Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013
3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Chín dòng vi khuẩn từ dạ cỏ bò, trâu, cừu và dê do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ cung cấp.
3.1.3. Hóa chất
Ethanol 95%, agar, H2SO4 đậm đặc, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol (C8H18O) octilic alcohol, acetone, Sodium hidroxide (NaOH), acetate buffer,...
3.1.4. Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị
Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), kính hiển vi olympus CHT (Nhật), Quang phổ kế, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm Eppendorf centrifuge 5417 (Đức), tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam),…
Dụng cụ
Bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Hoa Kỳ), đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 500 ml,petri đường kính 8cm (Đức), ống nghiệm 15ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: kính lúp, que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…
Hình 5. Một số thiết bị thí nghiệm 3.1.5. Nguyên vật liệu
Bã mía
Sau khi thu từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang sẽ được sấy ở 70oC trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới là 0,2mm. Bột bã mía sau khi nghiền được rửa với nước lọc nhiều lần để loại đường.
Mẫu vi khuẩn:
Nguồn vi khuẩn do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme cung cấp bao gồm: - Ba dòng vi khuẩn dạ cỏ bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6), BM21 (Bacillus subtilis S20), BM49 (Bacillus subtilis FS321).
- Hai dòng vi khuẩn dạ cỏ trâu: Dòng vi khuẩn chưa định danh TM9 và TM11 (Achromobacter xylosoxidans).
- Hai dòng vi khuẩn dạ cỏ cừu: CD11 (Achromobacter piechaudii M52) và CD43 (Bacillus tequilensis TXJB 020).
- Hai dòng vi khuẩn dạ cỏ dê: DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A) và DD9 (Bacillus subtilis RC24).
3.1.5. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật.
Môi trƣờng đặc Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 2. Thành phần môi trƣờng đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M1)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích Đơn vị
Bột bã mía 10 Gram (NH4)2SO4 1 Gram K2HPO4 1 Gram MgSO4.7H2O 0,5 Gram NaCl 0,001 Gram Agar 20 Gram Nước 1000 ml
(*Nguồn:Ryck eboer (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh (2010) )
Môi trƣờng lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 3. Thành phần môi trƣờng lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M2)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích Đơn vị
Bột bã mía 10 Gram (NH4)2SO4 1 Gram K2HPO4 1 Gram MgSO4.7H2O 0,5 Gram NaCl 0,001 Gram Nước 1000 ml
(*Nguồn:Ryck eboer (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh (2010))
Môi trƣờng (2003)
Bảng 4. Thành phần môi trƣờng khoáng (M3)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích Đơn vị
(NH4)2SO4 1 Gram
K2HPO4 1 Gram
MgSO4.7H2O 0,5 Gram
NaCl 0,001 Gram
Nước 1000 ml
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thí nghiệm 1: Chọn lọc tổ hợp vi khuẩn hiếu khí phân giải bã mía tốt nhất
Mục đích thí nghi ệm: Tuyển chọn tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ đa chủng để phân giải bã mía hiệu quả.
Mẫu vi khuẩn
+ Tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6), BM21 (Bacillus subtilis S20), BM49 (Bacillus subtilis FS321) (nhóm 1).
+ Vi khuẩn dạ cỏ cừu: CD11 (Achromobacter piechaudii M52) và CD43 (Bacillus tequilensis TXJB 020) (nhóm 3).
+ Vi khuẩn dạ cỏ dê: DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A) và DD9 (Bacillus subtilis
RC24) (nhóm 4).
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại, 11 nghiệm thức. Tổng đơn vị thí nghiệm là 33. Trong đó, nghiệm thức 1 là đối chứng âm.Nghiệm thức 2 đến nghiệm thức 11 là được bố trí như ảng 5.
Tiến hành thí nghi ệm
Bảng 5. Bố trí tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn của các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 * Ghi chú: - NT: Nghiệm thức, ĐC: đối chúng - 1: Tổ hợp nhóm vi k huẩn dạ cỏ bò. - 2: Tổ hợp nhóm vi k huẩn dạ cỏ trâu. - 3: Tổ hợp nhóm vi k huẩn dạ cỏ cừu. - 4: Tổ hợp nhóm vi k huẩn dạ cỏ dê
+ Cân 2g bã mía, sấy ở 70oC trong 1 giờ và đo đạt khối lượng vật chất khô (DM).
+ Chuẩn bị môi trường khoáng: Môi trường M3 dùng để pha loãng các nồng độ như theo ảng 3. Dung dịch sau khi pha xong được đặt vào bồn ủ nhiệt ở 38℃ trong 15 phút trước khi sử dụng để tạo điều kiện nhiệt độ tốt, tránh sốc nhiệt cho vi sinh vật dạ cỏ.
+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2. Ủ ở 38oC trong 3 ngày. NT Nhóm 1 (% v/v) Nhóm 2 (% v/v) Nhóm 3 (% v/v) Nhóm 4 (% v/v) 1 = ĐC 0 - - - 2 6 - - - 3 1.5 4.5 - - 4 1.5 - 4.5 - 5 1.5 - - 4.5 6 3 3 - - 7 3 - 3 - 8 3 - - 3 9 4.5 1.5 - - 10 4.5 - 1.5 - 11 4.5 - - 1.5
+ Môi trường: Cân phân tích 1g bã mía, cho vào bình tam giác chứa 47 ml môi trường khoáng M3. Khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại ỏ các vi sinh vật trong môi trường. Để nguội.
+ Thành phần của mỗi nghiệm thức được cho vào ình tam giác chứa môi trường đã chuẩn ị sẵn ố trí theo Bảng 3. Chủng dịch vi khuẩn các nhóm vào từng nghiệm thức tương ứng (6% dịch vi khuẩn mật số 107
CFU/ml). Sau đó, dùng nút gòn và nắp giấy đậy nắp ình ủ, sao cho không khí có thể lưu thông nhưng không để vi sinh vật tạo nhiễm. Sắp xếp tất cả các ình ủ vào khay inox cho vào ồn ủ lắc nhiệt (lắc ngang ở 80 vòng/ phút) cách thủy, nhiệt độ ủ ở 38ºC. Sau 3 ngày ủ, thu mẫu để đánh giá kết quả thí nghiệm theo các chỉ tiêu DM, xơ thô (NDF).
+ Đo chỉ số pH và đường khử của dịch phân giải.
+ So sánh đánh giá và xử lí số liệu nhằm đưa ra các tổ hợpvi khuẩn phân giải tối ưu.
Chỉ tiêu theo dõi
+ Phần trăm vật chất khô (DM) + Phần trămxơ thô (CF)
+ Nồng độ đường sinh ra
3.2.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện pH lên sự phân giải cơ chất bã mía
Mục đích thí nghi ệm: Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện pH khác nhau lên sự phân giải bã mía của các tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc trong thí nghiệm 1 nhằm tìm ra điều kiện pH tối ưu lên sự phân giải.
Bố trí thí nghi ệm: Thí nghiệm được bố tríhoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, 6 nghiệm thức pH (4, 5, 5,5, 6, 7, 8). Trong đó, có một mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn ở từng nghiệm thức pH.
Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đã được tuyển chọn trong thí nghiệm 1. Tiến hành thí nghiệm
+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2. Ủ ở 38oC trong 3 ngày.
+ Chuẩn bị môi trƣờng: Môi trường M3 được chuẩn bị như ảng 3. Cân phân tích 1g bã mía và cho vào các bình tam giác có chứa 44ml môi trường khoáng M3. Môi trường sau khi pha xong được chuẩn pH về các giá trị tương đương các nghiệm thức: 4; 5; 5,5; 6; 7; 8 . Khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Để nguội.
Chủng 3ml (6%) dịch vi khuẩn (mật số 107CFU/ml) đã chuẩn bị vào bình tam giác chứa môi trường có pH tương ứng với các nghiệm thức. Sau đó, đậy nắp bình tam giác bằng nút gòn và nắp giấy sao cho không khí có thể lưu thông được nhưng tránh được tạp nhiễm vi sinh vật. Ủ lắc cách thuỷ các binh tam giác ở các nhiệt độ 38o
C. Sau 3 ngày, tiến hành lọc môi trường thu lấy ã mía. Xác định chỉ số pH, đường khử của dịch phân giải và chỉ số xơ thô (NDF), vật chất khô (DM) của bã mía.Phân tích kết quả thí nghiệm và chọn lọc nghiệm thức pH tối ưu cho quá trình phân giải bã mía phục vụ các thí nghiệm sau.
Chỉ tiêu theo dõi
+ Phần trăm vật chất khô (DM) + Phần trăm xơ thô (CF)
+ Nồng độ đường sinh ra
3.2.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hƣởng của thời gian ủ lên men lên sự phân giải cơ chất bã mía
- Mục đích thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng các mốc thời gian ủ khác nhau lên sự phân giải bã mía của các tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc trong thí nghiệm 1 nhằm tìm ra mốc thời gian ủ tối ưu lên sự phân giải
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 10 nghiệm thức thời gian. Trong dó, mỗi nghiệm thức có một mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn.
- Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đã được tuyển chọn trong thí nghiệm 1
- Tiến hành thí nghiệm:
+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2. Ủ ở 38oC trong 3 ngày.
+Chuẩn bị môi trƣờng: Môi trường M3 được chuẩn bị như ảng 3. Cân phân tích 1g bã mía và cho vào các bình tam giác có chứa 44ml môi trường khoáng M3.
Chuẩn độ pH về pH tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 3. Môi trường sau khi pha xong được khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Để nguội.
Chủng 3ml (6%) dịch vi khuẩn (mật số 107CFU/ml) đã chuẩn bị vào bình tam giác chứa môi trường tương ứng với các nghiệm thức. Sau đó, đậy nắp bình tam giác bằng nút gòn và nắp giấy sao cho không khí có thể lưu thông được nhưng tránh được tạp nhiễm vi sinh vật. Ủ lắc cách thuỷ các binh tam giác ở nhiệt độ 38oC.
Bảng 6. Bảng bố trí thí nghiệm 3 Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 Thời gian (ngày) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 *Chú thích: NT: nghiệm thức
Sau các nghiệm thức thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ngày (như ảng 6), lần lượt thu hồi các bình tam giác, tiến hành lọc môi trường thu lấy ã mía. Xác định chỉ số pH, đường khử của dịch phân giải và chỉ số xơ thô (CF), vật chất khô (DM) của bã mía.
Phân tích kết quả thí nghiệm và chọn lọc nghiệm thức thời gian ủ tối ưu cho quá trình phân giải bã mía phục vụ các thí nghiệm sau.
Chỉ tiêu theo dõi
+ Phần trăm vật chất khô (DM) + Phần trăm xơ thô (CF)
+ Nồng độ đường sinh ra
3.2.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ lên sự phân giải bã mía trong điều kiện hiếu khí
Mục đích thí nghi ệm:Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện nhiệt độ khác nhau lên sự phân giải bã mía của các tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc qua thí nghiệm 1 nhằm tìm ra điều kiện nhiệt độ tối ưu lên sự phân giải trong điều kiện hiếu khí.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại, 6 nghiệm thức nhiệt độ (30oC, 38oC, 40oC, 45oC, 50oC, 60oC) và có 6 mẫu đối chứng (ĐC) tương ứng với 6 nghiệm thức.
Tiến hành thí nghiệm:
+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2. Ủ ở 38oC trong 3 ngày (Dựa vào đường tăng trưởng vi khuẩn ở phụ lục các phương pháp thí nghiệm) đến khi đạt mật số 107
CFU/ml trong môi trường M2.
+ Môi trường: Cân phân tích 1g bã mía, cho vào bình tam giác chứa 47 ml môi trường khoáng M3. Chuẩn độ pH môi trường về pH tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 2. Khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại ỏ các vi sinh vật trong môi trường. Để nguội.
+ Chủng dịch tổ hợp vi khuẩn vào từng nghiệm thức tương ứng (6% dịch vi khuẩn mật số 107
CFU/ml). Sau đó, dùng nút gòn và nắp giấy đậy nắp ình ủ, sao cho không khí có thể lưu thông nhưng không để vi sinh vật tạo nhiễm. Sắp xếp tất cả các ình ủ vào khay inox cho vào ồn ủ lắc nhiệt (lắc ngang ở 80 vòng/ phút) cách thủy, điều chỉnh các nghiệm thức nhiệt độ ủ khác nhau (30o
C, 38oC, 40oC, 45oC, 50oC, 60oC). Sau thời gian ủ tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 3, thu mẫu để đánh giá kết quả thí nghiệm theo các chỉ tiêu DM, xơ thô (CF) và đường khử của dịch phân giải.
+ Đo chỉ số pH và đường khử của dịch phân giải.
+ So sánh đánh giá và xử lí số liệu nhằm chọn tổ hợp vi khuẩn phân giải tối ưu. Chỉ tiêu theo dõi
+ Phần trăm vật chất khô + Phần trăm xơ thô (CF) + Nồng độ đường sinh ra
3.2.5. Thí Nghiệm 5: Ảnh hƣởng của các loại muối Nitrogen khác nhau đến khả năng phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn hiếu khí
Mục đích: Tìm được loại muối nitrogen thích hợp cho việc sản sinh cellulase của vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành hoàn toàn ngẫu nhiên trên sáu loại muối nitrogen khác nhau, hàm lượng nitơ trong từng loại muối được cố định. Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức các loại muối, 3 lặp lại và một mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn ở từng nghiệm thức.
Bảng 7. Bảng bố trí thay đổi các loại muối
Loại muối Phân tử lƣợng (g) Hàm lƣợng nitơ (g) Nồng độ (g/l)
(NH4)2SO4 132,1 0,21 1,0 NH4Cl 53,56 0,21 0,81 NaNO3 84,99 0,21 1,28 NH4NO3 80,04 0,21 0,60 KNO3 101,1 0,21 1,53 NH4H2PO4 115,02 0,21 1,74 Tiến hành thí nghiệm
+ Chuẩn bị vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2. Ủ ở 38o
C trong 3 ngày (Dựa vào đường tăng trưởng vi khuẩn ở phụ lục các phương pháp thí nghiệm) đến khi đạt mật số 107
CFU/ml trong môi trường M2.
Mỗi dòng vi khuẩn của tổ hợp được chọn trong TN1 được nuôi cấy trong môi trường M2 ở nhiệt độ được chọn trong TN2, pH được chọn trong TN3, thời gian được chọn từ TN4 cho đến khi đạt mật số 107 CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn trên (phụ lục các phương pháp thí nghiệm).
Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107 CFU/ml vào môi trường M3 (thay (NH4)2SO4 bằng các loại muối như ố trí ở bảng 7). Thêm vào môi trường 2g bã mía.
Ủ lắc nhiệt ngang (80 vòng/phút) với thời gian tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 4 dưới điều kiện hiếu khí.
+Chuẩn bị môi trƣờng: Môi trường M3 (thay NH4NO3 bằng các loại muối tương ứng ở các nghiệm thức theo nồng độ như ảng 7). Cân phân tích 1g bã mía và cho vào các bình tam giác có chứa 44ml môi trường khoáng M3. Chuẩn độ pH về pH tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 2. Môi trường sau khi pha xong được khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Để nguội và ủ ở nhiệt độ tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 4 trong 15 phút trước khi sử dụng để tạo điều kiện nhiệt độ tốt, tránh sốc nhiệt cho vi sinh vật dạ cỏ.
Chủng 3ml (6%) dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào bình tam giác chứa môi trường tương ứng với các nghiệm thức. Sau đó, đậy nắp bình tam giác bằng nút gòn và nắp giấy sao cho không khí có thể lưu thông được nhưng tránh được tạp nhiễm vi sinh vật. Ủ lắc cách thuỷ các binh tam giác ở nhiệt độ tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 4.
Sau thời gian ủ tối ưu đã khảo sát qua thí nghiệm 3, tiến hành thu hồi các bình ủ, lọc và sấy khô bã mía nhằm khảo sát các chỉ tiêu theo dõi.
Chỉ tiêu theo dõi
+ Trọng lượng khô (DM) của ã mía. Đây là chỉ tiêu quan trọng nhất nhằm đánh giá hiệu quả của quá trình phân giải
+ Hàm lượng cellulose dựa theo chỉ sốADF và ADL của bã mía + Hàm lượng hemicellulose dựa theo chỉ số NDF, ADF của bã mía + Hàm lượng lignin dựa theo chỉ số ADL của bã mía
+ Nồng độ đường sinh ra trong dịch phân giải
3.2.3. Phƣơng pháp phân tích kết quả thí nghiệm
Kết quả thí nghiệm được phân tích thống kê bằng phần mềm STATGRAPHIC PLUS 3.0.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thành phần nguyên liệu
Bảng 8. Hàm lƣợng các thành phần khảo sát trong bã mía nguyên li ệu
Hàm lƣợng vật chất khô (% ) Hàm lƣợng Cellulose (% ) Hàm lƣợng Hemicellulose (% ) Hàm lƣợng Lignin(% ) Hàm lƣợng tro (% ) 90,94 56,13 18,56 18,80 1,52
Hàm lượng vật chất khô sau khi sấy đến trọng lượng không đổi ở 70o
C trong 48 giờ của bã mía nguyên liệu đạt 90,94%. Kết quả này cao hơn với kết quả của Đào Lệ Hằng (2008) với 85,49% vật chất khô ở ngọn mía. Tuy nhiên, 90,94% vật chất khô