3.2.1. Phân lập curcumin
Nguyên liệu : Nguyên liệu ban đầu là bột curcuminoid thương phẩm của Viện
Dược Liệu Hà Nội được chiết xuất từ nghệ vàng (Curcuma Longa L.). Quy trình phân lập
Sơđồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin
Hệ dung môi methanol - nước Thời gian 24 giờ, 50C
Bột curcuminoid
Kết tinh lại
Tinh thể
Curcumin
Sắc ký cột Silicagel 60G 63-200µm Dung môi : 100% CH 2Cl2
Cur tinh
<95
%
3.2.1.1. Kết tinh lại
Mục đích
- Loại bỏ bớt một số tạp chất, chất nhựa trong nguyên liệu.
- Thu phần tinh thể có hàm lượng Cur cao giúp cho quá trình sắc ký cột phân lập Cur được dễ dàng và cho hiệu suất cao.
Nguyên tắc.
Dựa trên tính tan khác nhau của các chất trong dung môi theo nhiệt độ và độ tinh khiết của hỗn hợp đem kết tinh.
Phương pháp thực hiện Hóa chất, nguyên liệu
Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại
STT Nguyên liệu Khối lượng
1 Bột curcuminoid 2g
2 Methanol 500ml
3 Nước cất 100ml
Tiến hành Kết tinh lần 1
Hoà tan hoàn toàn 500mg bột curcuminoid trong methanol ở 50oC.
Thêm từ từ nước cất (ở 50oC) vào cho đến khi dung dịch vừa đục.
Bổ sung thêm methanol vào cho đến khi dung dịch trong trở lại.
Để cho dung dịch trên từ từ hạ về nhiệt độ phòng rồi cho vào tủ đá kết tinh trong 24 giờ ở 5oC.
Lọc hút chân không thu tinh thể chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết tinh lần 2, 3
Lấy phần tinh thể đã làm khô sau lần kết tinh trước đó, tiến hành lại các thao tác kết tinh như đã trình bày.
Tinh thể thu được sau khi lọc cũng được làm khô chân không. Cân, ghi kết quả, chuẩn bị cho sắc ký cột.
26
3.2.1.2. Sắc ký bản mỏng (TLC)
Mục đích
Xác định hệ dung môi chạy sắc ký cột.
Kiểm tra thành phần, độ tinh khiết các phân đoạn trong sắc ký cột. Nguyên tắc
Dựa trên sự tương tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau.
Phương pháp thực hiện Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất
Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi
STT Nguyên liệu Khối lượng
1 2 3 4 5 6
Bột curcuminoid sau 3 lần kết tinh. Methanol
Dicloromethane Cloroform Acetone
Bản mỏng silica gel 60G, Merck
3-5mg 1chai (500 ml) 1chai (500ml) 1chai (500ml) 1chai (500ml) 20x20cm2 Tiến hành Chuẩn bị
- Hoạt hóa bản mỏng silica gel bằng cách sấy 1giờ ở 110oC sau đó để cân bằng trong bình hút ẩm 30 phút.
- Vuốt ống vi quản bằng ngọn lửa đèn cồn, rửa mao quản 2 lần bằng acetone.
Chấm mẫu lên bản mỏng
- Hòa tan một ít mẫu curcuminoid vào chai bi bằng methanol.
- Dùng ống vi quản hút một ít mẫu đã hòa tan trong chai bi chấm lên bản mỏng. Khoảng cách vết chấm cách bờ dưới 1cm, hai bờ hai bên 1.5cm, và khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau 1cm. Kích thước của vết chấm càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt.
Triển khai bản mỏng
Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô.
Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lượt theo các tỷ lệ xác định. Bão hòa khí quyển trong bình triển khai từ 15-20 phút.
Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình, đậy nắp bình lại.
Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cách mép trên của tấm bản mỏng khoảng 1cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai.
Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi.
Phát hiện vết và tính trị số Rf
Phát hiện vết qua màu sắc tự nhiên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phát hiện vết dưới đèn UV (254nm/365nm).
Phun thuốc thử H2SO4 10% trong C2H5OH rồi hơ nhẹ trên nhiệt. Tính Rf
y x Rf =
x: là khoảng cách từ điểm chẫm mẫu đến trung tâm của vết sau khi triển khai.
y: khoảng cách từ điểm vết chấm đến mức dung môi sau cùng.
Hình 3.1: Phương pháp tính Rf Nhận xét và đánh giá các vết trên các bản mỏng để chọn dung môi chạy bản mỏng phù hợp. Chọn dung môi để rửa giải cột sắc ký.
3.2.1.3.Sắc ký cột
Mục đích: phân lập các thành phần trong hỗn hợp ban đầu.
Nguyên tắc: Dựa vào ái lực khác nhau của các chất trong hỗn hợp ban đầu đối với pha tĩnh trong cột và pha động đi ngang qua cột mà mỗi chất sẽ di chuyển theo pha động ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy mà có thể tách riêng từng đơn chất trong hỗn hợp ban đầu.
Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ, hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột (pha động) mà nó được rửa ra khỏi cột trước hay sau.
28 Phương pháp thực hiện:
Hóa chất, dụng cụ:
- Cột thủy tinh.
- Silica gel 60G, 0.063-0.200mm, Merck. - Methanol, dicloromethane (Chemsol Vina). - Cát biển 0.1-0.315 (Merck).
- Bông y tế sạch.
• Pha động: Khảo sát trước bằng TLC và chọn dung môi 100%CH2Cl2.
• Pha tĩnh: Silica gel 60G, 0.063-0.200mm, Merck. Khối lượng silica gel cần để nạp cột là 70g.
• Cột: Cột thủy tinh Φ=35mm.
Chiều cao của cột sau khi nạp silica gel khoảng 16cm
• Mẫu: Mẫu là bột curcuminoid khô sau khi đã kết tinh 3 lần. mmẫu = 4.0213g.
Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp nạp mẫu ướt. Tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị
- Sấy silicagel ở 1100C trong 4 giờ, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm trong 30 phút. Ngâm qua đêm với dung môi chạy cột (CH2Cl2).
- Cột được rửa sạch, sấy khô, kẹp thẳng góc trên giá, cho bông gòn vào đáy. Bước 2: Nhồi cột
- Cho dung môi chạy cột vào đến nửa cột, mở van, từ từ cho silica gel vào cột cho đến khi hết lượng silica gel cần nhồi.
- Cho dung môi chạy tuần hoàn khoảng 2-4 giờ để nén lớp silica gel cho đến khi ổn định.
Bước 3: Hòa tan hoàn toàn lượng mẫu cần nạp bằng CH2Cl2 rồi nạp hết lượng dung dịch trên vào cột.
Bước 4 : Triển khai cột.
3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất imne – curcumin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2 hydrazinobenzothiazolcurcumin a/ Quy trình tổng hợp a/ Quy trình tổng hợp
Sơđồ 3.3: Quy trình tổng hợp 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC)
Sắc ký cột
- Khuấy trộn, hoàn lưu - Nhiệt độ: 60oC
Dung môi:
CH3COOC2H5: H2O Imine hóa
Loại dung môi
Phân lập Rửa, chiết
Cô giảm áp
Kiểm tra - TLC, đo điểm chảy - IR, MS, NMR 2 hydrazinobenzothiazole Curcumin Dung môi: CH3OH Chỉnh về pH~5 (CH3COOH) Khảo sát hoạt tính sinh học < 95% >=95%
30
b/ Phương pháp thực hiện
Hóa chất, dụng cụ, nguyên liệu:
- Curcumin tinh (sản phẩm từ sắc ký cột giai đoạn trước). - 2- Hydrazinobenzothiazole 97%.
(CTPT: C7H7N3S, M =165.22 ) - Acetic acid.
- Sodium acetate.
- Methanol, diclomethane, Ethyl acetate (Chemsol Vina). Tiến hành
- Cân 448.96mg 2-Hydrazinebenzothiazole vào bình cầu rồi hòa tan bằng methanol.
- Điều chỉnh pH của dung dịch trên về pH = 5 bằng CH3COOH, cho tiếp 500 mg Cur tinh vào bình cầu và khuấy trên bếp khuấy từ.
- Thực hiện phản ứng imine hóa trong ở 600C, có khuấy trộn, hoàn lưu liên tục. - Kiểm tra điểm dừng phản ứng bằng TLC với bản mỏng silica gel trong hệ dung môi CH2Cl2: CH3OH (98:2)( v/v) so với hỗn hợp ban đầu của phản ứng. Nhận thấy khi bản mỏng xuất hiện vết lạ phản quang màu tím dưới đèn UV và vết Cur nhạt thì ngưng phản ứng và tiến hành xử lý mẫu.
c/ Xử lí mẫu sau phản ứng
Mục đích: Loại bỏ bớt tạp chất sau phản ứng ra khỏi hỗn hợp. Hóa chất, nguyên liệu
- Ethyl acetate (Chemsol Vina) - Nước cất.
- Hỗn hợp sau phản ứng.
Tiến hành:
- Cô quay chân không để loại dung môi của hỗn hợp sau phản ứng. - Hòa tan hoàn toàn cắn thu được bằng ethylacetate.
- Cho hỗn hợp trên vào phễu chiết từ từ thêm nước cất vào lắc đều.
- Để yên cho dung dịch trên tách ra thành 2 lớp, mở van từ từ loại bỏ lớp dung dịch nước ở phía dưới, giữ lại lớp dung dịch ethylacetate ở phía trên.
- Làm khan dung dịch ethylacetate thu được bằng Na2SO4 khan. - Cô quay giảm áp loại dung môi thu cao sản phẩm thô.
d/ Tinh chế mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi xử lý mẫu tiến hành sắc ký cột để phân lập HBTC. Sắc ký cột thô
Hóa chất, nguyên liệu: Dicloromethane (Chemsol Vina), Ete dầu (30-60) (Trung Quốc)
Cao sản phẩm thô sau phản ứng tổng hợp HBTC.
Điều kiện sắc ký cột:
- Silica gel 60G (0.063-0.200mm, Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ trước khi nhồi cột.
- Cột sắc ký: đường kính 3cm, chiều cao silica gel trong cột: 30cm.
- Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: dicloromethane:eter dầu (70:30) (v/v)
Điều kiện sắc ký bản mỏng để kiểm tra quá trình sắc ký cột:
- TLC silica gel 60G F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. - Bản mỏng 5cm x10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm. - Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2:CH3OH: (98:2) (v/v). - Hiện màu TLC dưới đèn UV (254nm/365nm).
Sắc ký cột tinh
Hóa chất, nguyên liệu: Dicloromethane (Chemsol Vina).
Sản phẩm từ sắc ký cột thô.
Điều kiện sắc ký cột:
- Silica gel 60G, 0.04-0.06mm, Merck được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ trước khi nhồi cột.
- Cột sắc ký: đường kính 2.5cm, chiều cao silica gel trong cột: 30cm. - Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: 100%CH2Cl2
Điều kiện sắc ký bản mỏng để kiểm tra quá trình sắc ký cột:
- TLC silica gel 60G F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. - Bản mỏng 5cm x10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm. - Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2:CH3OH = 98:2 (v/v). - Hiện màu TLC: dưới đèn UV (254nm/365nm).
32
3.2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin a/ Quy trình tổng hợp a/ Quy trình tổng hợp
Sơđồ 3.4: Quy trình tổng hợp 2,4-Diflorophenylhydrazino curcumin (DFPHC)
Sắc ký cột
-Khuấy trộn, hoàn lưu - Nhiệt độ: 60oC
Dung môi:
CH3COOC2H5: H2O Imine hóa
Loại dung môi
Phân lập Rửa, chiết
Cô giảm áp
Kiểm tra - TLC, đo điểm chảy - IR, MS, NMR 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochloride Curcumin Dung môi: CH3OH Chỉnh về pH~5.0 (CH3COONa) Khảo sát hoạt tính sinh học >=95% <95 %
b/ Phương pháp thực hiện
Hóa chất, dụng cụ, nguyên liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Curcumin tinh khiết đã phân lập ở thí nghiệm trên. • 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode 97%
(CTPT: C6H6F2N2.HCl, M =180.59 ) • Sodium acetate (CH3COONa)
• Methanol • Ethylacetate • Natrisulfat khan • Nước cất.
Tiến hành
Cân 500mg Cur tinh và 490.74mg 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode. Cho 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode vào bình cầu 2 cổ rồi hòa tan hoàn toàn bằng CH3OH. Điều chỉnh pH của dung dịch về pH=5 bằng CH3COONa.
Cho tiếp Cur tinh vào bình cầu và đặt trên bếp khuấy từ. Thực hiện phản ứng imine hóa ở 60oC, khuấy trộn liên tục.
Duy trì ổn định các điều kiện phản ứng và kiểm tra liên tục bằng TLC với bản mỏng silica gel trong hệ dung môi triển khai CH2Cl2: CH3OH (98:2)(v/v) cho đến khi vết Cur trong bình phản ứng nhạt đi và xuất hiện vết lạ ngay trên đầu Cur, vết này đậm dần lên cho phản quang màu tím khi cho hiện màu dưới đèn UV thì dừng phản ứng và tiến hành xử lý mẫu.
c/ Xử lý mẫu sau phản ứng
Mục đích: Loại bỏ bớt tạp chất ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng Hóa chất, nguyên liệu
- Ethyl acetate (Chemsol Vina) - Nước cất
- Hỗn hợp chất sau phản ứng.
34
d/ Tinh chế sản phẩm
Để làm tinh sản phẩm hay tách sản phẩm DFPHC ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng phải tiến hành sắc ký cột thô với pha tĩnh là Al2O3 trung tính, pha động là CH2Cl2: CH3OH: 99:1(v/v) sau đó tăng dần lên đến tỷ lệ CH2Cl2: CH3OH: 70:30 (v/v).
Sắc ký cột thô
Hóa chất, nguyên liệu: Dicloromethane, methanol (Chemsol Vina)
Cao sản phẩm thô sau phản ứng tổng hợp DFPHC
Điều kiện sắc ký cột:
- Aluminium oxide 60, 0.063-0.200 mm, trung tính (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ trước khi nhồi cột.
- Cột sắc ký: đường kính 3.5cm, chiều cao aluminium oxide trong cột: 16cm. - Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: CH2Cl2:CH3OH: 99:1 (v/v) sau đó tăng dần lên CH2Cl2:CH3OH: 70:30
Điều kiện sắc ký bản mỏng để kiểm tra quá trình sắc ký cột
- TLC Aluminium 60G trung tính, F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. - Bản mỏng 5cmx10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm.
- Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2:CH3OH (98:2) (v/v). - Hiện màu TLC: đèn UV (254nm/365nm)
Sắc ký cột tinh
Hóa chất, nguyên liệu: Dicloromethane (Chemsol Vina),
Sản phẩm DFPHC từ sắc ký cột thô.
Điều kiện sắc ký cột:
- Silica gel 60G, 0.04-0.06mm, Merck được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ trước khi nhồi cột.
- Cột sắc ký: đường kính 25mm, chiều cao silica gel trong cột: 30cm. - Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: 100% dicloromethane.
Điều kiện sắc ký bản mỏng để kiểm tra quá trình sắc ký cột: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
– TLC silica gel 60G F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. – Bản mỏng 5cm x10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm. – Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2:CH3OH: 95:5 (v/v). – Hiện màu TLC: đèn UV (254nm/365nm).
3.2.3. Phân tích cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp 3.2.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis). 3.2.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis).
Phổ tử ngoại khả kiến được đo bằng máy HACH DR5000 tại phòng thí nghiệm Trung tâm Lọc hoá dầu, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh. Độ phân giải: 1nm, nồng độ mẫu thử: 2x10-3 g/l.
3.2.3.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR được phân tích tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc Gia vật liệu composite & polyme, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.
3.2.3.3. Khối phổ
Phổ MS được phân tích tại Trung tâm phân tích công nghệ cao Hoàn Vũ, 112A Lương Thế Vinh, Phường Tân Thới Hoà, Q. Tân Phú, TP. Hồ Chí Minh.
3.2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ NMR được phân tích tại Viện Hoá học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. Máy phân tích: máy Bruker AV 500, 500 MHz cho 1H và 125 MHz cho 13C.
3.2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học
3.2.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH
(Thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.Hồ Chí Minh)
a/ Nguyên tắc
Ở mức độ in vitro, các chất nghiên cứu được đánh giá sàng lọc tác dụng kháng oxy hoá theo phương pháp thử nghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2- picryhydrazyl). Khả năng quét gốc tự do DPPH được xác định bằng sự giảm độ hấp thu ở λ=515nm, do gốc DPPH bị khử bởi chất kháng oxy hoá (AH).
không trong thức s đo. X dung Hình 3 Chất đối c b/ Phươn – Pha g bền ánh sá – Dung Bảng 3.3: Ống Trắng Chứng Thử − Lắc 30 phút và − Tín sau (3.1) Trong đó: Các số liệ Xây dựng đ dịch cần 3.2 :Phản ứ chứng: Vita ng pháp tiến dung dịch áng nên chỉ g dịch thử: : Bảng nồng Dung c đều các ố đo quang ở nh toán kết ODC: m ODtrang ODthu : ệu kết quả t đồ thị phụ đo, từ đó + AH ứng quét gố amin C (Aci n hành DPPH có ỉ pha ngay t Pha mẫu cầ g độ các du dịch thử 0.0 0.0 0.5 ống trong 1 ở bước sóng quả: hoạt mật độ quan : mật độ qu mật độ qua thí nghiệm thuộc %H ó xác định %HTCO= ốc tự do DPP id L-ascorb nồng độ 1 trước khi sử ần thử trong ung dịch thử Me 4. 3. 3. 15 giây, để g λ = 515nm tính kháng ng của mẫu uang của m ang của mẫu
được biểu HTCO (côn h nồng độ − − Tr C T C OD OD OD OD PH của chấ bic) mM trong ử dụng). g methanol ử DPPH OH .0 .5 .0 ể ổn định tr m. oxy hóa D mẫu trắng u thử. diễn bằng t ng thức 3.1 của mẫu % 100 × rang Thu ất kháng oxy methanol ( theo bảng n Dung dị 0 0 0 rong tối ở DPPH được trị số trung