(Thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.Hồ Chí Minh)
a/ Nguyên tắc
Khả năng ức chế quá trình peroxy hoá lipid của các chất nghiên cứu được đánh giá thông qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA), MDA là sản phẩm của quá trình peroxy lipid màng tế bào. Khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở buớc sóng 532nm. Phản ứng được thực hiện ở môi trường pH: 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100oC trong vòng 10 – 15 phút. Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ với hàm lượng MDA.
Đo cường độ màu của mẫu suy ra lượng MDA có trong mẫu.
O O N N OH OH HS N N OH HO N N OH OH S S H O H H O H H H -2H2 to
malonyl dialdehyde acid thiobartituric triethine complex
Cl
Hình 3.3: Cơ chế tạo màu của MDA
Chất đối chứng: trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid).
b/ Phương pháp thực hiện
0.1ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0.5ml dung dịch đồng thể não chuột và thêm đệm phosphate vừa đủ 2ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 15 phút, dừng phản ứng bằng 1ml tricloacetic acid 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml thiobartiburic acid 0.8% trong 15 phút, 100oC. Làm lạnh và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ=532nm. Xây dựng đồ thị phụ thuộc %HTCO (công thức 3.1) theo nồng độ chất hay dung dịch cần đo, từ đó xác định nồng độ của mẫu thử tương ứng với giá trị %HTCO = 50%. Đó chính là giá trị
38
IC50 của mẫu thử, so sánh với IC50 của chất đối chứng là trolox.
Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo.