2.4.1. Vật chất khô (DM) của bã mía
Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm ay hơi nước có trong nguyên liệu. Cân trọng lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy khô ở 70℃ bằng cân phân tích. Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 1993).
2.4.2. Phƣơng pháp phân tích xơ trong thức ăn
Phân tích thành phần hóa học của thức ăn trong phân hoặc sau khi được phân giải ở điều kiện in vitro có vai trò quan trọng trong đánh giá chất lượng tỉ lệ tiêu hóa ở gia súc nhai lại, nó giúp chúng ta hiểu rõ hơn về các yếu tố làm hạn chế tỉ lệ tiêu hóa và năng suất vật nuôi. Hệ thống tẩy xác định NDF ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm vì nó nêu được thành phần hemicellulose, cellulose, và lignin trong thức ăn và mức tiêu thụ thức ăn của gia súc. Thành phần cầu nối lignin- cellulose được thể hiện ở giá trị ADF và ADL trong hệ thống phân tích xơ thức ăn của Van Soest và Robertson (1979).
Các thành phần ADF, NDF, ADL có vai trò quan trọng để xác định giá trị dinh dưỡng thức ăn. Chúng có thể sử dụng để dự đoán tỉ lệ tiêu hóa thức ăn, mức tiêu thụ thức ăn của gia súc nhai lại, giá trị năng lượng trao đổi của thức ăn gia súc nhai lại (Van Soest và Robertson, 1979).
2.4.3. Phƣơng pháp phân tích xơ thô (Crude Fiber-CF)
Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào sự hòa tan hóa các nguồn carbon hòa tan, pectin, phần lớn protein, lipids, các khoáng hòa tan, một số silica trong môi trường dung dịch acid H2SO4 1,25%. Hỗn hợp sau đó được tẩy bằng NaOH 1,25%. Phần còn lại là những thành phần của tế bào thực vật bao gồm: hemicellulose, cellulose, lignin, cutin, khoáng không tan và protein màng. (AOAC, 1993).
2.4.3. Phƣơng pháp phân tích xơ trung tính (NDF)
Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào sự hòa tan hóa các nguồn carbon hòa tan, pectin, phần lớn protein, lipids, các khoáng hòa tan, một số silica trong môi trường dung dịch tẩy trung tính. Phần còn lại là những thành phần của tế bào thực vật bao gồm: hemicellulose, cellulose, lignin, cutin, khoáng không tan và protein màng (Van Soest và Wine, 1967).
2.4.4. Phƣơng pháp phân tích xơ acid (ADF)
Nguyên tắc: phương pháp xơ acid dựa vào đặc tính không tan trong dung dịch acid của cellulose, lignin, cutin và khoáng không tan trong thực phẩm. Hàm lượng hemicellulose trong mẫu được xác định dựa vào sự chênh lệch khối lượng giữa NDF và ADF (Reed và Van Soest, 1985).
2.4.5. Phƣơng pháp phân tích lignin (ADL)
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên sự bền vững của lignin dưới tác dụng của môi trường acid nồng độ cao (H2SO4 72%) (Van Soest và Robertson, 1979).
2.4.6. Khảo sát đƣờng khử bằng phƣơng pháp Nelson Soymogi (Nelson, 2003) Nguyên tắc
- Thí nghiệm dựa trên phản ứng của các nhóm đường khử với dung dịch Nelson (Nelson, 2003).
- Đường khử sẽ phản ứng với dung dịch đồng và chuyển sang màu nâu đỏ khi bị đun nóng. Khi Aseno Mo lypdate được thêm vào hỗn hợp, dung dịch sẽ chuyển sang màu danh và hấp thụ ước sóng 520mM.
2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.5.1. Các nghiên cứu trong nƣớc 2.5.1. Các nghiên cứu trong nƣớc
Trần Hồ Diễm Đoan (2013) đã tiến hành phối hợp bốn dòng vi khuẩn dạ cỏ của dê mạnh gồm DD9, DD5, DD7 và DD13 với nhau và khảo sát hoạt tính phân giải. Kết quả cho thấy tổ hợp giữa 2 dòng DD9 và DD7 cho đường kính phân giải 27mm và DM bã mía được phân giải 11,13% là nghiệm thức hiệu quả nhất được chọn tiến hành định danh và thực hiện thí nghiệm in vitro. Kết quả giải trình tự cho thấy dòng DD9 đồng hình ở mức dộ 94% với dòng Bacillus subtilis RC24 và đồng hình 92% với dòng
Bacillus subtilis BA3_1A là kết quả của dòng vi khuẩn DD7. Trong thí nghiệm in vitro, sự phối hợp giữa 3 dòng vi khuẩn dạ cỏ bò (Achromobacter xylosoxidans BL6,
Bacillus subtilis S20, Bacillus subtilis FS321) và dòng DD9 theo tỉ lệ 1:3 cho hiệu suất phân giải tốt nhất với tỉ lệ tiêu hóa DM là 21,27%; cellulose là 8,17%, hemicelluloses là 10,22% và lignin là 2,66%.
Lư Vũ Thảo Vi (2012) đã khảo sát khả năng phân giải bã mía khi phối trộn của 2 dòng vi khuẩn dạ cỏ cừu (CD11, CD43) với nhóm vi khuẩn dạ cỏ ò trong điều kiện in vitro đạt được kết quả tỉ lệ tiêu hóa là 13,31% DM , 7,08% cellulose và 3,33% hemicelluloses.
Võ Hoài Bắc et al. (2010) đã phân lập được 17 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh cơ chất cellulose, trong đó chọn và định danh hai dòng có khả năng phân giải mạnh nhất. Bằng phương pháp định danh, đã xác định được các dòng này là
Võ Văn Phước Quệ (2011) đã phân lập bốn dòng vi khuẩn (Q4, Q5, Q7 và Q8) từ mẫu đất trồng lúa và dạ cỏ bò, có khả năng phân giải cellulose mạnh nhất trên cơ chất rơm rạ và giấy photocopy từ đất trồng lúa và dạ cỏ ò. Trong đó, a dòng Q5, Q7 và Q8 đồng hình 99% với dòng Bacillus megaterium, dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% với dòng Cellulomonas flavigena.
Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Trúc (2010) đã tìm ra được 2 dòng vi khuẩn hiếu khí (dòng 5 và 22) có hoạt độ phân giải cao phân lập từ bã mía. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng 2 dòng vi khuẩn này sinh tổng hợp cellulase tốt nhất trong điều kiện pH lần lượt là 5 và 7; nhiệt độ 35oC và 30oC lần lượt cho 2 dòng vi khuẩn 22 và 5. Dòng 5 cho hoạt tính endoglucanase và exoglucanase tối ưu (0,0076 U/ml và 0,0049 U/ml) sau 96 giờ ủ lắc (120 vòng /phút), trong khi đó hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của dòng 22 đạt cực đại sau 48 giờ ủ lắc (120 vòng/phút) với hoạt tính thu được lần lượt là 0,0268 U/ml và 0,0235 U/ml.
Lê Thị Việt Hà (2006) đã phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn phân giải cellulose chịu nhiệt, 3 chủng xạ khuẩn ưa nấm, 2 chủng nấm mốc. Chọn hỗn hợp các chủng vi sinh vật này làm chế phẩm phân giải phế thải và phụ phẩm mía đường, đạt hiệu quả cao (nhiệt độ ủ đống bùn mía cao 70oC, lượng cellulose bị tiêu hao so với an đầu là > 23%). Qua đó nhằm nâng cao chất lượng phân phức hợp hữu cơ vi sinh, góp phần cải tạo đất, tăng thêm doanh thu và phát triển bền vững các chương trình mía đường quốc gia.
2.5.2. Các nghiên cứu ngoài nƣớc
Hungate (1996) phân lập từ dạ cỏ động vật nhai lại ba dòng vi khuẩn Fibrobacter succinogenes, ruminococcus flavefacien và ruminococcus albus được có khả năng tiêu hóa cellulose cao. Theo nghiên cứu của Findlay( 1998) các dòng vi khuẩn Fbrobacter succinogenes, Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus, Rumonococcus flavefacien, Clostridium ochheadii, Bacillus licheniformis và Streptococcus anaerobius trong dạ cỏ động vật nhai lại có khả năng phân giải mạnh cellulose.
Oyeleke và OkusamMi (2008) đã phân lập từ dạ cỏ của 3 loài động vật (bò, cừu và dê). Trong đó, các dòng vi khuẩn được xác định gồm: Pseudomonas aeruginosa
(9,0%), Bacillus (37,8%), Micrococcus (8,1%) và Streptococcus (44,3%), các dòng nấm gồm Fusarium (21,2%), Penicillium (23,4%), Aspergillus (14,7%) và Mucor
Morales và Dehority (2009) đã khảo sát ảnh hưởng của ion Ca2+
lên sự phát triển của ba chủng vi khuẩn Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, và
Ruminococcus albus, phân lập từ dạ cỏ động vật nhai lại. Kết quả khảo sát cho thấy Ca2+ kích thích hai chủng vi khuẩn Ruminococcus flavefaciens và Ruminococcus albusphát triển ở nồng độ Ca2+ đạt 0,36 – 0,64 mM.
Paola et al. (1996) đã khảo sát sự phân giải bã mía và tinh bột bằng dịch dạ cỏ động vật nhai lại in vitro dựa trên hàm lượng amino acid sinh ra. Kết quả cho thấy 52,7% cellulose và 91,8% tinh bột bị thủy phân trong 24 giờ. Hàm lượng amino acid trong dịch phân giải đạt 19,3 mg/ 1g cơ chất trong dịch cellulose và 15,8 mg/ 1g cơ chất trong dịch phân giải tinh bột.
Khảo sát trên vi khuẩn dạ cỏ trong điều kiện hiếu khí kích thích sản xuất linoleic acid. Kết quả khảo sát cho thấy dòng vi khuẩn trans-10, cis-12 CLA có khả năng thích ứng với oxi tốt ở pH> 6,2 (Na-Jin et al., 2005).
Young-Cheol et al. (2013) đã tiến hành khảo sát hoạt tính cellulase của hai dòng vi khuẩn Bacillus sp. CS-1 và CS-2 phân lập từ đất kiềm. Kết quả cho thấy hai dòng vi khuẩn cho hiệu quả thủy phân lignin cao nhất đạt 68,6% sau 48 giờ. Nghiên cứu trên còn khẳng định sự kết hợp với hoạt động của enzyme laccase thúc đẩy cellulase cho hoạt tính phân giải lignin cao nhất.
Enzyme cellulase còn được chứng minh có khả năng kết hợp với pectinase trong điều kiện hiếu khí.Dưới sự có mặt của oxi, cellulase có khả năng làm giảm hàm lượng NDF và ADF trong vỏ đậu từ 355g/kg và 317g/kg xuống còn 303g/kg và 255g/kg sau 45 ngày (Weinberg et al., 1995).
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013
3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Chín dòng vi khuẩn từ dạ cỏ bò, trâu, cừu và dê do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ cung cấp.
3.1.3. Hóa chất
Ethanol 95%, agar, H2SO4 đậm đặc, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol (C8H18O) octilic alcohol, acetone, Sodium hidroxide (NaOH), acetate buffer,...
3.1.4. Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị
Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), kính hiển vi olympus CHT (Nhật), Quang phổ kế, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm Eppendorf centrifuge 5417 (Đức), tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam),…
Dụng cụ
Bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Hoa Kỳ), đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 500 ml,petri đường kính 8cm (Đức), ống nghiệm 15ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: kính lúp, que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…
Hình 5. Một số thiết bị thí nghiệm 3.1.5. Nguyên vật liệu
Bã mía
Sau khi thu từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang sẽ được sấy ở 70oC trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới là 0,2mm. Bột bã mía sau khi nghiền được rửa với nước lọc nhiều lần để loại đường.
Mẫu vi khuẩn:
Nguồn vi khuẩn do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme cung cấp bao gồm: - Ba dòng vi khuẩn dạ cỏ bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6), BM21 (Bacillus subtilis S20), BM49 (Bacillus subtilis FS321).
- Hai dòng vi khuẩn dạ cỏ trâu: Dòng vi khuẩn chưa định danh TM9 và TM11 (Achromobacter xylosoxidans).
- Hai dòng vi khuẩn dạ cỏ cừu: CD11 (Achromobacter piechaudii M52) và CD43 (Bacillus tequilensis TXJB 020).
- Hai dòng vi khuẩn dạ cỏ dê: DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A) và DD9 (Bacillus subtilis RC24).
3.1.5. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật.
Môi trƣờng đặc Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 2. Thành phần môi trƣờng đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M1)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích Đơn vị
Bột bã mía 10 Gram (NH4)2SO4 1 Gram K2HPO4 1 Gram MgSO4.7H2O 0,5 Gram NaCl 0,001 Gram Agar 20 Gram Nước 1000 ml
(*Nguồn:Ryck eboer (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh (2010) )
Môi trƣờng lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 3. Thành phần môi trƣờng lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M2)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích Đơn vị
Bột bã mía 10 Gram (NH4)2SO4 1 Gram K2HPO4 1 Gram MgSO4.7H2O 0,5 Gram NaCl 0,001 Gram Nước 1000 ml
(*Nguồn:Ryck eboer (2003) cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh (2010))
Môi trƣờng (2003)
Bảng 4. Thành phần môi trƣờng khoáng (M3)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích Đơn vị
(NH4)2SO4 1 Gram
K2HPO4 1 Gram
MgSO4.7H2O 0,5 Gram
NaCl 0,001 Gram
Nước 1000 ml
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thí nghiệm 1: Chọn lọc tổ hợp vi khuẩn hiếu khí phân giải bã mía tốt nhất
Mục đích thí nghi ệm: Tuyển chọn tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ đa chủng để phân giải bã mía hiệu quả.
Mẫu vi khuẩn
+ Tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6), BM21 (Bacillus subtilis S20), BM49 (Bacillus subtilis FS321) (nhóm 1).
+ Vi khuẩn dạ cỏ cừu: CD11 (Achromobacter piechaudii M52) và CD43 (Bacillus tequilensis TXJB 020) (nhóm 3).
+ Vi khuẩn dạ cỏ dê: DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A) và DD9 (Bacillus subtilis
RC24) (nhóm 4).
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại, 11 nghiệm thức. Tổng đơn vị thí nghiệm là 33. Trong đó, nghiệm thức 1 là đối chứng âm.Nghiệm thức 2 đến nghiệm thức 11 là được bố trí như ảng 5.
Tiến hành thí nghi ệm
Bảng 5. Bố trí tỉ lệ phối trộn các nhóm vi khuẩn của các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 * Ghi chú: - NT: Nghiệm thức, ĐC: đối chúng - 1: Tổ hợp nhóm vi k huẩn dạ cỏ bò. - 2: Tổ hợp nhóm vi k huẩn dạ cỏ trâu. - 3: Tổ hợp nhóm vi k huẩn dạ cỏ cừu. - 4: Tổ hợp nhóm vi k huẩn dạ cỏ dê
+ Cân 2g bã mía, sấy ở 70oC trong 1 giờ và đo đạt khối lượng vật chất khô (DM).
+ Chuẩn bị môi trường khoáng: Môi trường M3 dùng để pha loãng các nồng độ như theo ảng 3. Dung dịch sau khi pha xong được đặt vào bồn ủ nhiệt ở 38℃ trong 15 phút trước khi sử dụng để tạo điều kiện nhiệt độ tốt, tránh sốc nhiệt cho vi sinh vật dạ cỏ.
+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2. Ủ ở 38oC trong 3 ngày. NT Nhóm 1 (% v/v) Nhóm 2 (% v/v) Nhóm 3 (% v/v) Nhóm 4 (% v/v) 1 = ĐC 0 - - - 2 6 - - - 3 1.5 4.5 - - 4 1.5 - 4.5 - 5 1.5 - - 4.5 6 3 3 - - 7 3 - 3 - 8 3 - - 3 9 4.5 1.5 - - 10 4.5 - 1.5 - 11 4.5 - - 1.5
+ Môi trường: Cân phân tích 1g bã mía, cho vào bình tam giác chứa 47 ml môi trường khoáng M3. Khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại ỏ các vi sinh vật trong môi trường. Để nguội.
+ Thành phần của mỗi nghiệm thức được cho vào ình tam giác chứa môi trường đã chuẩn ị sẵn ố trí theo Bảng 3. Chủng dịch vi khuẩn các nhóm vào từng nghiệm thức tương ứng (6% dịch vi khuẩn mật số 107
CFU/ml). Sau đó, dùng nút gòn và nắp giấy đậy nắp ình ủ, sao cho không khí có thể lưu thông nhưng không để vi sinh vật tạo nhiễm. Sắp xếp tất cả các ình ủ vào khay inox cho vào ồn ủ lắc nhiệt (lắc ngang ở 80 vòng/ phút) cách thủy, nhiệt độ ủ ở 38ºC. Sau 3 ngày ủ, thu mẫu để đánh giá kết quả thí nghiệm theo các chỉ tiêu DM, xơ thô (NDF).
+ Đo chỉ số pH và đường khử của dịch phân giải.
+ So sánh đánh giá và xử lí số liệu nhằm đưa ra các tổ hợpvi khuẩn phân giải tối ưu.
Chỉ tiêu theo dõi
+ Phần trăm vật chất khô (DM) + Phần trămxơ thô (CF)
+ Nồng độ đường sinh ra
3.2.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện pH lên sự phân giải cơ chất bã mía
Mục đích thí nghi ệm: Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện pH khác nhau lên sự phân giải bã mía của các tổ hợp vi khuẩn đã chọn lọc trong thí nghiệm 1 nhằm tìm ra điều kiện pH tối ưu lên sự phân giải.
Bố trí thí nghi ệm: Thí nghiệm được bố tríhoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, 6 nghiệm thức pH (4, 5, 5,5, 6, 7, 8). Trong đó, có một mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn ở từng nghiệm thức pH.
Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đã được tuyển chọn trong thí nghiệm 1. Tiến hành thí nghiệm
+ Vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107 CFU/ml vào môi trường M2. Ủ ở 38oC trong 3 ngày.
+ Chuẩn bị môi trƣờng: Môi trường M3 được chuẩn bị như ảng 3. Cân phân tích 1g bã mía và cho vào các bình tam giác có chứa 44ml môi trường khoáng M3. Môi trường sau khi pha xong được chuẩn pH về các giá trị tương đương các nghiệm thức: 4; 5; 5,5; 6; 7; 8 . Khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Để nguội.
Chủng 3ml (6%) dịch vi khuẩn (mật số 107CFU/ml) đã chuẩn bị vào bình tam giác chứa môi trường có pH tương ứng với các nghiệm thức. Sau đó, đậy nắp bình tam giác bằng nút gòn và nắp giấy sao cho không khí có thể lưu thông được nhưng tránh được tạp nhiễm vi sinh vật. Ủ lắc cách thuỷ các binh tam giác ở các nhiệt độ 38o
C. Sau 3 ngày, tiến hành lọc môi trường thu lấy ã mía. Xác định chỉ số pH, đường khử của dịch phân giải và chỉ số xơ thô (NDF), vật chất khô (DM) của bã mía.Phân