia súc nhai lại và vi sinh vật nội sinh dạ cỏ phân giải cellulose 5

2.2.1 Phân loại hệ vi sinh vật nội sinh động vật nhai lại 5

2.2.2 Tác động phối hợp của các nhóm vi khuẩn nội sinh dạ cỏ lên sự phân giải cellulose 8

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật dạ cỏ phân giải cellulose 9

2.3 Sự phân giải cellulose ở dạ cỏ động vật nhai lại dưới tác động của vi sinh vật 11 2.3.1 Enzyme cellulase 11

2.3.2 Tính chất của enzyme cellul ase 12

2.4 Một số phương pháp nghiên cứu 13

2.4.1 Vật chất khô (DM) của ã mía 13

2.4.2 Phương pháp phân tích xơ trong thức ăn 14

2.4.3 Phương pháp phân tích xơ thô (Crude Fi er-CF) 14

2.4.3 Phương pháp phân tích xơ trung tính (NDF) 14

2.4.4 Phương pháp phân tích xơ acid (ADF) 14

2.4.5 Phương pháp phân tích lignin (ADL) 15

2.4.6 Khảo sát đường khử ằng phương pháp Nelson Soymogi (Nelson, 2003) 15

2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 15

2.5.1 Các nghiên cứu trong nước 15

2.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước 16

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

3.1 Phương tiện nghiên cứu 18

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.3 Hóa chất 18

3.1.4 Thiết ị, dụng cụ 18

3.1.5 Nguyên vật liệu 19

3.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 20

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Thí nghiệm 1: Chọn lọc tổ hợp vi khuẩn hiếu khí phân giải ã mía tốt nhất 20

3.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện pH lên sự phân giải cơ chất ã mía 22

3.2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian ủ lên men lên sự phân giải cơ chất ã mía 23

3.2.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên sự phân giải ã mía trong điều kiện hiếu khí 24

3.2.5 Thí Nghiệm 5: Ảnh hưởng của các loại muối Nitrogen khác nhau đến khả năng phân giải ã mía của tổ hợp vi khuẩn hiếu khí 25

3.2.3 Phương pháp phân tích kết quả thí nghiệm 27

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Thành phần nguyên liệu 28

4.2 Khả năng phối trộn các dòng vi khuẩn phân giải bã mía 30

4.3 Kết quả pH tối ưu cho quá trình phân giải bã mía 35

4.4 Kết quả thời gian tối ưu cho quá trình phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn tối

ưu 39

4.5 Kết quả nhiệt độ tối ưu cho quá trình phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc: 44

4.6 Ảnh hưởng của các nguồn đạm lên khả năng phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc: 47

4.6.1 Kết quả phân tích hàm lượng vật chất khô được phân giải: 47

4.6.2 Kết quả phân tích hàm lượng cellulose được phân giải: 49

4.6.3 Kết quả phân tích hàm lượng hemicellulose được phân giải: 50

4.6.4 Kết quả phân tích hàm lượng lignin được phân giải: 51

4.6.5 Kết quả phân tích nồng độ đường khử trong dịch phân gi ải: 53

4.6.6 Kết luận 53

4.6 Đánh giá hiệu quả tối ưu hoá phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí 54

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

5.1 Kết luận: 55

5.2 Kiến nghị: 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THỐNG KÊ

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Các nhóm vi sinh vật và mật độ của chúng trong dịch trích từ dạ cỏ

động vật nhai lại 5

Bảng 2 Thành phần môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M1) 20

Bảng 3 Thành phần môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M2) 20

Bảng 4 Thành phần môi trường khoáng (M3) 20

Bảng 5 Bố trí tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn của các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 21

Bảng 6 Bảng bố trí thí nghiệm 3 24

Bảng 7 Bảng bố trí thay đổi các loại muối 26

Bảng 8 Hàm lượng các thành phần khảo sát trong bã mía nguyên liệu 28

Bảng 9 Đánh giá hiệu quả tối ưu hoá qua các thí nghiệm 54 Bảng 10.Thành phần hóa học của dung dịch stock Phụ lục 1 Bảng 11 Bảng bố trí đo đường khử bằng phương pháp Nelson –Soymogi Phụ lục 1 Bảng 12 Kết quả phân tích DM c ủa bã mía Phụ lục 2 Bảng 13 Kết quả hàm lượng tro tổng của bã mía nguyên liệu Phụ lục 2 Bảng 14 Kết quả khảo sát hàm lượng NDF của bã mía nguyên liệu Phụ lục 2 Bảng 15 Kết quả khảo sát hàm lượng ADF của bã mía nguyên liệu Phụ lục 2 Bảng 16 Kết quả khảo sát hàm lượng ADL của bã mía nguyên liệu Phụ lục 2 Bảng 17 Kết quả khảo sát hàm lượng Hemicelluloses, cellulose và lignin

của bã mía nguyên liệu Phụ lục 2 Bảng 18 Kết quả khảo sát hàm lượng CF c ủa bã mía nguyên liệu Phụ lục 2 Bảng 19 Kết quả đo mật số vi khuẩn đầu vào thí nghiệm 1 Phụ lục 2 Bảng 20 Ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn lên sự phân giải

vật chất khô Phụ lục 2 Bảng 21 Ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn lên sự phân giải xơ

thô Phụ lục 2

Bảng 22 Ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn lên khả năng tạo

đường khử Phụ lục 2 Bảng 23 Kết quả đo mật số vi khuẩn đầu vào thí nghiệm 2 Phụ lục 2 Bảng 24 Ảnh hưởng của pH lên sự phân giải vật chất khô Phụ lục 2 Bảng 25 Ảnh hưởng của pH lên sự phân giải xơ thô Phụ lục 2 Bảng 26 Ảnh hưởng của pH lên khả năng tạo đường khử của tổ hợp vi khuẩn Phụ lục 2 Bảng 27 Kết quả đo mật số vi khuẩn đầu vào thí nghiệm 3 Phụ lục 2 Bảng 28 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên sự phân giải vật chất khô Phụ lục 2 Bảng 29 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên sự phân giải xơ thô Phụ lục 2 Bảng 30 Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng tạo đường khử của tổ hợp vi

khuẩn Phụ lục 2 Bảng 31 Kết quả đo mật số vi khuẩn đầu vào thí nghiệm 4 Phụ lục 2 Bảng 32 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân giải vật chất khô Phụ lục 2 Bảng 33 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân giải xơ thô Phụ lục 2 Bảng 34 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tạo đường khử của tổ hợp vi

khuẩn Phụ lục 2 Bảng 35 Kết quả đo mật số vi khuẩn đầu vào thí nghiệm 5 Phụ lục 2 Bảng 36 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên sự phân giải vật chất khô Phụ lục 2 Bảng 37 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên sự phân giải NDF Phụ lục 2 Bảng 38 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên sự phân giải ADF Phụ lục 2 Bảng 39 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên sự phân giải ADL Phụ lục 2 Bảng 40 Ảnh hưởng của nguồn đạm lên sự phân giải cellulose,

hemicellulose và lignin Phụ lục 2 Bảng 41 Ảnh hưởng của nguồn đạm lên sự tạo đường khử trong thí

nghiệm 5 Phụ lục 2

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Cấu trúc phân tử cellulose 3

Hình 2 Cấu trúc của xylan trong Hemicellulose 4

Hình 3 Cấu trúc các liên kết trong lignin polymer 5

Hình 4 Hoạt động phân giải cellulose của Lutzen và Nielson 12

Hình 5 Một số thiết bị thí nghiệm 19

Hình 6 Ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn lên sự phân giải vật chất khô 30

Hình 7 Ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn lên sự phân giải xơ thô 32

Hình 8 Ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn lên khả năng tạo đường khử 34

Hình 9 Ảnh hưởng của pH lên sự phân giải vật chất khô của tổ hợp vi khuẩn 35

Hình 10 Ảnh hưởng của pH lên sự phân giải xơ thô c ủa tổ hợp vi khuẩn 37

Hình 11 Ảnh hưởng của pH lên khả năng tạo đường khử của tổ hợp vi khuẩn 38

Hình 12 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên sự phân giải vật chất khô của tổ hợp vi khuẩn 39

Hình 13 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên sự phân giải xơ thô của tổ hợp vi khuẩn 41

Hình 14 Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng tạo đường khử của tổ hợp vi khuẩn 42

Hình 15 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân giải vật chất khô của tổ hợp vi khuẩn 44

Hình 16 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân giải xơ thô c ủa tổ hợp vi khuẩn 45

Hình 17 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tạo đường khử của tổ hợp vi khuẩn 46

Hình 18 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên sự phân giải vật chất khô 47

Hình 19 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên sự phân giải cellulose 49

Hình 20 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên sự phân giải hemicellulose 50

Hình 21 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên sự phân giải lignin 51

Hình 22 Ảnh hưởng của nguồn đ ạm lên khả năng tạo đường khử 53

Hình 29.Đồ thị đường chuẩn Glucose Phụ lục 2

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADF Acid detergent fiber, chỉ số xơ acid

ADL Acid detergent lignin, chỉ số lignin

CFU Colony forming unit, khuẩn lạc

DM Dry matter, khối lượng vật chất khô

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Nông nghiệp là ngành truyền thống và là thế mạnh của đồng bằng sông Cửu Long Phát triển nông nghiệp gắn liền với công nghiệp là chủ trương quan trọng của nhà nước Trong đó, mía đường là một trong những loại cây trồng quan trọng phục vụ

sự phát triển công nghiệp chế biến Theo số liệu của Tổng cụ thống kê Việt Nam (2013), diện tích mía cả nước đạt 283.222 ha, năng suất mía ình quân đạt 61,7 tấn/ha, cùng với quy hoạch phát triển mía đường của Chính phủ dẫn đến lượng mía được tiêu thụ ngày càng tăng Kết quả là nông nghiệp trồng mía tạo ra một lượng chất thải rất lớn Ước tính có 5,4 x 108 tấn bã mía hằng năm được thải ra trên toàn thế giới (Cerqueira et al., 2007) Theo đó, 1 tấn mía tươi tạo ra 280 kg bã mía Theo báo cáo khoa học kỹ thuật của Viện Năng Lượng (2008), nước ta có 4,45 triệu tấn bã mía có tiềm năng tái sử dụng Nhiều biện pháp được ứng dụng để xử lí nguồn phụ phẩm này (năng lượng sinh học, năng lượng tái tạo) nhưng chúng lại để lại hậu quả nghiêm trọng

về môi trường do một lượng bã mía lớn lưu trữ dễ gây cháy (Lavarack et al., 2000)

Vi khuẩn hiếu khí nội sinh dạ cỏ động vật nhai lại có khả năng sản sinh enzyme cellulase ngoại bào, phân giải cellulose (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Cellulose được phân giải được chuyển hoá thành năng lượng phục vụ các hoạt động sống của động vật nhai lại Do đó, việc ứng dụng cellulase từ vi khuẩn dạ cỏ động vật nhai lại có tiềm năng giải quyết vấn đề xử lý nguồn phụ phẩm bã mía Trần Hồ Điễm Đoan (2013) đã tiến hành phân giải bã mía bằng vi khuẩn dạ cỏ và cho kết quả vi khuẩn nội sinh dạ cỏ động vật nhai lại có khả năng phân giải 11,13% bã mía Các enzyme của vi khuẩn tiếp cận và phân giải các cấu trúc của vách tế bào, giúp các quá trình phân giải sinh học diễn ra tốt hơn Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự phối hợp các chủng vi khuẩn khác nhau phân lập từ dạ cỏ và điều kiện hoạt động tối ưu ao gồm nhiệt độ, thời gian và

pH nhằm đạt được hiệu quả phân giải cao nhất vẫn còn hạn chế Việc tuyển chọn được

tổ hợp vi khuẩn hiếu khi và điều kiện hoạt động tối ưu của quá trình phân giải bã mía

có nghĩa quan trọng góp phần ứng dụng vi khuẩn dạ cỏ động vật nhai lại trong sản xuất thực tiễn Bã mía phân giải có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: sản xuất phân bón cho cây trồng, sản xuất nhiên liệu sinh học và làm thức ăn cho gia súc Phân giải bã mía làm giảm lượng chất thải bã mía, cải thiện chất lượng môi trường

Do đó đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải bã

mía của tổ hợp vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí” được tiến hành

1.2 Mục tiêu đề tài

 Xác định tổ hợp vi khuẩn tối ưu phân giải ã mía trong điều kiện hiếu khí

 Xác định điều kiện hoạt động tối ưu của tổ hợp vi khuẩn đã tuyển chọn phân

giải bã mía

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về bã mía và các thành phần trong bã mía

Cellulose là một hợp chất hữu cơ có công thức phân tử (C6H10O5)n, một polysaccharide gồm mạch thẳng từ hàng trăm đến hơn mười nghìn đơn phân D-glucose thông qua liên kết β-1,4 glycosidic (Crawford, 1981) Cellobiose là cấu trúc lặp của cellulose, với mỗi glucose xoay 180 độ so với các glucose bên cạnh Ở thực vật, cellulose có độ polymer hoá dao động từ 7000 – 14000 đơn phân, nhưng có khi chỉ 500 đơn phân (Ljungdahl và Eriksson, 1985)

Phân tử cellulose được bền hoá bằng các liên kết hydro trong và liên phân tử và lực Van der Waals, thành lập các vi ống cellulose Các vi ống này kết hợp lại tạo chất

xơ Các phân tử cellulose sắp xếp song song.Cấu trúc này tạo thành domains tinh thể trật tự chặt chẽ xen lẫn với các domain phân tán không chặt chẽ.Mức độ tinh thể hoá đạt 60-90% (Marchessault và Sundararajan, 1983)

Hình 1 Cấu trúc phân tử cellulose

(*Nguồn:Heinze and Lieberd, 2012)

 Hemicellulose

Hemicellulosic polymers là những thành phần phức trong vách tế bào của các loài thực vật.Hemicellulose thành lập các liên kết hydro với cellulose và thành lập các liên kết cộng hoá trị (đa phần là α-benzyl ether) với lignin, và liên kết ester với các đơn phân acetyl và hydroxycinnamic acids.Các liên kết trên giữ chặt hemicellulosic polymers vào vách tế bào (Jing et al., 2012) Trong khi cellulose ở dạng tinh thể, mạnh

và kháng phân giải, hemicellulose có cấu trúc ngẫu nhiên, lớn và dễ bị phân giải khi hoà tan bằng acid, kiềm hoặc enzyme Hemicellulose bao gồm xylan, glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan, và xyloglucan.Hemicellulose chứa đa phần là đường D-pentose.Trong đó, Xylose là thành phần có lượng lớn nhất ở Hemicellulose Theo Sabiha-Hanim (2006), hemicellulose chiếm 33,5% trọng lượng khô của bã mía Hemicellulose bao gồm những đoạn ngắn từ 500-3000 đơn vị đường với 7000-15000 phân từ glucose

Hình 2 Cấu trúc của xylan trong Hemicellulose

(*Nguồn: Heinze and Lieberd, 2012)

 Lignin

Lignin là một hợp chất hoá học tìm thấy ở gỗ, và là một thành phần bên trong của vách thứ cấp tế bào thực vật (Lebo et al., 2001) và một số tảo (Martone et al., 2009) Lignin là polymer hữu cơ thông dụng nhất trên trái đất, chỉ sau cellulose, chiếm khoảng 30% nguồn carbon hữu cơ phi hoá thạch (Boerjan, et al., 2003), và chiếm 25-30% trọng lượng khô của gỗ Như là một polymer sinh học, lignin không có cấu trúc xác định.Lignin giúp gia cố cấu trúc gỗ ở thực vật (Wardrop, 1969)

Lignin chiếm các khoang trống giữa cellulose, hemicellulose và pectin Pectin liên kết cộng hoá trị với hemicellulose và tạo các liên kết chéo với các polysaccharide trong cây trồng Từ đó, lignin gia cố các cấu trúc của tế bào, kết nối các bộ phận của cây (Chabannes, 2001) Lignin đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển nước cho thực vật từ rễ đến các nhánh Trong khi các thành phần polysaccharide của vách tế bào thực vật đều ưa nước và vì vậy thẩm thấu nước, thì lignin kỵ nước hơn Các liên kết chéo của lignin ngăn cản hiện tượng thẩm thấu nước.Vì vậy, lignin cho phép mô vận chuyển của cây hoạt động hiệu quả (Sarkanen và Ludwig, 1971)

Theo Kamstra et al (1958), lignin ngăn cản sự phân giải cellulose nhờ có cấu trúc rất bền, ngay cả với acid mạnh và enzyme vi khuẩn Vách tế bào thực vật gồm các cấu trúc phức chất lignin – cellulose làm giảm khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn (Lê Đức Ngoan, 2005)

Hình 3 Cấu trúc các liên kết trong lignin polymer

(*Nguồn: Shimin et al., 2013)

2.2 Tổng quan về hệ tiêu hoá gia súc nhai lại và vi sinh vật nội sinh dạ cỏ phân giải cellulose

2.2.1 Phân loại hệ vi sinh vật nội sinh động vật nhai lại

Bảng 1 Các nhóm vi sinh và mật độ của chúng trong dịch trích từ dạ cỏ động vật nhai lại

Hệ vi sinh vật nội sinh trong dạ cỏ của động vật nhai lại rất đa dạng, gồm vi khuẩn, Protozoa và nấm Mỗi ml dịch trích dạ cỏ có chứa xấp xỉ 10 đến 50 tỉ vi khuẩn, hơn một triệu Protozoa và các loài khác (Chiba, 2009)

 Vi khuẩn:

Tim (2000) đã khảo sát vi khuẩn có mật số cao nhất trong các nhóm, với 1010

tế bào/ml dịch dạ cỏ Một cá thể đầy đủ dinh dưỡng có thể sản sinh ra 1 đến 1.5 kg vi khuẩn dạ cỏ mỗi ngày Hơn 200 loài vi khuẩn đã được phân lập từ dạ cỏ, nhưng chỉ có khoảng 20 loài đạt mật số trên 107 tế bào/ml Những loài khác có mật số thấp trong tổng mật số, nhưng cũng là một thành phần quan trong trong hệ vi khuẩn cộng sinh tiêu hoá thức ăn

Vi khuẩn dạ cỏ có thể được phân loại dựa trên cơ chất mà vi khuẩn chuyển hoá hoặc sản phẩm của sự lên men Các nhóm vi khuẩn chính nội sinh dạ cỏ là vi khuẩn phân giải cellulose, hemicellulose, đường, tinh bột, protein và vi khuẩn tổng hợp vitamin (Tim, 2000)

Vi khuẩn phân giải chất xơ: chiếm số lượng lớn trong tổng số vi khuẩn dạ cỏ Thời gian sống trung bình là 18 giờ, với mật độ 1010CFU/ml Tại dạ cỏ, enzyme phân giải cellulose, hemicellulose và pectin được tiết ra Những loài vi khuẩn phân giải

cellulose quan trọng nhất là Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolvens

Những vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose thì cũng có khả năng sử dụng hemicellulose Tuy nhiên, không phải tất cả các loài vi khuẩn sử dụng được hemicellulose đều có khả năng phân giải cellulose Một số loại vi khuẩn sử dụng

hemicellulose là Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira multiparus và Bacteroides ruminicola pH thấp có thể ức thế các vi khuẩn phân giải cellulose và hemicellulose

(Nguyễn Xuân Trạch, 2007)

Vi khuẩn phân giải chất tinh bột: đứng thứ hai về mặt số lượng vi khuẩn trong dạ

cỏ Nhóm này phân giải phần lớn tinh bột từ thức ăn trong dạ cỏ, trong đó có cả một số

vi khuẩn phân giải chất xơ Những loài vi khuẩn thuộc nhóm này gồm: Bacteroides amylophilus, Succinimonas amylolytica, Butyrivibrio fibrisolbvens, Bacte roides ruminantium, Selenomonas ruminantium và Steptococcus bovis (Nguyễn Xuân Trạch,

2003)

Các loài vi khuẩn còn lại có khả năng phân giải đa dạng các thành phần dinh dưỡng như: protein, vitamin, đường, acid hữu cơ, tạo khí metan, và một số loài khác

Ở ruột già chỉ có sự diện diện các vi khuẩn, tương tự như ở dạ cỏ, không tìm thấy nấm và protozoa (Demeyer và Graeve, 1991; López et al., 2000) Vi khuẩn nội sinh tiếp tục lên men các monosaccharide, các acid amin (không được hấp thụ ở ruột non), các chất tiết nội sinh và các carbohydrate cấu trúc (chưa được phân giải ở dạ cỏ) chuyển hoá thành các acid éo ay hơi Lượng cellulose được tiêu hóa trong ruột già gia súc nhai lại có thể lên đến 10% tổng lượng cellulose (Phillipson, 1977)

Các nghiên cứu chỉ ra rằng sản phẩm lên men xơ của vi sinh vật ở ruột già tương

tự như vi sinh vật dạ cỏ (Zora et al., 2000) Tuy nhiên, khả năng lên men xơ ởi vi sinh vật ruột già kém hơn ở dạ cỏ (Zora et al., 2000; López et al., 2000)

 Protozoa

Protozoa là loài xếp thứ hai về mật số trong dạ cỏ với 105-106 tế bào/ml và hơn

100 loài đã dược nhận dạng.Protozoa chịu trách nhiệm cho 1/4 đến 1/3 khả năng tiêu hoá chất xơ của động vật nhai lại Tuy nhiên, số loài protozoa trong dạ cỏ thay đổi theo hướng tỉ lệ nghịch với số loài vi khuẩn và trong thực tế động vật nhai lại có thể tồn tại mà không cần Protozoa trong dạ cỏ Protozoa có thể hạn chế khả năng hấp thụ protein của động vật nhai lại (Tim, 2000)

 Nấm

Nấm là nhóm được tìm thấy gần đây trong dạ cỏ động vật nhai lại Mặc dù chiếm

số lượng ít trong dạ cỏ (103-104 tế bào/ml dịch), nấm đóng góp vào 8% sinh khối vi sinh vật Nấm được tin rằng có thể giúp tiêu hoá những vật chất khó tiêu nhất như rơm lúa mạch (Tim, 2000)

 Các nhóm vi sinh vật nội sinh hiếu khí phân giải cellulose

Nấm là thành phần quan trọng trong các vi sinh vật phân giải cellulose Các nấm

có khả năng phân giải cellulose mạnh là các chi Aspergillus, Chaetomium, Curvularia, Fusarium, Trichoderma…Cytophaga là vi khuẩn hiếu khí quan trọng Các vi khuẩn khác còn có Cellulomonas, Vibrio, Pseudomonas Xạ khuẩn không giữ vai trò quan

trọng trong quá trình phân giải cellulose, tuy nhiên một số loài trong các chi

Streptomyces, Micromonospora cũng có khả năng này (Gopalakrishnan et al., 2010)

2.2.2 Tác động phối hợp của các nhóm vi khuẩn nội sinh dạ cỏ lên sự phân giải cellulose

Theo Trần Cừ (1979), những loài sinh vật khác nhau sống trong dạ cỏ có quan hệ chặt chẽ và phụ thuộc lẫn nhau Sự phát triển của loài này có thể phụ thuộc mật thiết vào sự sinh trưởng của các loài khác và phụ thuộc vào môi trường

 Vi khuẩn và protozoa

Vi khuẩn bị cạnh tranh mạnh bởi protozoa (Hungate, 1966; Coleman, 1960) Theo Coleman (1960), 102 – 104 tế bào vi khuẩn của dạ cỏ bị tiêu diệt bởi protozoa mỗi giờ Mức độ nhạy cảm của mỗi loại vi khuẩn đối với protozoa có khác nhau Protozoa tiêu hóa vi khuẩn, do đó làm giảm tốc độ và hiệu quả chuyển hóa protein trong dạ cỏ Với những loại thức ăn dễ tiêu hóa thì điều này không có nghĩa lớn, song đối với thức ăn nghèo nitrogen thì protozoa sẽ làm giảm hiệu quả sử dụng thức ăn nói chung Số lượng vi khuẩn tăng lên khi loại bỏ protozoa trong dạ cỏ Preston và Leng (1991) tiến hành thí nghiệm trên cừu cho thấy tỉ lệ tiêu hóa vật chất khô tăng 18% khi không có protozoa trong dạ cỏ

Tuy nhiên, trong điều kiện ình thường, cũng có sự cộng sinh giữa vi khuẩn và protozoa trong tiêu hóa xơ cũng được ghi nhận Một số vi khuẩn được protozoa nuốt vào có tác dụng lên men trong đó tốt hơn vì mỗi protozoa tạo ra một kiểu “dạ cỏ mini” với các điều kiện ổn định cho vi khuẩn hoạt động Điều này có nghĩa quan trọng đối với vi khuẩn trong trường hợp lượng oxy trong dạ cỏ tăng lên, de doạ đến các vi khuẩn

kỵ khí Một số loài protozoa hấp thu oxygen từ dịch dạ cỏ giúp đảm bảo cho điều kiện

kỵ khí trong dạ cỏ được tốt hơn Ngoài ra, Protozoa nuốt và tích trữ tinh bột, hạn chế tốc độ sinh acid lactic, hạn chế giảm pH đột ngột, nên có lợi cho vi khuẩn phân giải xơ Theo Jouany và Ushida (1999) khi khẩu phần cân bằng dưỡng chất loại bỏ protozoa đã làm tỉ lệ tiêu hóa giảm, tiêu hóa xơ giảm đi 10% khi cừu loại bỏ protozoa Có lẽ do sự hiện diện của protozoa khuyến khích sự hoạt động của vi khuẩn nhầm cạnh tranh với protozoa (Wiliam và Coleman, 1992)

Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn phân giải cellulose và các vi khuẩn khác: Vi khuẩn phân giải protein cung cấp ammoniac, acid amin, isoacid cho vi khuẩn phân giải

xơ Các nhóm vi khuẩn khác nhau cũng có sự cạnh tranh điều kiện sinh tồn của nhau Chẳng hạn, khi gia súc ăn khẩu phần ăn giàu tinh ột nhưng nghèo protein thì số lượng

vi khuẩn phân giải cellulose sẽ giảm và do đó mà tỉ lệ tiêu hóa cellulose thấp Đó là vì

sự có mặt của một lượng đáng kể tinh bột trong khẩu phần kích thích vi khuẩn phân giải bột đường phát triển nhanh nên sử dụng cạn kiệt những yếu tố dinh dưỡng quan trọng (như các loại khoáng, amoniac, acid amin, isoacid) là những yếu tố cũng cần thiết cho vi khuẩn phân giải xơ vốn phát triển chậm hơn (Nguyễn Xuân Trạch et al., 2004)

Mặt khác, tương tác tiêu cực có thể xảy ra giữa vi khuẩn phân giải bột đường và

vi khuẩn phân giải xơ lên quan đến pH trong dạ cỏ Theo Michel và Kayouli (1997), quá trình phân giải chất xơ trong dạ cỏ có hiệu quả cao nhất khi pH dịch dạ cỏ lớn hơn 6,2 Đồng thời, tỉ lệ thức ăn tinh quá cao trong khẩu phần sẽ làm cho acid éo ay hơi sản sinh ra nhanh, làm giảm pH dịch dạ cỏ và do đó mà ức chế hoạt động của vi khuẩn phân giải xơ Vì thế khi trong khẩu phần có quá nhiều bột đường thì khả năng tiêu hóa thức ăn xơ sẽ bị giảm sút

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật dạ cỏ phân g iải cellulose

 Thành phần thức ăn và pH

pH và thành phần thức ăn là hai yếu tố chính ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng hoạt động của vi khuẩn nội sinh dạ cỏ động vật nhai lại Tuy nhiên, chỉ số

pH độc lập không có ảnh hưởng nhiều đến khả năng hoạt động và mật số vi sinh trong

dạ cỏ (Calsamiglia et al., 2007) Sự chuyển dịch trong hàm lượng thức ăn ao gồm thành phần thức ăn (Russel và Baldwin, 1978) và ái lực thức ăn (Russel và Baldwin, 1979) đóng góp rất lớn đến mật số vi sinh trong dạ cỏ

Thực phẩm của động vật nhai lại đóng vai trò chính lên môi trường dạ cỏ Những nhân tố như thành phần thức ăn, quá trình tiêu hoá vật lý và sự hiện diện của các chất phụ phẩm trong thức ăn ảnh hưởng đến số lượng, tỉ lệ và khả năng tiêu hoá của vi sinh vật nội sinh dạ cỏ động vật nhai lại (Tim, 2000) Sự biến đỗi lớn nhất đến môi trường

dạ cỏ diễn ra khi chuyển dịch từ thức ăn tự nhiên sang trạng thái thức ăn hạt Trong suốt quá trình chuyển đổi, cơ chất cho sự lên men của vi sinh vật thay đổi từ thành phần vách tế bào (như cellulose, hemicellulose, pectin) sang thành phần tinh bột Sự lên men diễn ra nhanh chóng và sản sinh ra acid, làm giảm pH của dạ cỏ xuống dưới 5.0 (Calsamiglia et al., 2007) Vi khuẩn phân giải cellulose và protozoa bị ức chế tại

pH đưới 6.0 (Russel và Baldwin, 1978) dẫn đến việc cho ăn phối hợp giữa thức ăn tự

nhiên và thức ăn tinh ột làm giảm khả năng tiêu hoá chất xơ của động vật nhai lại (Slyter et al., 1966)

Sự phát triển của mật độ vi sinh vật theo sự chuyển đổi thành phần thức ăn không phải là một quá trình tức thời Thông thường, số vi khuẩn sinh acid lactic tăng lên khi tinh bột vào thức ăn Ngay lập tức, số vi khuẩn phân giải acid lactic cũng tăng lên và tình trạng dư thừa acid lactic không diễn ra (Tim, 2000) Theo thời gian, số lượng vi khuẩn lactic giảm và hệ môi trường dạ cỏ trở lại mức cân bằng Tuy nhiên, nếu lượng tinh bột thêm vào chiếm tỉ lệ quá lớn hoặc kích thước hạt tinh bột quá nhỏ thì mật số vi sinh sẽ không còn duy trì ổn định Dưới điều kiện đó, lactic acid tràn trong dạ cỏ và vi khuẩn chịu lactic sẽ chiếm ưu thế pH hạ xuống dưới 5 và động vật nhai lại bị nhiễm acid lactic (Calsamiglia et al., 2007) Thêm vào đó, các thành phần trong dạ cỏ bị nhớt hoá bởi sự thành lập bọt trong dạ cỏ.Bọt ngăn cản khả năng ợ hơi cả động vật nhai lại, làm tích tụ khí gas làm căng dạ cỏ Trạng thái này có thể tránh được bằng cách tang kích thước tinh bột và thay thế thức ăn tự nhiên trở lại nhằm cho phép hệ vi sinh thích nghi trong 3 đến 4 tuần

 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Vi sinh vật sinh phân giải cellulose có thể sử dụng nhiều loại carbon khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm của từng loài Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh ột, cellulose

Nghiên cứu của Tăng Thị Chính et al (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập

từ bể ủ rác thải là glucose và CMC Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các xạ khuẩn CD6 - 9 là tinh bột, dòng CD9 - 9 là CMC và saccharose, dòng CD5 - 12 là lactose

 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Nhìn chung, các loài vi khuẩn nội sinh có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen

vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài Peptone và cao nấm men

là hai nguồn Nitrogen thích hợp nhất cho các chủng vi khuẩn và nấm men sinh tổng hợp cellulase (Tăng Thị Chính et al., 1999) Theo Taled et al (2009), 2 dòng vi khuẩn

họ Bacilli có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau như: yeast extract, urea,

peptone, ammonium nitrate Trong đó yeast extract là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của 2 dòng vi khuẩn này

 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ ảnh hưởng mạnh tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn nói riêng Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh, các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 15oC, các loài ưa

ấm thường sinh trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20 - 40o

C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50oC

Khi nghiên cứu các vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45 -

55oC và có thể chịu được nhiệt độ 65 - 80oC (Tăng Thị Chính et al., 1999) Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hương và Hoàng Đình Hòa(2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn

và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50oC Dòng vi khuẩn

Bacillussubtillis có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở nhiệt độ 40oC (Mohamed

et al., 2010) Trong khi đó, Bakare et al (2005) trình ày nhiệt độ tối ưu cho sự sinh

tổng hợp cellulase của dòng Pseudomonas fluorescence trong khoảng 30 - 35oC Theo Tang et al (2004) khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật endo-β-1,4-glucanase cho

thấy, ở chủng vi khuẩn B subtilis nhiệt độ thích hợp cho tổng hợp enzyme là 37oC

2.3 Sự phân giải cellulose ở dạ cỏ động vật nhai lại dưới tác động của vi sinh vật 2.3.1 Enzyme cellulase

 Phân loại

Theo Susan (1995), một trong những đặc tính quan trọng của cellulose là không tan trong nước Tính chất này làm cellulose bền với các tấn công sinh hoá học của vi sinh vật Cellulase là hệ enzyme được sinh ra bởi các vi sinh vật (đặc biệt là vi khuẩn) nội sinh trong dạ cỏ động vật nhai lại Cellulase thúc đẩy phản ứng phân cắt các liên kết β 1,4 D-Glycosidic ở cellulose, phân cắt mộc tố và β-D-glucan

Có năm nhóm cellulose thông dụng dựa trên các phản ứng xúc tác (Susan, 1995):

- Endocellulase: phân cắt ngẫu nhiên các liên kết nội phân tử bên trong mạch, tạo ra các sợi mới với đầu khử

- Exocellulase: phân cắt hai đến bốn đơn phân từ đầu mạch được tạo ra bởi phản ứng với endocellulase, sinh ra tetrasaccharides hoặc disaccharide, như

cellobiose Có hai nhóm exocellulase, exocellulase I hoạt động với đầu khử và exocellulase II hoạt động với đầu không khử

- Cellobiase hoặc beta-glucosidase phân giải sản phẩm của exocellulase thành các đường đơn

- Oxidative cellulase phân cắt cellulose bằng phản ứng oxi hoá khử

- Cellulose phosphorylase cắt cellulose bằng phosphate thay cho nước

Các nhóm enzyme trên lần lượt phân cắt cellulose theo sơ đồ như hình 4

Hình 4: Hoạt động phân giải cellulose của Lutzen và Nielson

(*Nguồn: Lutzen và Nielson, 1983)

G: glucose

(1) Thủy phân trực tiếp do tác dụng của e ocellulase

(2) Thủy phân do tác dụng phối hợp của endocellulase, e ocellulase và glucosidase

3) Thủy phân trước tiên bởi endocellulase và sau đó bởi e ocellulase

2.3.2 Tính chất của enzyme cellulase

 Cellobiohydrolase

Cello iohydrolase (CBH) được tìm thấy đầu tiên ở Trichoderma reesei.Chúng

bao gồm hai loại CBH I và CBH II

 CBH I: có trọng lượng phân tử khoảng 65 kDa, điểm đẳng điện (pI) là 4,4,

chiếm 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma reesei

Enzyme này tác động lên cellulose vô định hình và cellulose kết tinh.Nhưng chúng lại không tác động lên cellulose biến tính như car oxymethyl-cellulose (CMC) hay hydroxyethylcellulose, cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucosidie hay β-glucan.CBH I cấu tạo khoảng 496 amino acid

 CBH II có trọng lượng phân tử là 53 kDa, pI = 5,0, cấu tạo khoảng 471 amino acid Chúng cũng không tác động đến CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose không hòa tan (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

 Endoglucanase

Theo Nguyễn Đức Lượng (2004), Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy

Trichoderma reesei Các nhà khoa học chia chúng làm hai loại Egl I và Egl II

Egl I chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử 48,212 kDa

 Egl II chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử là 42,2 kDa

Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao

Ngoài ra endoglucanse còn được tìm thấy ở Clostridiumthermocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác Các endoglucanase của các vi sinh vật

thường có tính chất không khác biệt nhiều

 β-glucosidase

β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động ở

pH rất rộng (pH = 4,4 – 8,4), trọng lượng phân tử 50 - 98 kDa, pI = 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

β-glucosidase của Trichoderma reesei có cấu tạo khoảng 713 amino acid với

trọng lượng phân tử là 75,341 kDa Trong dịch chiết, chúng chiếm khoảng 1% so với tổng lượng protein thu được(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

β-glucosidase của Clostridium thermocellum được chia làm hai loại Bgl A và Bgl

B Loại Bgl A có cấu tạo khoảng 448 amino acid với trọng lượng phân tử là 51,482 kDa Chúng hoạt động mạnh ở pH = 6,0 - 6,5 và ở nhiệt độ 60oC Chúng tham gia phân giải cello iose nhưng không phân giải CMC (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.4 Một số phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Vật chất khô (DM) của bã mía

Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm ay hơi nước có trong nguyên liệu Cân trọng lượng

nguyên liệu trước và sau khi sấy khô ở 70℃ bằng cân phân tích Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 1993)

2.4.2 Phương pháp phân tích xơ trong thức ăn

Phân tích thành phần hóa học của thức ăn trong phân hoặc sau khi được phân

giải ở điều kiện in vitro có vai trò quan trọng trong đánh giá chất lượng tỉ lệ tiêu hóa ở

gia súc nhai lại, nó giúp chúng ta hiểu rõ hơn về các yếu tố làm hạn chế tỉ lệ tiêu hóa

và năng suất vật nuôi Hệ thống tẩy xác định NDF ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm vì nó nêu được thành phần hemicellulose, cellulose, và lignin trong thức ăn và mức tiêu thụ thức ăn của gia súc Thành phần cầu nối lignin-cellulose được thể hiện ở giá trị ADF và ADL trong hệ thống phân tích xơ thức ăn của Van Soest và Robertson (1979)

Các thành phần ADF, NDF, ADL có vai trò quan trọng để xác định giá trị dinh dưỡng thức ăn Chúng có thể sử dụng để dự đoán tỉ lệ tiêu hóa thức ăn, mức tiêu thụ thức ăn của gia súc nhai lại, giá trị năng lượng trao đổi của thức ăn gia súc nhai lại (Van Soest và Robertson, 1979)

2.4.3 Phương pháp phân tích xơ thô (Crude Fiber-CF)

Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào sự hòa tan hóa các nguồn carbon hòa tan,

pectin, phần lớn protein, lipids, các khoáng hòa tan, một số silica trong môi trường dung dịch acid H2SO4 1,25% Hỗn hợp sau đó được tẩy bằng NaOH 1,25% Phần còn lại là những thành phần của tế bào thực vật bao gồm: hemicellulose, cellulose, lignin, cutin, khoáng không tan và protein màng (AOAC, 1993)

2.4.3 Phương pháp phân tích xơ trung tính (NDF)

Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào sự hòa tan hóa các nguồn carbon hòa tan,

pectin, phần lớn protein, lipids, các khoáng hòa tan, một số silica trong môi trường dung dịch tẩy trung tính Phần còn lại là những thành phần của tế bào thực vật bao gồm: hemicellulose, cellulose, lignin, cutin, khoáng không tan và protein màng (Van Soest và Wine, 1967)

2.4.4 Phương pháp phân tích xơ acid (ADF)

Nguyên tắc: phương pháp xơ acid dựa vào đặc tính không tan trong dung dịch

acid của cellulose, lignin, cutin và khoáng không tan trong thực phẩm Hàm lượng hemicellulose trong mẫu được xác định dựa vào sự chênh lệch khối lượng giữa NDF

và ADF (Reed và Van Soest, 1985)

2.4.5 Phương pháp phân tích lignin (ADL)

Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên sự bền vững của lignin dưới tác dụng của

môi trường acid nồng độ cao (H2SO4 72%) (Van Soest và Robertson, 1979)

2.4.6 Khảo sát đường khử bằng phương pháp Nelson Soymogi (Nelson, 2003)

2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Trần Hồ Diễm Đoan (2013) đã tiến hành phối hợp bốn dòng vi khuẩn dạ cỏ của

dê mạnh gồm DD9, DD5, DD7 và DD13 với nhau và khảo sát hoạt tính phân giải Kết quả cho thấy tổ hợp giữa 2 dòng DD9 và DD7 cho đường kính phân giải 27mm và DM

bã mía được phân giải 11,13% là nghiệm thức hiệu quả nhất được chọn tiến hành định

danh và thực hiện thí nghiệm in vitro Kết quả giải trình tự cho thấy dòng DD9 đồng hình ở mức dộ 94% với dòng Bacillus subtilis RC24 và đồng hình 92% với dòng Bacillus subtilis BA3_1A là kết quả của dòng vi khuẩn DD7 Trong thí nghiệm in vitro, sự phối hợp giữa 3 dòng vi khuẩn dạ cỏ bò (Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20, Bacillus subtilis FS321) và dòng DD9 theo tỉ lệ 1:3 cho hiệu suất

phân giải tốt nhất với tỉ lệ tiêu hóa DM là 21,27%; cellulose là 8,17%, hemicelluloses

là 10,22% và lignin là 2,66%

Lư Vũ Thảo Vi (2012) đã khảo sát khả năng phân giải bã mía khi phối trộn của 2

dòng vi khuẩn dạ cỏ cừu (CD11, CD43) với nhóm vi khuẩn dạ cỏ ò trong điều kiện in vitro đạt được kết quả tỉ lệ tiêu hóa là 13,31% DM , 7,08% cellulose và 3,33%

hemicelluloses

Võ Hoài Bắc et al (2010) đã phân lập được 17 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh cơ chất cellulose, trong đó chọn và định danh hai dòng có khả năng phân giải mạnh nhất Bằng phương pháp định danh, đã xác định được các dòng này là

Bacillus licheniformis (Li) và Bacillus subtilis VTCC-B-505

Võ Văn Phước Quệ (2011) đã phân lập bốn dòng vi khuẩn (Q4, Q5, Q7 và Q8) từ mẫu đất trồng lúa và dạ cỏ bò, có khả năng phân giải cellulose mạnh nhất trên cơ chất rơm rạ và giấy photocopy từ đất trồng lúa và dạ cỏ ò Trong đó, a dòng Q5, Q7 và

Q8 đồng hình 99% với dòng Bacillus megaterium, dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% với dòng Cellulomonas flavigena

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Trúc (2010) đã tìm ra được 2 dòng vi khuẩn hiếu khí (dòng 5 và 22) có hoạt độ phân giải cao phân lập từ bã mía Nghiên cứu cũng cho thấy rằng 2 dòng vi khuẩn này sinh tổng hợp cellulase tốt nhất trong điều kiện pH lần lượt là 5 và 7; nhiệt độ 35oC và 30oC lần lượt cho 2 dòng vi khuẩn 22 và 5 Dòng 5 cho hoạt tính endoglucanase và exoglucanase tối ưu (0,0076 U/ml và 0,0049 U/ml) sau 96 giờ ủ lắc (120 vòng /phút), trong khi đó hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của dòng 22 đạt cực đại sau 48 giờ ủ lắc (120 vòng/phút) với hoạt tính thu được lần lượt là 0,0268 U/ml và 0,0235 U/ml

Lê Thị Việt Hà (2006) đã phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn phân giải cellulose chịu nhiệt, 3 chủng xạ khuẩn ưa nấm, 2 chủng nấm mốc Chọn hỗn hợp các chủng vi sinh vật này làm chế phẩm phân giải phế thải và phụ phẩm mía đường, đạt hiệu quả cao (nhiệt độ ủ đống bùn mía cao 70oC, lượng cellulose bị tiêu hao so với

an đầu là > 23%) Qua đó nhằm nâng cao chất lượng phân phức hợp hữu cơ vi sinh, góp phần cải tạo đất, tăng thêm doanh thu và phát triển bền vững các chương trình mía đường quốc gia

2.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Hungate (1996) phân lập từ dạ cỏ động vật nhai lại ba dòng vi khuẩn Fibrobacter succinogenes, ruminococcus flavefacien và ruminococcus albus được có khả năng tiêu hóa cellulose cao Theo nghiên cứu của Findlay( 1998) các dòng vi khuẩn Fbrobacter succinogenes, Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus, Rumonococcus flavefacien, Clostridium ochheadii, Bacillus licheniformis và Streptococcus anaerobius trong dạ cỏ động vật nhai lại có khả năng phân giải mạnh cellulose

Oyeleke và OkusamMi (2008) đã phân lập từ dạ cỏ của 3 loài động vật (bò, cừu

và dê) Trong đó, các dòng vi khuẩn được xác định gồm: Pseudomonas aeruginosa (9,0%), Bacillus (37,8%), Micrococcus (8,1%) và Streptococcus (44,3%), các dòng nấm gồm Fusarium (21,2%), Penicillium (23,4%), Aspergillus (14,7%) và Mucor

(40,6%)

Morales và Dehority (2009) đã khảo sát ảnh hưởng của ion Ca2+

Paola et al (1996) đã khảo sát sự phân giải bã mía và tinh bột bằng dịch dạ cỏ

động vật nhai lại in vitro dựa trên hàm lượng amino acid sinh ra Kết quả cho thấy

52,7% cellulose và 91,8% tinh bột bị thủy phân trong 24 giờ Hàm lượng amino acid trong dịch phân giải đạt 19,3 mg/ 1g cơ chất trong dịch cellulose và 15,8 mg/ 1g cơ chất trong dịch phân giải tinh bột

Khảo sát trên vi khuẩn dạ cỏ trong điều kiện hiếu khí kích thích sản xuất

linoleic acid Kết quả khảo sát cho thấy dòng vi khuẩn trans-10, cis-12 CLA có khả

năng thích ứng với oxi tốt ở pH> 6,2 (Na-Jin et al., 2005)

Young-Cheol et al (2013) đã tiến hành khảo sát hoạt tính cellulase của hai

dòng vi khuẩn Bacillus sp CS-1 và CS-2 phân lập từ đất kiềm Kết quả cho thấy hai dòng vi khuẩn cho hiệu quả thủy phân lignin cao nhất đạt 68,6% sau 48 giờ Nghiên

cứu trên còn khẳng định sự kết hợp với hoạt động của enzyme laccase thúc đẩy cellulase cho hoạt tính phân giải lignin cao nhất

Enzyme cellulase còn được chứng minh có khả năng kết hợp với pectinase trong điều kiện hiếu khí.Dưới sự có mặt của oxi, cellulase có khả năng làm giảm hàm lượng NDF và ADF trong vỏ đậu từ 355g/kg và 317g/kg xuống còn 303g/kg và 255g/kg sau 45 ngày (Weinberg et al., 1995)

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

 Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Chín dòng vi khuẩn từ dạ cỏ bò, trâu, cừu và dê do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ cung cấp

3.1.3 Hóa chất

Ethanol 95%, agar, H2SO4 đậm đặc, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol (C8H18O) octilic alcohol, acetone, Sodium hidroxide (NaOH), acetate buffer,

3.1.4 Thiết bị, dụng cụ

 Thiết bị

Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), kính hiển vi olympus CHT (Nhật), Quang phổ kế, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm Eppendorf centrifuge 5417 (Đức), tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam),…

 Mẫu vi khuẩn:

Nguồn vi khuẩn do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme cung cấp bao gồm:

- Ba dòng vi khuẩn dạ cỏ bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6), BM21 (Bacillus subtilis S20), BM49 (Bacillus subtilis FS321)

- Hai dòng vi khuẩn dạ cỏ trâu: Dòng vi khuẩn chưa định danh TM9 và TM11

3.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

 Môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến

Bảng 2 Thành phần môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M1)

(*Nguồn:Ryck eboer (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh (2010) )

 Môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến

Bảng 3 Thành phần môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M2)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thí nghiệm 1: Chọn lọc tổ hợp vi khuẩn hiếu khí phân giải bã mía tốt nhất

 Mục đích thí nghiệm: Tuyển chọn tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ đa chủng để phân giải

bã mía hiệu quả

+ Vi khuẩn dạ cỏ cừu: CD11 (Achromobacter piechaudii M52) và CD43 (Bacillus tequilensis TXJB 020) (nhóm 3)

+ Vi khuẩn dạ cỏ dê: DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A) và DD9 (Bacillus subtilis

RC24) (nhóm 4)

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại, 11 nghiệm thức Tổng đơn vị thí nghiệm là 33 Trong đó, nghiệm thức 1 là đối chứng âm.Nghiệm thức 2 đến nghiệm thức 11 là được bố trí như ảng 5

Nhóm 3 (% v/v)

Nhóm 4 (% v/v)

+ Môi trường: Cân phân tích 1g bã mía, cho vào bình tam giác chứa 47 ml môi trường khoáng M3 Khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại ỏ các vi sinh vật trong môi trường Để nguội

+ Thành phần của mỗi nghiệm thức được cho vào ình tam giác chứa môi trường

đã chuẩn ị sẵn ố trí theo Bảng 3 Chủng dịch vi khuẩn các nhóm vào từng nghiệm thức tương ứng (6% dịch vi khuẩn mật số 107

CFU/ml) Sau đó, dùng nút gòn và nắp giấy đậy nắp ình ủ, sao cho không khí có thể lưu thông nhưng không để vi sinh vật tạo nhiễm Sắp xếp tất cả các ình ủ vào khay inox cho vào ồn ủ lắc nhiệt (lắc ngang

ở 80 vòng/ phút) cách thủy, nhiệt độ ủ ở 38ºC Sau 3 ngày ủ, thu mẫu để đánh giá kết quả thí nghiệm theo các chỉ tiêu DM, xơ thô (NDF)

+ Đo chỉ số pH và đường khử của dịch phân giải

+ So sánh đánh giá và xử lí số liệu nhằm đưa ra các tổ hợpvi khuẩn phân giải tối

 Mục đích thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện pH khác nhau lên sự

phân giải bã mía của các tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc trong thí nghiệm 1 nhằm tìm

ra điều kiện pH tối ưu lên sự phân giải

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố tríhoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp

lại, 6 nghiệm thức pH (4, 5, 5,5, 6, 7, 8) Trong đó, có một mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn ở từng nghiệm thức pH

 Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đã được tuyển chọn trong thí nghiệm 1

 Tiến hành thí nghiệm

+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2 Ủ ở 38oC trong 3 ngày

+ Chuẩn bị môi trường: Môi trường M3 được chuẩn bị như ảng 3 Cân phân

tích 1g bã mía và cho vào các bình tam giác có chứa 44ml môi trường khoáng M3 Môi trường sau khi pha xong được chuẩn pH về các giá trị tương đương các nghiệm thức: 4; 5; 5,5; 6; 7; 8 Khử trùng ở 121oC trong 20 phút Để nguội

Chủng 3ml (6%) dịch vi khuẩn (mật số 107CFU/ml) đã chuẩn bị vào bình tam giác chứa môi trường có pH tương ứng với các nghiệm thức Sau đó, đậy nắp bình tam giác bằng nút gòn và nắp giấy sao cho không khí có thể lưu thông được nhưng tránh được tạp nhiễm vi sinh vật Ủ lắc cách thuỷ các binh tam giác ở các nhiệt độ 38o

C

Sau 3 ngày, tiến hành lọc môi trường thu lấy ã mía Xác định chỉ số pH, đường khử của dịch phân giải và chỉ số xơ thô (NDF), vật chất khô (DM) của bã mía.Phân tích kết quả thí nghiệm và chọn lọc nghiệm thức pH tối ưu cho quá trình phân giải bã mía phục vụ các thí nghiệm sau

 Chỉ tiêu theo dõi

- Mục đích thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng các mốc thời gian ủ khác nhau lên sự phân

giải bã mía của các tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc trong thí nghiệm 1 nhằm tìm ra mốc thời gian ủ tối ưu lên sự phân giải

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 10

nghiệm thức thời gian Trong dó, mỗi nghiệm thức có một mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn

- Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đã được tuyển chọn trong thí nghiệm 1

- Tiến hành thí nghiệm:

+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2 Ủ ở 38oC trong 3 ngày

+Chuẩn bị môi trường: Môi trường M3 được chuẩn bị như ảng 3 Cân phân

tích 1g bã mía và cho vào các bình tam giác có chứa 44ml môi trường khoáng M3

Chuẩn độ pH về pH tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 3 Môi trường sau khi pha xong được khử trùng ở 121oC trong 20 phút Để nguội

Chủng 3ml (6%) dịch vi khuẩn (mật số 107CFU/ml) đã chuẩn bị vào bình tam giác chứa môi trường tương ứng với các nghiệm thức Sau đó, đậy nắp bình tam giác bằng nút gòn và nắp giấy sao cho không khí có thể lưu thông được nhưng tránh được tạp nhiễm vi sinh vật Ủ lắc cách thuỷ các binh tam giác ở nhiệt độ 38oC

3.2.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên sự phân giải

bã mía trong điều kiện hiếu khí

 Mục đích thí nghiệm:Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện nhiệt độ khác nhau lên

sự phân giải bã mía của các tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc qua thí nghiệm 1 nhằm tìm ra điều kiện nhiệt độ tối ưu lên sự phân giải trong điều kiện hiếu khí

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại, 6

nghiệm thức nhiệt độ (30oC, 38oC, 40oC, 45oC, 50oC, 60oC) và có 6 mẫu đối chứng (ĐC) tương ứng với 6 nghiệm thức

 Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đã được tuyển chọn trong thí nghiệm 1

 Tiến hành thí nghiệm:

+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2 Ủ ở 38oC trong 3 ngày (Dựa vào đường tăng trưởng vi khuẩn ở phụ lục các phương pháp thí nghiệm) đến khi đạt mật số 107

CFU/ml trong môi trường M2

+ Môi trường: Cân phân tích 1g bã mía, cho vào bình tam giác chứa 47 ml môi trường khoáng M3 Chuẩn độ pH môi trường về pH tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm

2 Khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại ỏ các vi sinh vật trong môi trường Để nguội

+ Chủng dịch tổ hợp vi khuẩn vào từng nghiệm thức tương ứng (6% dịch vi khuẩn mật số 107

CFU/ml) Sau đó, dùng nút gòn và nắp giấy đậy nắp ình ủ, sao cho không khí có thể lưu thông nhưng không để vi sinh vật tạo nhiễm Sắp xếp tất cả các ình ủ vào khay inox cho vào ồn ủ lắc nhiệt (lắc ngang ở 80 vòng/ phút) cách thủy, điều chỉnh các nghiệm thức nhiệt độ ủ khác nhau (30o

C, 38oC, 40oC, 45oC, 50oC,

60oC) Sau thời gian ủ tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 3, thu mẫu để đánh giá kết quả thí nghiệm theo các chỉ tiêu DM, xơ thô (CF) và đường khử của dịch phân giải + Đo chỉ số pH và đường khử của dịch phân giải

+ So sánh đánh giá và xử lí số liệu nhằm chọn tổ hợp vi khuẩn phân giải tối ưu

 Chỉ tiêu theo dõi

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành hoàn toàn ngẫu nhiên trên sáu loại

muối nitrogen khác nhau, hàm lượng nitơ trong từng loại muối được cố định Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức các loại muối, 3 lặp lại và một mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn ở từng nghiệm thức

Hàm lượng muối trong các thí nghiệm thể hiện ở bảng sau:

Bảng 7 Bảng bố trí thay đổi các loại muối

Loại muối Phân tử lượng (g) Hàm lượng nitơ (g) Nồng độ (g/l)

CFU/ml trong môi trường M2

Mỗi dòng vi khuẩn của tổ hợp được chọn trong TN1 được nuôi cấy trong môi trường M2 ở nhiệt độ được chọn trong TN2, pH được chọn trong TN3, thời gian được chọn từ TN4 cho đến khi đạt mật số 107 CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn trên (phụ lục các phương pháp thí nghiệm)

Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107 CFU/ml vào môi trường M3 (thay (NH4)2SO4 bằng các loại muối như ố trí ở bảng 7) Thêm vào môi trường 2g bã mía

Ủ lắc nhiệt ngang (80 vòng/phút) với thời gian tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm

4 dưới điều kiện hiếu khí

+Chuẩn bị môi trường: Môi trường M3 (thay NH4NO3 bằng các loại muối tương ứng ở các nghiệm thức theo nồng độ như ảng 7) Cân phân tích 1g bã mía và cho vào các bình tam giác có chứa 44ml môi trường khoáng M3 Chuẩn độ pH về pH tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 2 Môi trường sau khi pha xong được khử trùng ở 121oC trong

20 phút Để nguội và ủ ở nhiệt độ tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 4 trong 15 phút trước khi sử dụng để tạo điều kiện nhiệt độ tốt, tránh sốc nhiệt cho vi sinh vật dạ cỏ Chủng 3ml (6%) dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào bình tam giác chứa môi trường tương ứng với các nghiệm thức Sau đó, đậy nắp bình tam giác bằng nút gòn và nắp giấy sao cho không khí có thể lưu thông được nhưng tránh được tạp nhiễm vi sinh vật

Ủ lắc cách thuỷ các binh tam giác ở nhiệt độ tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 4

Sau thời gian ủ tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 3, tiến hành thu hồi các bình ủ, lọc và sấy khô bã mía nhằm khảo sát các chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu theo dõi

+ Trọng lượng khô (DM) của ã mía Đây là chỉ tiêu quan trọng nhất nhằm đánh giá hiệu quả của quá trình phân giải

+ Hàm lượng cellulose dựa theo chỉ sốADF và ADL của bã mía

+ Hàm lượng hemicellulose dựa theo chỉ số NDF, ADF của bã mía

+ Hàm lượng lignin dựa theo chỉ số ADL của bã mía

+ Nồng độ đường sinh ra trong dịch phân giải

3.2.3 Phương pháp phân tích kết quả thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm được phân tích thống kê bằng phần mềm STATGRAPHIC PLUS 3.0