Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazinobenzothiazolcurcumin và difluourophenylhydrazinocurmin từ curcumin

Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazinobenzothiazolcurcumin và difluourophenylhydrazinocurmin từ curcumin

ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN

XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ 2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN

Giáo viên hướng dẫn

Th.S PHAN THỊ HOÀNG ANH Th.S LÊ XUÂN TIẾN

Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

Đề tài “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ

curcumin” được thực hiện tại phòng Thí nghiệm tổng hợp hữu cơ trường Đại Học

Bách Khoa TP HCM, thời gian từ 02/2009 đến 08/2009

Nội dung chính của đề tài là tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của dẫn

xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin

từ curcumin nhằm tìm kiếm một hoạt chất có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực dược

phẩm

Tiến trình thực hiện đề tài như sau:

1/ Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin từ bột curcuminoid

- Phân lập curcumin từ bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội)

- Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm chảy,

xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR

Kết quả: Đã tổng hợp và phân lập thành công curcumin có độ tinh khiết >95% và có

thể dùng curcumin tinh khiết này cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất tiếp theo

2/ Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất imine

– Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC), 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC)

– Phân lập sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột

– Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bảng mỏng TLC, đo điểm chảy

– Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổIR, MS, NMR

Kết quả: Đã tổng hợp và tìm được hệ dung môi thích hợp để phân lập thành công 2

dẫn xuất imine DFPHC, HBTC có độ tinh khiết > 95% để tiến hành khảo sát các hoạt

tính sinh học

3/ Khảo sát hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất imine - curcumin

– Hoạt tính kháng ung thư

– Hoat tính kháng oxy hóa

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt ii

Mục lục v

Danh sách các từ viết tắt viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các bảng xi

Danh sách các sơ đồ xii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

1.4 Yêu cầu 3

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về curcumin 4

2.1.1 Curcuminoid 4

2.1.1.1 Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid 4

2.1.1.2 Phân lập các dẫn xuất curcuminoid 5

2.1.2 Curcumin 6

2.1.2.1 Lý tính 6

2.1.2.2 Hóa tính 7

2.2 Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur 14

2.2.1 Hoạt tính kháng ung thư 15

2.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa 16

2.3 Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur 17

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Sơ đồ thực nghiệm 23

3.2 Phương pháp thực hiện 24

3.2.1.1 Kết tinh lại 25

3.2.1.2 Sắc ký bản mỏng (TLC) 26

3.2.1.3 Sắc ký cột 27

3.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất imne – curcumin 29

3.2.2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2 hydrazinobenzothiazolcurcumin 29

3.2.2.2 Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin 32

3.2.3 Phân tích cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp 35

3.2.3.1 Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) 35

3.2.3.2 Phổ hồng ngoại (IR) 35

3.2.3.3 Khối phổ 35

3.2.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 35

3.2.4 Khảo sát hoạt tính sinh học 35

3.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH 35

3.2.4.2 Đánh giá hoạt tính chống peroxide hóa lipid - phương pháp MDA 37

3.2.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn- phương pháp MIC 38

3.2.4.4 Đánh giá hoạt tính kháng ung thư 39

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Phân lập curcumin 41

4.1.1 Kết tinh lại curcuminoid 41

4.1.2 Sắc ký cột 42

4.1.3 Nhận danh cấu trúc hóa học 43

4.1.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng của curcumin 43

4.1.3.2 Biện luận cấu trúc của curcumin 44

4.2 Tổng hợp dẫn xuất 2-hydrazinobenzothiazolecurcumin 46

4.2.1 Theo dõi phản ứng 46

4.2.2 Sắc ký cột 47

4.2.3 Nhận danh cấu trúc 48

4.2.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng 48

4.2.3.2 Biện luận cấu trúc của HBTC 48

4.3.2 Sắc ký cột 52

4.3.3 Biện luận cấu trúc 53

4.3.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng 53

4.3.3.2 Biện luận cấu trúc của DFPHC 53

4.4 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học 56

4.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 56

4.4.1.1 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro- phương pháp DPPH 56

4.4.1.2 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vitro phương pháp MDA 58

4.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào 60

4.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 61

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

5.1 Kết luận 62

5.2 Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 67

HTCO : Hoạt tính kháng oxi hoá

CS : là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của hoạt chất được

thử tính theo % so với chất đối chứng

IC50 : Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư

hoặc gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration)

IC70 : Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư

hoặc gốc tự do MIC : Nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm có khả năng ngăn cản sự phát

triển của vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration)

HPLC : Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography)

IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MS : Khối phổ (Mass spectrometry)

NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy) TLC : Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid 4

Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur 6

Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH 8

Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm 9

Hình 2.5: Phản ứng cộng H2 của Cur 10

Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá 11

Hình 2.7: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (kobsd) giữa acetone và hydroxylamine vào pH môi trường 12

Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazolecurcumin 12

Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch 13

Hình 2.10: Phức Cur với kim loại 13

Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do 14

Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u 16

Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur 17

Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC 18

Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC 18

Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ hydrazinoCur với các chủng tế bào ung thư khác nhau (theo phương pháp MTT) 18

Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN 19

Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC 20

Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine từ Curcuminoid 20

Hình 2.19: 3-nitrophenylpyprazolecurcumin 21

Hình 2.20: Hydrazinocurcumin 21

Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC 21

Hình 3.1: Phương pháp tính Rf 27

Hình 3.2 : Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá 36

Hình 3.3: Cơ chế tạo màu của MDA 37

Hình 4.1: Bản mỏng kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau các lần kết tinh 41

Hình 4.2: TLC phân đoạn tinh thu được từsắc ký cột 42

Hình 4.3: (A) Sắc ký cột phân lập Cur (B) Cur: cur thu được qua sắc ký cột 42

Hình 4.4: Tinh thể Cur 43

Hình 4.5: Phổ UV-vis (trong ethanol) của Cur 43

Hình 4.6: Curcumin, C21H20O6 (M=368) 45

Hình 4.7: TLC theo dõi phản ứng 46

Hình 4.8: Sắc ký cột thô 47

Hình 4.9: Sắc ký cột tinh 47

Hình 4.10: (A) TLC của HBTC so với Cur (silica gel ,CH2Cl2:CH3OH: 97:3 v/v) 48

Hình 4.11: Cấu trúc của HBTC, C28H23SN3O4 (M=497) 49

Hình 4.12: TLC theo dõi điểm dừng phản ứng

Hình 4.13: Sắc ký cột thô 52

Hình 4.14: Sắc ký cột tinh 52

Hình 4.15: (A) Dạng tinh thể của DFPHC và 53

(B) TLC của DFPHC (silica gel, CH2Cl2:CH3OH: 98:2 v/v) 53

Hình 4.16: Cấu trúc của DFPHC, C27H22N2F2O4 (M=476) 54

Hình 4.17: Hoạt tính kháng oxy hoá của HBTC, DFHTC, Curtheo phương pháp DPPH 57

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid 4

Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất Curcuminoid 5

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur 7

Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC 20

Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại 25

Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi 26

Bảng 3.3: Bảng nồng độ các dung dịch thử DPPH 36

Bảng 4.1: Kết quả định lượng của quá trình kết tinh 41

Bảng 4.2: Tính chất vật lý đặc trưng của Cur 44

Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của curcumin 45

Bảng 4.4: Tính chất vật lí đặc trưng của HBTC 48

Bảng 4.5: Dữ liệu phổ NMR của HBTC 49

Bảng 4.6: Tính chất vật lý đặc trưng của DFPHC 53

Bảng 4.7: Dữ liệu phổ NMR của DFPHC 54

Bảng 4.8: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của HBTC, DFPHC, Cur theo phương pháp DPPH 56

Bảng 4.9: Hoạt tính kháng oxy hoá của vitamin C theo phương pháp DPPH 56

Bảng 4.10: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH 57

Bảng 4.12: Hoạt tính kháng oxy hoá của Trolox theo phương pháp MDA 58

Bảng 4.13: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA 59

Bảng 4.14: Kết quả xác định giá trị IC50 trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của DFPHC, Cur với 3 dòng tế bào Hep-G2, Lu và RD 60

Bảng 4.15: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của HBTC, DFPHC, Cur đối với một số chủng vi khuẩn, vi nấm 61

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực nghiệm tiến hành nghiên cứu 23

Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin 24

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC) 29

Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp 2,4-Diflorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC) 32

Hiện nay có nhiều phương pháp để nâng cao hoạt tính sinh học cho curcumin Tuy nhiên một trong những phương pháp cho nhiều kết quả khả quan là tạo dẫn xuất imine cho curcumin Qua các nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn xuất imine này làm tăng đáng kể hoạt tính sinh học của curcumin và thể hiện tiềm năng được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược

Nhận thấy được những ưu điểm và tiềm năng của nhóm dẫn xuất này chúng tôi thực hiện đề tài: “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin”

1.2 Mục tiêu đề tài

- Tổng hợp các dẫn xuất imine: 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin

- Khảo sát các hoạt tính sinh học của các dẫn xuất vừa tổng hợp

• Hoạt tính kháng ung thư

• Hoạt tính kháng oxy hóa

• Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

1.3 Nội dung đề tài

Từ các mục đích đã đưa ra đề tài sẽ được triển khai theo các nội dung cơ bản

sau:

a Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin

– Phân lập curcumin từ bột curcuminoid

– Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm

chảy, xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR

b Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất

– Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC) 2,4 - Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC)

– Phân lập các sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột

– Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bản mỏng (TLC)

– Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổ MS, IR và NMR

c Khảo sát các hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất imine - curcumin

– Hoạt tính kháng ung thư

– Hoat tính kháng oxy hóa

1.4 Yêu cầu

– Tách và tinh chế được curcumin tinh khiết

– Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin – Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2,4 – Difluorophenylhydrazinocurcumin – Xác định cấu trúc của các dẫn xuất bằng phổ MS, IR và NMR

– Khảo sát hoạt tính sinh học của:

• Curcumin

• 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin

• 2,4–Difluorophenylhydrazinocurcumin

2.1.1.1 Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid

Hỗn hợp curcuminoid là một trong những thành phần quan trọng mang nhiều

hoạt tính đáng quý được chiết từ củ nghệ vàng (Curcuma longa L.) Hỗn hợp

curcuminoid có dạng bột màu vàng và là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng cam của nghệ [6]

Lượng curcuminoid trong bột nghệ khoảng từ 3 – 6% Hỗn hợp curcuminoid

có chứa khoảng 77% curcumin (Cur), 17% demethoxycurcumin (DMC), 3% bisdemethoxycurcumin (BDMC) [7]

Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid [7]

Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid [7]

2.1.1.2 Phân lập các dẫn xuất curcuminoid

Để tìm hiểu, nghiên cứu sâu hơn về curcuminoid cũng như các dẫn xuất của nó thì các dẫn xuất này cần phải được phân lập ra vì mỗi thành phần này có cấu trúc hoá học khác nhau nên màu sắc và tính chất hoá học cũng khác nhau Vì vậy việc phân lập các thành phần của curcuminoid ra là vấn đề cần thiết và mang ý nghĩa thiết thực Hiện nay đã có nhiều tác giả dùng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập các thành phần của curcuminoid

Opa vajragupta và cộng sự [8]đã phân lập 3 thành phần curcuminoid bằng sắc

ký cột silica gel 60G, 0.063-0.200mm với hệ dung môi CHCl3:MeOH:AcOH (98:5:2 v/v/v) Theo phương pháp này, Cur được rửa giải đầu tiên, kế tiếp là hỗn hợp của Cur và DMC, cuối cùng là BDMC tinh DMC được tách ra khỏi hỗn hợp giữa DMC

và Cur bằng sắc ký cột với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (95:5 v/v )

G K Jayaprakasha và cộng sự [9] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel Thu được Cur, DMC, BDMC lần lượt với hệ dung môi benzene : EtOAc (82:18 v/v), benzene : EtOAc (70:30 v/v), benzene : EtOAc (58:42 v/v) Nhiệt độ nóng chảy đo được của Cur, DMC, BDMC tương ứng là 186 - 187, 175

- 176, 231 - 232oC

W Chearwae và cộng sự [10] đã cô lập các dẫn xuất curcuminoid từ cao ethanol trích từ củ nghệ vàng cũng bằng sắc ký cột silica gel với dung môi CHCl3, sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi bằng CH3OH Thu được các phân đoạn Cur, DMC, BDMC có độ tinh khiết khoảng 95-99% (HPLC)

L Péret-Almeida và cộng sự [11] đã cô lập, xác định cấu trúc và một số tính chất hoá lý của từng dẫn xuất curcuminoid riêng biệt Hỗn hợp curcuminoid (Merck) được kết tinh lại 3 lần bằng hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH (5:1 v/v), hiệu suất quá trình kết tinh ~ 40%

Cắn thu được từ nước cái của quá trình kết tinh được sắc ký với chất hấp phụ silica gel tẩm sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4), dung môi rửa giải là

CH2Cl2 Các phân đoạn tinh khiết được xác định cấu trúc và một số tính chất vật lý

Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất curcuminoid [11]

Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur [11]

Điều kiện HPLC: cột spherical Shi-pack CLC NH2 (5 µm, 4.6 x 150 mm, Shimadzu), pha động ethanol: nước (85/15 v/v), tốc độ dòng 1ml/phút, 22oC, detector DAD 425nm Ngoài ra các thành phần này còn được định tính bằng phổ tử ngoại khả kiến, hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và bằng phương pháp so màu Các kết quả

đều cho thấy các thành phần phân lập được chính là Cur, DMC, BDMC

Tan trong chất béo, ethanol, methanol, dicloromethane, aceton, acid acetic băng

và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10 mg ở

a Quá trình điện ly theo pH

Cur không tan trong môi trường nước ở pH acid và trung tính nhưng tan tốt ở

pH kiềm [12] Nghiên cứu bằng kỹ thuật HPLC cho kết quả điện ly theo pH của Cur như sau:

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur [12]

H3A

OH HO

OCH3

H3CO

OH O

H2A

-OH HO

OCH 3

H 3 CO

OO

™ Phân hủy trong môi trường kiềm

Cur tương đối bền trong môi trường acid nhưng lại bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường kiềm [12] Ở pH = 8.5, chỉ sau 5 phút Cur đã bắt đầu phân hủy thành ferulic acid và feruloylmethane Sau đó, feruloylmethane còn bị phân hủy thành vanillin và acetone

OH HO

OCH3HO

O

OCH3OH

O HO

-OCH3HO

as radical

feruloyl methane condensation product ferulic acid

Nghiên cứu của Ying Jan Wang và cộng sự [13] cũng cho thấy 90% Cur bị phân huỷ sau 30 phút trong môi trường đệm phosphate pH = 7.2, 37oC

™ Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng [12]

Cur không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch Khi tiếp xúc với ánh sáng, Cur bị phân huỷ ngay cả ở dạng rắn và bị phân huỷ nhanh hơn khi ở trạng thái dung dịch Sản phẩm phân hủy là vanillin, vanillic acid, ferulic aldehyde, ferulic acid Cur có thể bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng ngay cả khi có mặt oxi và không oxi

- Không có oxi, Cur có thể bị vòng hóa

- Khi có mặt oxi và ánh sáng, Cur phân huỷ tạo thành 4-vinylguaialcol và anilin

c Phản ứng cộng H2

Trong phân tử Cur có nối đôi trong mạch cacbon nên có thể phản ứng với 1, 2 hoặc 3 phân tử H2 tạo thành các dẫn xuất dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin, khi có mặt xúc tác kim loại hay oxit kim loại (Ni, PtO2) tương ứng (hình 2.5), các sản phẩm này cũng là các chất kháng oxy hoá [15]

+ H2

Ni (PtO2)

OH HO

OCH3

H3CO

OH O

n = 1: dihydrocurcumin

OH HO

OCH3

H3CO

OH O

n = 3: hexahydrocurcumin

OH HO

OCH3

H3CO

OH O

d Phản ứng imine hóa

Cur là hợp chất diketone nên có thể cho phản ứng với các amin bậc nhất (RNH2), hydroxylamine (NH2OH), hydrazine (NH2-NH2), semicarbazide

(NH2NHCONH2) … tạo các dẫn xuất imine (base Schiff) hoặc dẫn xuất imine tương ứng [2,3,16,17]

Cơ chế phản ứng imine hoá

Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá [16]

Giai đoạn đầu của phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên

tử nitrogen của amine vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm carbonyl Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thông thường, hình thành hợp chất trung gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxide và cation ammonium Hợp chất trung gian này chuyển hoá nhanh thành sản phẩm trung gian bền hơn là carbinolamin Phản ứng này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác, giúp cho cân bằng chuyển dịch về phía tách nước từ hợp chất trung gian carbinolamine, sinh

ra dạng proton hoá của imine hoặc các dẫn xuất của imine Cuối cùng là giai đoạn tách proton, hình thành sản phẩm là imine hoặc các dẫn xuất của imine [2,16]

Trong cơ chế của phản ứng imine hoá, pH của môi trường đóng vai trò quan trọng Nếu môi trường phản ứng quá acid, toàn bộ amine bị proton hoá Các amine

bị proton hoá không có tính ái nhân nên chúng không phản ứng với các nhóm ketone Ngược lại, giảm môi trường acid sẽ làm giảm quá trình tách nước tạo imine Điều kiện pH thích hợp cho phản ứng imine hoá là khoảng pH~4.5 [17] Hình 2.7 mô tả sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng giữa acetone và hydroxylamine vào pH môi trường phản ứng

ể tạo các hợhợp chất dịứng này tươ

Isoxa

Pyra

trúc của dẫ

ốc độ phả[17]

one nên ng

ợp chất dị vvòng của Cơng tự như p

N O

azole curcum

NH N

azole curcum

ẫn xuất isox

ản ứng (k

goài khả năvòng khácCur như dịphản ứng im

ị vòng pyramine thông

e Phản ứng tạo phức

Cur với cấu trúc diketon trong môi trường acid hay trung tính nằm dưới dạng

hỗ biến keto-enol đối xứng và ổn định, làm cho Cur có khả năng tạo phức mạnh với nhiều ion kim loại khác nhau như : Zn2+, Sn2+, Al3+, Cu2+, Ni2+, Fe3+ [4]

H

Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch [5]

Các ion kim loại này hấp thu các cặp electron trong nguyên tử oxy của phân tử Cur để tạo phức Phức ion-kim loại không bền ở nhiệt độ cao và khi tiếp xúc với ánh sáng trong thời gian dài Một ion kim loại có thể tạo phức với một hay nhiều phân tử Cur

O O

H 3 CO HO

OCH 3

OH

M O O

OCH3

OH

H3CO HO

O O

OCH3

OH

H3CO HO

M HOH OCOCH3

Hình 2.10: Phức Cur với kim loại [5]

g Phản ứng của nhóm hydroxyl trên vòng benzene

Do sự liên hợp cặp electron tự do của nhóm OH với vòng benzene làm cho nhóm phenoxyl của Cur dễ nhường nguyên tử H tạo thành gốc tự do phenoxy bền vững Ngoài ra nhóm methylene ở giữa nhóm β – diketone có thể nhường nguyên tử

H tạo gốc tự do carbon ổn định Hai hướng phản ứng này (hình 2.11) góp phần giải thích hoạt tính kháng oxy hóa mạnh của Cur và các dẫn xuất của chúng [19]

OH HO

OCH 3

H 3 CO

O O

-H + R *

O HO

OCH3

H 3 CO

O O

OH HO

OCH 3

H3CO

O O

O HO

OCH3

H 3 CO

O O

OH HO

OCH 3

H3CO

O O

O O

OCH3

H 3 CO

O O

OH HO

OCH 3

H3CO

O O

Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do [19]

2.2 Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur

Từ xa xưa, Cur đã được dùng làm màu thực phẩm và dùng trong các bài thuốc dân gian Cur đã được sử dụng như một vị thuốc dân gian để chữa một số bệnh như bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh ngoài da, viêm loét dạ dày, phòng và chữa một số loại

ung thư…Cur không gây độc đối với người ở liều lượng lên đến 10g/ngày Chính

vì tính an toàn nên Cur có nhiều tiềm năng sử dụng trong dược phẩm [20]

Cur còn là chất chống viêm và chống oxy hóa điển hình, có thể sử dụng trong điều trị bệnh mà không sợ gây loãng xương, không gây loét dạ dày

Ngoài ra, Cur cũng đã được chứng minh là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao, có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan siêu vi B, C và cả HIV với giá rẻ [4,5]

Như vậy ta thấy hoạt tính của Cur rất phong phú và đa dạng, nội dung luận văn này xin trình bày hoạt tính kháng ung thư, kháng oxy hóa của Cur

2.2.1 Hoạt tính kháng ung thư

Hiện nay, ung thư đang được xem là bệnh nan y và được điều trị dựa trên sự kết hợp của ba phương pháp: xạ trị, phẫu trị và hóa trị Riêng thuốc trị ung thư trong hoá trị là loại thuốc khó sử dụng hơn cả vì độc tính cao Thuốc trị ung thư có tác dụng

ức chế sự phát triển và biệt hóa các tế bào ung thư nhằm chặn đứng sự phát triển và di căn của ung thư Tuy nhiên đại đa số các thuốc trị ung thư hiện nay đều dễ bị nhờn thuốc và hệ số an toàn giảm dần theo thời gian sử dụng, ngoài ra chúng có thể gây độc cho các tế bào lành và gây ra các tác dụng phụ như: rụng tóc, buồn nôn Vì vậy việc tìm ra một hoạt chất có tác dụng chống ung thư có nguồn gốc từ tự nhiên và tăng

hoạt tính của các hoạt chất đó đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu

Cur là được xem một hoạt chất điều trị ung thư vào loại mạnh theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính [4] Nó vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn không cho hình thành các tế bào ung thư mới mà không ảnh hưởng đến các tế bào lành tính bên cạnh, nó loại bỏ các gốc tự do và các loại men gây ung thư có trong thức

ăn, nước uống hằng ngày Vì vậy, Cur được xem là hoạt chất hỗ trợ, phòng chống và chữa trị ung thư một cách có hiệu quả

Ngoài ra, Cur còn có khả năng ức chế sự hình thành khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển của khối u như: biến đổi, phát triển, lan rộng của tế bào ung thư

Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u [7]

2.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa

Các dạng oxygen hoạt động (ROS-Reactive oxygen species) là thành

phần tham gia vào các cơ chế gây bệnh khác nhau trong cơ thể [7] Cur có khả

năng ức chế hiệu quả các ROS trong cơ thể như: anion superoxide, H2O2, gốc nitrite ở

mức độ in vitro và in vivo [14] Cur có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng, các hoạt

tính đó đều xuất phát từ tính kháng oxy hóa mạnh của Cur, tính kháng oxy hóa của nó

mạnh hơn vitamin E [15] Do vậy thông qua hoạt tính kháng oxy hóa, Cur có khả

năng khống chế sự phát triển nhiều loại bệnh tật và các tác nhân gây hại khác nhau

Cur thể hiện khả năng ức chế mạnh với những thương tổn do H2O2 gây ra ở tế bào

sừng, tế bào fibroblast và các tế bào NG108 [16] Cur ngăn chặn sự peroxy hóa lipid

trong vi lạp thể gan, màng hồng cầu và dịch đồng thể não chuột nhờ vậy mà nó duy

trì hoạt động của những enzyme kháng oxy hóa như SOD, catalase và glutathione

peroxidase [17]

Trong cấu trúc của Cur có hydrogen của nhóm phenolic và hydrogen của

nhóm methylene (giữa liên kết β-diketone) đều có thể tạo nên khả năng kháng oxy

hoá Tuy nhiên, hoạt tính của Cur thực chất là do hydrogen ở vị trí nào gây ra vẫn

còn nhiều tranh cãi

W.F.Chen và cộng sự [18] nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’- azobis (2-amidinopropane hydrochloride) (AAPH), Cu2+ trong oxy hóa

lipoprotein nồng độ thấp của curcumin và các chất tương tự như curcumin nhưng

không có nhóm phenolic:1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene 3,5-dione (1),

1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7-

diphenyl-1,6-heptadiene-3,5-dione (3) Hoạt tính kháng oxy hoá của các chất (1), (2), (3) đều yếu

Khối u

di căn Lan rộng

Biến đổi Phát triển

Cur

Tế bào

bình thường Tế bào ung thư Khối u tăng trưởng

hơn các dẫn xuất Cur nhiều lần Do đó, nhóm nghiên cứu cho rằng nhóm phenolic

đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính của các dẫn xuất curcuminoid

L Chen và cộng sự [19] cho rằng nhóm enolic có tính acid cao hơn nhóm phenolic nên hydrogen của enolic đóng vai trò quyết định hoạt tính kháng oxy hoá của Cur Do đó trong quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do hydrogen của enolic tách ra đầu tiên (hình 2.13)

-Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur [19]

Tuy nhiên, J.S Wright và cộng sự [42] lại cho rằng vai trò kháng oxy hoá của nhóm phenolic hay methylene trên Cur tuỳ thuộc vào loại gốc tự do tấn công và môi trường phản ứng

K I Priyadarsini và cộng sự [20] lại cho rằng hoạt tính kháng oxy hoá của Cur chủ yếu l à do quá trình tách hydrogen trên nhóm phenolic và một phần trên nhóm methylene

Ngoài ra, Cur có khả năng tạo phức mạnh với các ion kim loại như chì, cadmium, sắt… mà các ion kim loại này là nhân tố xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hoá, đầu độc tế bào thần kinh và là nguyên nhân gây ra các căn bệnh như Alzheimer, Parkinson, … Do vậy, Cur là một trong các hợp chất thiên nhiên tiềm năng có thể sử dụng để loại trừ các ion kim loại độc trong cơ thể người [21]

2.3 Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur

Một trong các hướng nghiên cứu về Cur hiện nay là nâng cao khả năng ứng dụng và nâng cao hoạt tính của Cur dựa trên các nguyên tắc sau:

z Tạo phức với các kim loại chuyển tiếp

z Tổng hợp các hợp chất imine

z Encapsule hoá Cur

z Tạo các dẫn xuất Cur với glucose, glycine, alanine, acid acetic…

N NH

NH2NH2.HCl Triethylamine AcOH, MeOH

N N

Triethylamine AcOH, MeOH

NH.NH2

HO O

HO O

Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC [22]

Kết quả nghiên cứu cho thấy HC có hoạt tính ức chế tế bào BAEC (bovine

aortic endothelial cell), ngăn chặn tiến trình angiogenesis (một trong các tiến trình phát

triển của ung thư) cao hơn 30 lần so với Cur Ngoài ra HC còn có khả năng ức chế một

số dòng tế bào: HT29, NH3T3, Chang

Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ HC với các chủng tế bào ung thư

khác nhau (theo phương pháp MTT) [22]

Riêng HBC thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào BAEC mạnh hơn Cur nhưng kém hơn HC HBC có hoạt tính ức chế mạnh lên tế bào HCT15, ở nồng độ 40µM HBC thì hầu như toàn bộ lượng tế bào HCT15 bị ức chế sau hơn 48 giờ Tuy nhiên, cũng như HC, HBC không thể hiện hoạt tính ức chế đối với APN (amino peptidase N)

Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy HBC có khả năng cản trở quá trình phát triển của tế bào ung thư ruột kết (ruột già – HCT15 colon cancer cells) bằng cách kết hợp với nhóm chức năng trung gian khác là Ca2+/CaM [46] Ca2+/CaM là một protein đa chức năng, bản thân nó không có hoạt tính nào đặc biệt nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy nó có liên quan và thường có những biểu hiện bất thường đối với một vài loại tế bào ung thư Vì vậy, nó được xem như một chất mang lý tưởng cho các chất khác trong đó Ca2+ đóng vai trò là cầu nối gắn kết những chất có hoạt tính sinh học với CaM Kết quả nghiên cứu cho thấy HBC có thể gắn trực tiếp lên protein Ca2+/CaM với

độ tương thích cao

Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN [22]

Hydrazinobenzoyl curcuminoid, 3

3a 3b 3c

OCH3OCH3

hóa ở mức độ in vitro (quét gốc DPPH), ở mức độ tiền invivo (trên động vật), ức

chế cyclooxygenase (COX1/COX2), kháng viêm cao hơn Cur tương ứng

R2

R1

NH N

OH HO

R2

R1

N O

S Mishra cùng các cộng sự [24] đã tổng hợp và tiến hành khảo sát khả năng

ức chế sự phát triển của Plasmodium falciparum (ký sinh trùng gây bệnh sốt rét) của

một số dẫn xuất của Cur Qua đó đã tìm ra được 2 dẫn xuất: Hydrazinocurcumin và

3-nitrophenylpyprazole curcumin có khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium

falciparum cao hơn so với Cur.

O NNHCONH2

Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC [24]

Cur thể hiện hoạt tính bắt gốc DPPH nhanh hơn nhiều so với CSC Điều này được lý giải là do có nhóm thế hút điện tử semicarbazone nên làm giá trị thế oxy hóa

của nhóm phenolic trong CSC hơn trong Cur

Nhóm tác giả Đào Hùng Cường, Lê Hải Lợi (Đại học Đà Nẵng) [1] đã tổng hợp thành công dẫn xuất pyrazole giữa phenylhydrazin và Cur, dẫn xuất isoxazole

gốc tự do DPPH của chúng kết quả cho thấy hai dẫn xuất này đều có khả năng

kháng oxy hóa, có khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn E.Coli, P.aeruginosa,

B.subtillis, S.aureus Tuy nhiên các hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất này đều kém

hơn so với Cur

Tác giả Lê Xuân Tiến (Đại Học Bách Khoa TPHCM) [4] đã tổng hợp thành công isoxazolcurcumin (IOZ) và hydrazinocurcumin (HC) từ Cur Qua khảo sát các hoạt tính sinh học của 2 dẫn xuất này cho thấy IOZ và HC có tính kháng oxy hóa tương tự như Cur Trong đó IOZ và HC có khả năng gây độc cho dòng tế bào ung thư Hep-G2 cao hơn Cur riêng HC cho hoạt tính cao gấp 2 lần so với Cur

Kiểm tra độ tinh khiết, cấu trúc Phân lập curcumin

>=95%

Từ nguyên liệu ban đầu là bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội) gồm ba thành phần là Cur, DMC và BMDC Tiến hành tinh chế lần lượt qua hai bước: kết tinh lại và sắc k í cột để phân lập Cur có độ tinh khiết cao (≥ 95%) Sản phẩm thu được sẽ được kiểm tra độ tinh khiết bằng TLC và đo điểm nóng chảy

Sau đó, tổng hợp 2 dẫn xuất DFPHC và HBTC từ Cur tinh đã tách ở trên với 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode, 2-Hydrazinobenzothiazole Tinh chế sản phẩm và tiến hành kiểm tra cấu trúc và độ tinh khiết bằng TLC, IR, MS, NMR, … Xác định hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất vừa tổng hợp được rồi so sánh các hoạt tính trên với Cur tinh

3.2 Phương pháp thực hiện

3.2.1 Phân lập curcumin

Nguyên liệu : Nguyên liệu ban đầu là bột curcuminoid thương phẩm của Viện

Dược Liệu Hà Nội được chiết xuất từ nghệ vàng (Curcuma Longa L.)

Quy trình phân lập

Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin

Hệ dung môi methanol - nước Thời gian 24 giờ, 50C

Bột curcuminoid

3.2.1.1 Kết tinh lại

™ Mục đích

- Loại bỏ bớt một số tạp chất, chất nhựa trong nguyên liệu

- Thu phần tinh thể có hàm lượng Cur cao giúp cho quá trình sắc ký cột phân lập Cur được dễ dàng và cho hiệu suất cao

™ Nguyên tắc

Dựa trên tính tan khác nhau của các chất trong dung môi theo nhiệt độ và độ tinh khiết của hỗn hợp đem kết tinh

™ Phương pháp thực hiện

Hóa chất, nguyên liệu

Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại

ƒ Hoà tan hoàn toàn 500mg bột curcuminoid trong methanol ở 50oC

ƒ Thêm từ từ nước cất (ở 50oC) vào cho đến khi dung dịch vừa đục

ƒ Bổ sung thêm methanol vào cho đến khi dung dịch trong trở lại

ƒ Để cho dung dịch trên từ từ hạ về nhiệt độ phòng rồi cho vào tủ đá kết tinh trong 24 giờ ở 5oC

ƒ Lọc hút chân không thu tinh thể chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo

3.2.1.2 Sắc ký bản mỏng (TLC)

™ Mục đích

ƒ Xác định hệ dung môi chạy sắc ký cột

ƒ Kiểm tra thành phần, độ tinh khiết các phân đoạn trong sắc ký cột

™ Nguyên tắc

Dựa trên sự tương tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau

™ Phương pháp thực hiện

Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất

Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi

3-5mg 1chai (500 ml) 1chai (500ml) 1chai (500ml) 1chai (500ml) 20x20cm2

- Hòa tan một ít mẫu curcuminoid vào chai bi bằng methanol

- Dùng ống vi quản hút một ít mẫu đã hòa tan trong chai bi chấm lên bản mỏng Khoảng cách vết chấm cách bờ dưới 1cm, hai bờ hai bên 1.5cm, và khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau 1cm Kích thước của vết chấm càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt

- Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi

Triển khai bản mỏng

Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô

Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lượt theo các tỷ lệ xác định

Bão hòa khí quyển trong bình triển khai từ 15-20 phút

Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình, đậy nắp bình lại

Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cách mép trên của tấm bản mỏng khoảng 1cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai

Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi

x: là khoảng cách từ điểm chẫm mẫu đến trung tâm

của vết sau khi triển khai

y: khoảng cách từ điểm vết chấm đến mức dung

đối với pha tĩnh trong cột và pha động đi ngang qua cột mà mỗi chất sẽ di chuyển theo pha động ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy mà có thể tách riêng từng đơn chất trong hỗn hợp ban đầu

Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ, hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột (pha động) mà nó được rửa ra khỏi cột trước hay sau