Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazinobenzothiazolcurcumin và difluourophenylhydrazinocurmin từ curcumin

Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazinobenzothiazolcurcumin và difluourophenylhydrazinocurmin từ curcumin

ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ 2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN Tác giả ĐẶNG THỊ MỸ LỆ ĐỖ THỊ XUÂN VUI Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu Cấp Kỹ sư ngành Cơng nghệ hóa học Giáo viên hướng dẫn Th.S PHAN THỊ HOÀNG ANH Th.S LÊ XUÂN TIẾN Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN Tháng 08/2009 i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT Đề tài “Điều chế khảo sát hoạt tính sinh học dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin” thực phòng Thí nghiệm tổng hợp hữu trường Đại Học Bách Khoa TP HCM, thời gian từ 02/2009 đến 08/2009 Nội dung đề tài tổng hợp khảo sát hoạt tính sinh học dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin nhằm tìm kiếm hoạt chất có tiềm sử dụng lĩnh vực dược phẩm Tiến trình thực đề tài sau: 1/ Tinh chế xác định cấu trúc curcumin từ bột curcuminoid - Phân lập curcumin từ bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội) - Kiểm tra độ tinh khiết curcumin sắc ký mỏng đo điểm chảy, xác định cấu trúc phổ MS, IR NMR Kết quả: Đã tổng hợp phân lập thành công curcumin có độ tinh khiết >95% dùng curcumin tinh khiết cho trình tổng hợp dẫn xuất 2/ Tổng hợp xác định cấu trúc dẫn xuất imine – Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC), 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC) – Phân lập sản phẩm phương pháp sắc ký cột – Kiểm tra độ tinh khiết dẫn xuất sắc ký bảng mỏng TLC, đo điểm chảy – Xác định cấu trúc dẫn xuất tổng hợp phổIR, MS, NMR Kết quả: Đã tổng hợp tìm hệ dung mơi thích hợp để phân lập thành cơng dẫn xuất imine DFPHC, HBTC có độ tinh khiết > 95% để tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học iii 3/ Khảo sát hoạt tính sinh học curcumin dẫn xuất imine - curcumin – Hoạt tính kháng ung thư – Hoat tính kháng oxy hóa – Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm – So sánh hoạt tính sinh học dẫn xuất tổng hợp với hoạt tính sinh học curcumin Kết quả: Trong luận văn này, hai dẫn xuất DFPHC HBTC thể hoạt tính kháng oxi hố thử nghiệm DPPH MDA nhiên hoạt tính thấp Cur DFPHC Cur thể hoạt tính kháng ung thư dòng tế bào Hep – G2 Ngồi DFPHC HBTC có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm hoạt tính khơng đáng kể với chủng vi khuẩn, vi nấm khảo sát iv MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt ii Mục lục v Danh sách từ viết tắt viii Danh sách hình ix Danh sách bảng xi Danh sách sơ đồ xii Chương 1: MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài 1.4 Yêu cầu .3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan curcumin 2.1.1 Curcuminoid 2.1.1.1 Cấu trúc dẫn xuất curcuminoid 2.1.1.2 Phân lập dẫn xuất curcuminoid 2.1.2 Curcumin .6 2.1.2.1 Lý tính .6 2.1.2.2 Hóa tính 2.2 Hoạt tính sinh học Cur dẫn xuất Cur .14 2.2.1 Hoạt tính kháng ung thư 15 2.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa 16 2.3 Các nghiên cứu imine dẫn xuất imine Cur 17 Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 3.1 Sơ đồ thực nghiệm 23 3.2 Phương pháp thực 24 3.2.1 Phân lập curcumin 24 v 3.2.1.1 Kết tinh lại 25 3.2.1.2 Sắc ký mỏng (TLC) 26 3.2.1.3 Sắc ký cột .27 3.2.2 Tổng hợp dẫn xuất imne – curcumin .29 3.2.2.1 Tổng hợp dẫn xuất hydrazinobenzothiazolcurcumin 29 3.2.2.2 Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin 32 3.2.3 Phân tích cấu trúc dẫn xuất vừa tổng hợp 35 3.2.3.1 Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) 35 3.2.3.2 Phổ hồng ngoại (IR) 35 3.2.3.3 Khối phổ 35 3.2.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 35 3.2.4 Khảo sát hoạt tính sinh học 35 3.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hố in vitro – phương pháp DPPH 35 3.2.4.2 Đánh giá hoạt tính chống peroxide hóa lipid - phương pháp MDA 37 3.2.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn- phương pháp MIC 38 3.2.4.4 Đánh giá hoạt tính kháng ung thư 39 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1 Phân lập curcumin 41 4.1.1 Kết tinh lại curcuminoid 41 4.1.2 Sắc ký cột 42 4.1.3 Nhận danh cấu trúc hóa học 43 4.1.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng curcumin 43 4.1.3.2 Biện luận cấu trúc curcumin 44 4.2 Tổng hợp dẫn xuất 2-hydrazinobenzothiazolecurcumin 46 4.2.1 Theo dõi phản ứng .46 4.2.2 Sắc ký cột 47 4.2.3 Nhận danh cấu trúc 48 4.2.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng 48 4.2.3.2 Biện luận cấu trúc HBTC 48 4.3.2 Sắc ký cột 52 4.3.3 Biện luận cấu trúc 53 vi 4.3.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng 53 4.3.3.2 Biện luận cấu trúc DFPHC 53 4.4 Kết khảo sát hoạt tính sinh học 56 4.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa .56 4.4.1.1 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro- phương pháp DPPH 56 4.4.1.2 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hố tiền in vitro phương pháp MDA 58 4.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào 60 4.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm .61 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 5.1 Kết luận 62 5.2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC .67 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Cur : Curcumin DMC : Demethoxycurcumin BDMC : Bisdemethoxycurcumin HC : Hydrazinocurcumin IOZ : Isoxazolcurcumin HBTC : 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin DFPHC : 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin OD : Mật độ quang HTCO : Hoạt tính kháng oxi hố CS : khả sống sót tế bào nồng độ hoạt chất thử tính theo % so với chất đối chứng IC50 : Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư gốc tự (half maximal (50%) inhibitory concentration) IC70 : Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư gốc tự MIC : Nồng độ thấp chất thử nghiệm có khả ngăn cản phát triển vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration) HPLC : Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography) IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) MS : Khối phổ (Mass spectrometry) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy) TLC : Sắc ký mỏng (Thin layer chromatography) viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơng thức hóa học chung curcuminoid Hình 2.2: Kết HPLC tương ứng BDMC, DMC Cur Hình 2.3: Các dạng ion Cur theo pH Hình 2.4: Sự phân huỷ Cur môi trường kiềm Hình 2.5: Phản ứng cộng H2 Cur 10 Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá 11 Hình 2.7: Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng (kobsd) acetone hydroxylamine vào pH môi trường 12 Hình 2.8: Cấu trúc dẫn xuất isoxazole pyrazolecurcumin 12 Hình 2.9: Sự hỗ biến Cur dung dịch 13 Hình 2.10: Phức Cur với kim loại 13 Hình 2.11: Phản ứng Cur với gốc tự 14 Hình 2.12: Tác động Cur đến trình hình thành di khối u 16 Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự superoxide Cur 17 Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC 18 Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC 18 Hình 2.16: Ảnh hưởng nồng độ hydrazinoCur với chủng tế bào ung thư khác (theo phương pháp MTT) 18 Hình 2.17: Ảnh hưởng HBC đến phát triển tế bào HCT15 APN 19 Bảng 2.4 : Giá trị IC50 dẫn xuất Curcuminoid tế bào BAEC 20 Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp số dẫn xuất imine từ Curcuminoid 20 Hình 2.19: 3-nitrophenylpyprazolecurcumin 21 Hình 2.20: Hydrazinocurcumin .21 Hình 2.21: Công thức cấu tạo CSC 21 Hình 3.1: Phương pháp tính Rf 27 Hình 3.2 : Phản ứng quét gốc tự DPPH chất kháng oxy hố 36 Hình 3.3: Cơ chế tạo màu MDA 37 Hình 4.1: Bản mỏng kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau lần kết tinh 41 ix Hình 4.2: TLC phân đoạn tinh thu từ sắc ký cột 42 Hình 4.3: (A) Sắc ký cột phân lập Cur (B) Cur: cur thu qua sắc ký cột 42 Hình 4.4: Tinh thể Cur 43 Hình 4.5: Phổ UV-vis (trong ethanol) Cur 43 Hình 4.6: Curcumin, C21H20O6 (M=368) 45 Hình 4.7: TLC theo dõi phản ứng 46 Hình 4.8: Sắc ký cột thô 47 Hình 4.9: Sắc ký cột tinh 47 Hình 4.10: (A) TLC HBTC so với Cur (silica gel ,CH2Cl2:CH3OH: 97:3 v/v) 48 Hình 4.11: Cấu trúc HBTC, C28H23SN3O4 (M=497) 49 Hình 4.12: TLC theo dõi điểm dừng phản ứng Hình 4.13: Sắc ký cột thô 52 Hình 4.14: Sắc ký cột tinh 52 Hình 4.15: (A) Dạng tinh thể DFPHC 53 (B) TLC DFPHC (silica gel, CH2Cl2:CH3OH: 98:2 v/v) 53 Hình 4.16: Cấu trúc DFPHC, C27H22N2F2O4 (M=476) 54 Hình 4.17: Hoạt tính kháng oxy hố HBTC, DFHTC, Cur theo phương pháp DPPH 57 x ... thành cơng dẫn xuất imine DFPHC, HBTC có độ tinh khiết > 95% để tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học iii 3/ Khảo sát hoạt tính sinh học curcumin dẫn xuất imine - curcumin – Hoạt tính kháng ung... nhóm dẫn xuất thực đề tài: ? ?Điều chế khảo sát hoạt tính sinh học dẫn xuất imine 2 -Hydrazinobenzothiazolcurcumin 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin? ?? 1.2 Mục tiêu đề tài - Tổng hợp dẫn. .. hợp dẫn xuất imine: 2 -Hydrazinobenzothiazolcurcumin 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin - Khảo sát hoạt tính sinh học dẫn xuất vừa tổng hợp • Hoạt tính kháng ung thư • Hoạt tính kháng