Bước đầu phân tích proteomics tế bào bệnh Leukemia

http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN M U Leukemia nhóm b nh máu c a h th ng t o máu, g p m i l a tu i M , Hàng n m có 30.800 ng p sinh m ng iđ OBO OK S CO M v i bi u hi n b nh r t đa d ng, t l m c b nh ngày cao c ch n đốn m c b nh leukemia c c a kho ng 21.700 ng i [27] T i Vi t Nam, ch a có nghiên c u ti n hành đ y đ v d ch t h c c a b nh leukemia c p tồn qu c nh ng theo t ng k t t i Vi n Huy t h c-Truy n máu th y b nh g p t l cao nh t (32,1%) [2] s b nh máu g p t i sinh khơng ki m sốt đ ch y u t i tu x c tr ng c a b nh s t ng c c a m t ho c vài dòng t bào non (blast), b t đ u ng Các kh i t bào gây t n th ng c quan t o máu, h th ng mi n d ch m t s c quan khác, nhanh chóng đe d a đ n s c kh e tính m ng c a ng i b nh Vi c u tr b nh leukemia đ t hi u qu cao đòi h i ph i có s phân lo i ch n đốn xác th b nh Nh ng nghiên c u đ u tiên v b nh leukemia b t đ u t đ u th k XIX, cho đ n nay, th gi i có r t nhi u nghiên c u v v n đ phân lo i ch n đốn b nh Cùng v i s ti n b c a khoa h c, b nh leukemia đ c nghiên c u phân lo i t c p đ phân t , nh vi c u tr leukemia c p có nh ng ti n b rõ r t M t nh ng ph ng pháp m i nh t b nghiên c u b nh leukemia proteomic c đ u đ ây m t ph c áp d ng đ ng pháp h u d ng vi c phân tích h protein c a m t c th sinh v t, mang l i nhi u ng KIL d ng quan tr ng sinh h c, y h c, d c h c nghiên c u c ch q trình sinh h c c a c th V i k thu t proteomics ng i ta nghiên c u ch th sinh h c c a nhi u lo i b nh khác nhau, đ c bi t b nh ung th nh ung th vú, ung th n ti n li t, ung th qu n, ung th ph i, ung th gan, ung th bu ng tr ng… Trong khn kh lu n v n này, tơi ti n hành đ tài nghiên c u: http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN “B c đ u phân tích proteomics t bào b nh leukemia” nh m m c tiêu tách t bào b ch c u c a b nh nhân b b nh leukemia phân tách KIL OBO OKS CO M protein c a chúng ph c v cho nghiên c u proteome b nh leukemia http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN CH NG – T NG QUAN 1.1 Khái qt v b nh leukemia KIL OBO OKS CO M 1.1.1 Leukemia gì? Leukemia m t d ng ung th liên quan đ n h th ng t o máu c a c th , bao g m h b ch huy t t y x ng, đ c đ c tr ng b i s t ng sinh ác tính c a các dòng t bào máu, đ c bi t b ch c u b nh ung th [6] Nam gi i Leukemia chi m kho ng 2% t ng s d ng nh m c leukemia nhi u h n ph n ng h n nhóm ch ng t c ng i khác Ng i tr i da tr ng m c b nh nhi u ng thành b leukemia t n cơng phát tri n nhi u h n 10 l n so v i tr em Leukemia g p tu i tr ng thành Khi leukemia di n bi n tu i d i Riêng t i M n m 2008, theo tính tốn có kho ng 44 270 ng (25180 nam 19090 n ) đ m ng c a 21700 ng tr em, th h u h t l a ng x y nh t c chu n đốn leukemia s c i 11% s ng i m c b nh đ tu i d đ i p sinh i 20 [18] 1.1.2 Ngun nhân gây b nh leukemia Cho t i ngun nhân gây leukemia v n ch a đ c làm sáng t Tuy nhiên, nhà nghiên c u nh n m nh đ n nhóm nhân t có th gây b nh leukemia: - Các b c x t nhiên nhân t o - M t vài d ng ch t hóa h c nh hóa ch t nhómAlkyl - M t s d ng virus: HTLV1, gây leukemia dòng T lympho - Các y u t di truy n: d ng b t th ng nhi m s c th nh chuy n đo n, thi u ho c th a nhi m s c th ,… C ng gi ng nh b nh ung th khác, leukemia k t qu t đ t bi n ADN q trình ngun phân Các đ t bi n gây ho t hóa gen ung th ho c b t ho t gen tri t tiêu u b u, làm h ng q trình phá h y t bào ch t c ng nh q trình bi t hóa phân bào Nh ng đ t bi n có th http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN phát sinh m t cách ng u nhiên ho c k t qu c a vi c ph i nhi m b c x ho c h p ch t gây ung th nh ng ch t nh h ng đ n b máy di truy n Virus c ng có liên quan đ n m t vài d ng leukemia B nh thi u máu Fanconi c ng KIL OBO OKS CO M m t tác nhân d n đ n s hình thành b nh leukemia dòng t y [24] Do ch a tìm đ c ngun nhân c a b nh, ng i ta khơng có b t c bi n pháp đ có th phòng b nh 1.1.3 Phân lo i b nh leukemia Leukemia đ c chia làm lo i Leukemia c p (Acute leukemia - AL) Leukemia kinh (Chronic leukemia – CL) Leukemia c p s t ng sinh c a t bào non, đơi m t s t bào bi t hóa, leukemia kinh s t ng sinh c a t bào tr ng thành h n ho c bi t hóa D a vào ngu n g c c a t bào ác tính thu c dòng lympho hay dòng t y, ng i ta chia thành leukemia c p dòng lympho (acute lymphocytic leukemia, ALL), leukemia c p dòng t y (acute myelocytic leukemia, AML), leukemia kinh dòng lympho (Chronic lymphocytic leukemia-CLL) leukemia kinh dòng t y (Chronic myelocytic leukemia - CML) Nh nh ng đ c m v hình thái h c, hóa h c t bào, ph ng pháp mi n d ch s d ng kháng th đ n dòng đ xác đ nh d u n màng t bào (CD), di truy n t bào, sinh h c phân t , ng i ta phân lo i leukemia c p dòng t y thành th t Mo đ n M7 leukemia dòng lympho thành th L1, L2, L3 Ngồi m t s th khác nh Leukemia t bào g c sinh máu ch a bi t hóa, Leukemia t bào h n h p (Mixed Leukemia): t y lai v i lympho, t y lai v i t bào di t t nhiên (NK), t y lai T ho c B lympho http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN KIL OBO OKS CO M Leukemia L3 Leukemia c p dòng lympho (ALL) L2 M7 M6 M5 M4 M3 M2 Leukemia c p dòng t y (AML) M1 Leukemia kinh dòng lympho (CLL) M0 Leukemia kinh dòng t y (CML) Leukemia c p (AL) L1 Leukemia kinh (CL) Hình S đ phân lo i b nh leukemia 1.1.3.1 Leukemia c p c m c a leukemia c p s t ng sinh t bào non ch a tr (immature hemopoietic), t y x ng thành ng có ≥ 30% t bào non (blast) t ng s t bào có nhân Các t bào máu non sinh s n nhanh chóng t y x chúng l n át t bào bình th ng, gây c ch t o h ng c u, b ch c u, ti u c u, đơi có th lan c quan khác (hi n t Leukemia c p đ ng thâm nhi m hay xâm l n) c chia làm hai nhóm * Leukemia c p dòng lympho x y ph bi n tr ng thành Theo th ng kê 61% d ng, M n m 2008 có 5430 ng tr em ng i m i i m c ALL i đ tu i 20 [18] ALL x y t bào t o máu s c p g i ngun bào lympho t ng sinh mà khơng phát tri n thành t bào máu bình th th ng Nh ng t bào b t ng l n át t bào máu kh e m nh Chúng có th t p trung l i h ch b ch huy t gây s ng t y T l s ng sót đ i v i b nh bi n thiên theo l a tu i, 85% tr em 50% ng i l n[14] http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN D a vào hình thái hóa h c t bào (h th ng phân lo i FAB), ALL đ c chia thành th khác nhau[5]: + L1: T bào t ng đ i đ ng đ u, t l nhân ngun sinh ch t r t h p KIL OBO OKS CO M kích c t ng đ i đ ng nh t v m t hình thái, t bào nh , + L2: Hình thái t bào to nh khác nhau, t l nhân, ngun sinh ch t khơng đ ng đ u, nhân có bi u hi n khơng thu n nh t + L3: T bào ác tính cao: to, nhân có nhi u h c (vacuole) D a vào d u n mi n d ch c a màng t bào, ALL đ b ng c phân lo i theo B ng Phân lo i theo mi n d ch ALL Th % Hình Mi n d ch thái Dòng lympho B Ti n ti n 11 L1, L2 HLA-DR, TdT, CD19 10 L1, L2 HLA-DR, TdT, CD19, Ig bào 51 L1, L2 t L3 HLA-DR, B Ti n B Chung ng TdT, CD19, CD10 (CALLA) B bi t hóa HLA-DR, TdT, CD19, Ig b m t t bào Dòng lympho T Ti n T T bi t hóa L1, L2 TdT, CD3, CD7 17 L1, L2 TdT, CD3, CD&, CD1a/2 * Leukemia c p dòng t y d ng leukemia c p ph bi n nh t tr ng thành, t l m c b nh t ng d n theo tu i ng i M , t vong AML chi m t l 1,2% t ng s ca t vong ung th [16] AML x y t bào http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN non t ng sinh q m c nh ng khơng ho c bi t hóa đ phát tri n thành t bào máu bình th ng Các ngun t y bào non ch t đ y t y x s n sinh c a t bào máu kh e m nh bình th ng ng c n tr s i u d n t i thi u máu KIL OBO OKS CO M (khơng có đ t bào h ng c u), ch y máu thâm tím (do thi u t bào ti u c u, y u t giúp t o thành c c máu đơng) th ng xun b nhi m trùng khơng có đ t bào b ch c u làm nhi m v b o v T l s ng sót n m c a b nh nhân m c AML 40% [9] D a vào hình thái hóa h c t bào (FAB), AML đ khác [5] c chia thành th + M0: T bào t y khơng bi t hóa ho c bi t hóa r t ít, ph n ng PO+ 3% + M2: T bào t y bi t hóa m t ph n, ph n ng PO+ >20% giai đo n ti n t y bào – g i leukemia c p ti n + M3: T bào bi t hóa t y bào + M4: B nh lý x y t bào ngu n giai đo n h t/mono – g i leukemia c p dòng h t/mono + M5: B nh lý xu t hi n dòng mono + M6: B nh lý x y h ng c u + M7: B nh lý x y ti u c u t bào đ u dòng mono - g i leukemia c p t đ u dòng h ng c u g i leukemia c p dòng đ u dòng m u ti u c u g i leukemia dòng m u D a vào d u n mi n d ch c a màng t bào, AML đ b ng c phân lo i nh B ng Phân lo i theo mi n d ch AML Th Hình thái Mi n d ch http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN + Dòng t y chung: M0, M1-M3 + Dòng h t/mono: M4 CD33+, CD14+, CD13, CD11+, + Dòng t y mono: M5 CD14+, CD33+ KIL OBO OKS CO M CD33+, CD34 + Dòng h ng c u M6 Glycophorin –A, CD71 + Dòng m u ti u c u: M7 CD41, CD61 Hi n nay, h th ng phân lo i c a t ch c y t th gi i (WHO) c ng đ c khuy n cáo s d ng thêm vào d li u v m t lâm sàng c ng nh đ c tính sinh h c đáng quan tâm nh hình thái h c, hố h c t bào, ki u hình mi n d ch, di truy n t bào sinh h c phân t Vi c phân chia phân nhóm c ng d a vào s khác bi t thơng s ch n đốn xác đ nh b nh nhân phù h p h n v i ph ng pháp u tr đ c bi t 1.1.3.2 Leukemia kinh Leukemia kinh phân bi t v i Leukemia c p c th s n sinh q nhi u t bào máu g n tr nh ng th ng thành, chúng phát tri n theo đ ng khác ng khơng th c hi n ch c n ng gi ng nh t bào máu tr thành Leukemia kinh th ng ng phát tri n ch m h n bi u hi n r m r h n leukemia c p Có hai d ng leukemia kinh ch y u: - Leukemia kinh dòng lympho th l ng i m c b nh cao nh t bào ác tính t y x ng g p nh ng ng i 55 tu i T đ tu i t 60 đ n 70 tu i CLL, t ng t bào thu c lympho Nh ng t bào b t th khơng có kh n ng ch ng l i s nhi m trùng nh t bào bình th CLL, t bào ung th có t y x ng ng ng, máu, lách h ch b ch huy t, chúng gây lách to, h ch to T l s ng sót n m c a b nh nhân m c CLL 75% [18] - Leukemia kinh dòng t y hay g p nh t đ tu i t 25 đ n 60 tu i CML, t bào ác tính t bào thu c dòng t y Các t bào CML th m t d ng b t th ng ch a ng mã di truy n g i nhi m s c th Philadelphia Tuy http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN nhiên, b nh khơng di truy n Leukemia kinh dòng t y có th đ b ng vi c c y ghép t y x c ch a kh i ng T l s ng sót n m c a b nh nhân m c CML 90% [20] đơi đ KIL OBO OKS CO M Ngồi có Leukemia t bào tóc (Hairy cell leukemia - HCL) HCL c coi m t d ng c a CLL, nhiên khơng hồn tồn gi ng nh ng đ c m c a CLL Kho ng 80% nh ng ng ch a có m t tr ng h p x y i b b nh nam gi i tr em T l s ng c a b nh 10 n m t 96-100% [12] 1.1.4 Tri u ch ng c a b nh leukemia Các bi u hi n ban đ u c a leukemia c ng gi ng nh tri u ch ng c a c m cúm hay b nh thơng th ng khác, bao g m h i ch ng ch y u: - H i ch ng nhi m trùng: s t, m t m i, đau kh p, th trùng ng xun nhi m - H i ch ng thi u máu: da xanh, đau đ u, chóng m t, ch y máu hay s ng r ng, l i t y - H i ch ng xu t huy t th ng, ch y máu m i hay th da, niêm m c, c kh p, ch m lành v t ng xun b b m tím - H i ch ng h ch: h ch to, lách to, gan to, c m th y đ y b ng, ch b ng ng 1.4.5 Ch n đốn b nh leukemia Bác s có th khơng phát hi n leukemia n u ch d a nh ng tri u ch ng c a b nh nhân Tuy nhiên, qua q trình khám s c kh e, bác s có th phát hi n r ng b nh nhân có h ch b ch huy t n i lên hay hi n t th ng t ng kích c c a gan ho c lách Vi c ch n đốn có th tr nên rõ ràng h n xét nghi m máu đ nh k (đ c bi t đ m t bào máu) cho k t qu khác th B nh nhân đ c ch đ nh ti n hành l n l ng t xét nghi m cho đ n xác đ nh xác th b nh m c ph i Các xét nghi m bao g m: huy t đ , t y đ , sinh http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN thi t t y, hóa h c t bào, mi n d ch t bào di truy n t bào D a vào đó, bác s đ a phác đ u tr thích h p cho t ng b nh nhân Huy t đ xét nghi m cho phép xác đ nh s l ng t bào máu l KIL OBO OKS CO M thành ph n liên quan c a máu ngo i vi: h ng c u, b ch c u ti u c u, hàm ng huy t s c t , t l h ng c u th tích máu tồn ph n, ph n ánh tình tr ng thi u máu ho c đ c máu (hematocrit) Huy t đ đ c ti n hành nh m: - Sàng l c nh ng b nh lý đ c tr ng b i nh ng thay đ i nghiêm tr ng v s l ng t bào máu (ví d b nh nhi m trùng, m t s b nh ung th , b nh nhân ti p xúc v i hóa ch t đ c h i…) - Theo dõi di n bi n c a m t s b nh nh : b nh leukemia, u b ch huy t, b nh liên quan t i máu, b nh m n tính… - Theo dõi tác d ng ph c a m t s thu c có kh n ng c ch ho t đ ng c at yx ng i u đ c bi t quan tr ng đ i v i nh ng b nh nhân b m t s b nh ung th (nh t ung th máu, u b ch huy t), nh ng ng hóa tr li u ho c x tr N u s l i ph i dùng ng t bào máu gi m xu ng m c q th p, bác s s cho b nh nhân nh p vi n lúc h r t d b nhi m trùng, ch y máu ho c b bi n ch ng nghiêm tr ng khác, gây nguy hi m cho tính m ng b nh nhân leukemia c p, huy t đ th hi n tình tr ng gi m 1-3 dòng t bào c a máu ngo i vi xu t hi n b ch c u non cơng th c b ch c u Các ch s h ng c u máu ngo i vi th h ng c u bình th ng cho th y m t tình tr ng thi u máu bình s c ng khơng h i ph c S l cho đ n 200G/l ng b ch c u có th t d a s b nh nhân có s l ng b ch c u kho ng t 5- 30G/l [4][1] T y đ c a b nh nhân leukemia c p th tr ng t y giàu t bào Tuy nhiên nh ng tr i 1G/l ng cho th y m t tình ng h p leukemia th phát t y th ng nghèo t bào ho c có m t đ bình th th ng t y b thay th b i nh ng t bào non ác tính Các t bào ph i ng Các dòng t bào t o máu bình chi m m t t l ≥30% t bào có nhân t y m i có th xác đ nh ch n đốn leukemia Bên c nh có th quan sát th y s tr ng thành khơng bình http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN (%) 1,15 4,98 3,21 6,18 Lymphocyte (L) (%) 4,95 4,25 22,95 21,38 KIL OBO OKS CO M Monocyte (M) (%) Qua k t qu b ng trên, chúng tơi nh n th y c p có t l t bào b t th b nh nhân b leukemia ng r t cao (69,15% ± 25,71%) M t s b nh nhân b nh nhân có g p tu i trung gian c a dòng h t nh ng 3.2 Tách t bào b ch c u t t y x M u t bào l y t t y x t bào khác c bi t s l ng ng t y c ng nh h ng b nh nhân leukemia i m t m u ph c t p, ch a nhi u lo i ng h ng c u q l n t 4-6T/l, l t nhi u (117,5-153,5g/l) gây nh h M t khác, protein có hàm l t l th p ng huy t s c ng tr c ti p đ n vi c phân tích protein ng cao huy t t ng, đ ng, mu i m ng đ n k t qu phân tích protein t bào b nh leukemia có th nghiên c u protein t bào b ch c u b nh leukemia c n ph i tách t bào b ch c u Do chhúng tơi s d ng Ficoll™ 400 đ tách t bào b ch c u Ficoll™ 400 F4375 m t h p ch t cao phân t d c u t o polysucrose Ficoll đ i d ng b t, tr , có c pha v i đ m PBS ho c SBSS cho đ n có t tr ng thích h p cho vi c phân tách lo i t bào theo t tr ng Trong nghiên c u này, Ficoll đ c pha v i PBS đ đ t t i t tr ng 1,077g/ml hi u qu tách t bào cao đòi h i m u t y x ng ph i đ c ch ng đơng b ng EDTA ho c heparin vi c tách t bào khơng mu n h n 4h sau t y đ c l y t b nh nhân M u t y đ c gi nhi t đ kho ng 20oC, đ c tr n đ u v i PBS theo t l 1:1 r i đ u lên b m t Ficoll có t tr ng 1,077g/ml đ ng ng Eppendoff Ti n hành ly tâm tách t bào ti n hành ly tâm, ta thu đ nhi t đ 4oC Sau c ng m u v i l p tách bi t L p l p d ch n i có t tr ng nh nh t; d i l p l p t bào màu tr ng đ c l p b ch c u Ti p theo l p Ficoll có t tr ng l n h n l p b ch c u cu i l p h ng c u màu đ đ m có t tr ng l n nh t Nh v y v i t tr ng http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN 1,077g/ml, Ficoll tách riêng hai l p t bào có t tr ng khác K t qu c th hi n hình KIL OBO OKS CO M phân tách t bào đ D ch n i T bào b ch c u Ficoll 400 H ng c u Hình Phân tách t bào b ch c u b ng Ficoll™ 400 L p t bào b ch c u đ c hút r a s ch nhi u l n b ng đ m PBS ki m tra kh n ng tách t bào, chúng tơi ti n hành nhu m t bào b ch c u b ng Giêmsa soi t bào kính hi n vi quang h c K t qu đ nh hình A c trình bày B http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN Hình nh ch p t bào b ch c u sau phân tách d phóng đ i 40x; B: phóng đ i 100x KIL OBO OKS CO M A: i kính hi n vi Trên nh ch p m u t bào b ch c u, ta có th th y tồn b t bào đ u b t màu đ c tr ng v i thu c nhu m Giemsa, ch ng t qui trình l c tách t bào thành cơng 3.3 Tách chi t protein t t bào b ch c u Chúng tơi ti n hành nhi u ph c u tách chi t protein D 10% (hình 3) ng pháp khác đ phá t bào b ch i k t qu n di m t chi u SDS-PAGE Hình i n di d ch chi t t bào b ch c u gel polyacrylamide 10% có SDS Gi ng 1: M u đ c ngâm đ m A, gi ng 2: m u t a TCA/Acetone 10% t l 1:3, gi ng 3: m u đ c x lý b ng s c nhi t -80oC t a TCA/Acetone 10% t l 1:2, gi ng 4: m u đ c x lý b ng x c nhi t - 80 oC x lý b ng ReadyPrep Cleanup Kit http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN K t qu gi ng cho th y u ki n bình th hòa tan đ m A, có th tách chi t đ ng m u t bào có th b c protein Tuy nhiên, s l ng b ng r t ít, b ng r t dày đ c bi t có m t b ng r t đ m ch ng t có m t ng l n m u i u cho th y m u v n ch a KIL OBO OKS CO M lo i protein có hàm l s ch, m u v n có nhi u t p ch t làm s ch m u, chúng tơi ti n hành r a thêm t bào ngâm m u đ m A r i t a m u TCA/Acetone 10% t l 1:3 (1 th tích m u: th tích TCA/Acetone) K t qu n di gi ng cho th y l m u r t th p Ngun nhân t a ng protein sau t a t l 1:3, protein khơng kh n ng hòa tan tr đ m m u n di Chúng tơi ti p t c đ a m u t bào sau tách vào t l nh sâu (-80oC) đ phá v t bào b ng cách gây s c nhi t đ a nhi t đ bình th ng Sau ngâm đ m A t a theo t l th p h n (1 th tích m u: th tích TCA/Acetone), chúng tơi thu đ c hình nh n di qu tách chi t theo ph gi ng K t qu n di cho th y hi u ng pháp t t h n Áp d ng qui trình nh ng s d ng ReadyPrep™ Cleanup Kit thay cho vi c t a b ng TCA/Acetone, chúng tơi thu đ Theo ph ng pháp này, hi u qu tách chi t protein cao h n c Trên hình nh n di có nhi u b ng protein nh t, th hi n đ m u Do d ch chi t theo ph chi u c k t qu nh hình gi ng c s đa d ng c a protein ng pháp đ c s d ng cho n di 3.4 i n di hai chi u protein b nh leukemia i n di chi u k thu t n n t ng phân tích proteomics K thu t đ c s d ng đ phân tách protein thu đ c u c huy t t c d ch chi t t bào b ch ng c a b nh nhân leukemia M u đem phân tích m u h n h p, bao g m t bào b ch c u c a b nh nhân leukemia h n h p huy t t bày nh ng c a b nh nhân K t qu n di chi u đ hình ph l c c trình http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN S1 KIL OBO OKS CO M S5 S6 S2 S4 S3 T1 A S1 S5 S7 B S6 S2 S4 S3 Hình Phân tách protein b nh leukemia b ng n di hai chi u, s d ng IPG strip pH 3-10 dài 11 cm chi u I gel gradient 7,5-15% polyacrylamide có SDS chi u II A: T bào b ch c u b nh leukemia , B: Huy t t ng b nh leukemia http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN Trên b n gel n di, protein đ c phân thành t ng spot, hình thành nh ng dãy (chu i) spot c a m t lo i protein ây k t qu c a vi c c i bi n protein, có th bi n đ i sau d ch mã, t o đ ng phân có kh i l ng t m đ ng n g n KIL OBO OKS CO M t t ng phân Các spot b n gel t bào b nh nhân leukemia có khuynh h b r i r c tồn b n gel spot b n gel huy t t trung thành nh ng vùng ng phân ng l i t p i u ph n ánh s đa d ng v lo i protein c t bào protein huy t t ng S d ng ph n m m phân tích hình nh gel n di chi u, chúng tơi xác đ nh đ c 93 spot protein b n gel n di t d ch chi t t bào 84 spot protein b n gel n di huy t t ng So sánh gi a huy t t chúng tơi nh n th y m t s m t ng đ ng khác bi t (hình 6) Vùng S1 S2+S3 S4 T bào Huy t t ng t bào, ng http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN S6 KIL OBO OKS CO M S5 Hình Các vùng spot gi ng b n gel b nh leukemia xác đ nh xác h n spot n di, k thu t phân tích 3D đ c áp d ng K thu t cho phép phân bi t spot n di, nh t nh ng spot r t g n mà bình th ng khơng th phân bi t đ c (hình 7) Hình 7: Hình nh ba chi u (3D) vùng S6 c a b n gel A: T bào b nh leukemia , B: Huy t t ng b nh leukemia D a vào hình nh ba chi u c a spot có th th y s khác bi t m t cách rõ nét v đ l n c ng nh đ đ m c a spot nh đ l n c a spot đ c a spot đ c th hi n b ng b r ng c a đáy spot hình 3-D, đ đ m c th hi n b ng chi u cao c a spot tính t đáy lên đ nh đ s c nét c a spot nhu m màu coomasie đ nh 3-D c ch hình c th hi n b ng đ nh n c a spot y hình http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN D a c s k t qu nghiên c u c a Anderson n m 1977 (hình 8), ta có th th y nh ng c m protein b n gel n di chi u huy t t ng nh sau: Chu i nh IgG (S2) IgG chu i gamma (S5), Antithrombin III, Apo A-II acid Glycoprotein (S7), KIL OBO OKS CO M Lipoprotein (HDL), Apo A-II Lipoprotein (HDL), Haptoglobin chu i beta (S6), Platelet actin (S6) D a nh ng vùng gi ng gi a b n gel d a c m protein xác đ nh đ protein t c b n gel huy t t ng, ta có th d đốn c m ng ng b n gel t bào b nh leukemia nh sau: - Vùng S4: có chu i IgG chu i gamma - Vùng S6: có c m protein Haptoglobin chu i beta Platlet actin - Vùng T1: có c m Apo A-II Lipoprotein Tuy nhiên, đ kh ng đ nh xác protein này, c n ph i ti p t c phân tích protein b ng k thu t khác có k thu t kh i ph http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN Hình V trí nh ng protein b n gel n di hai chi u protein huy t t ng ng i (Anderson L., Anderson N G (1977)) c đ u, ph n ánh s b thành ph n KIL OBO OKS CO M Các k t qu m i ch d li u b protein t bào b ch c u huy t t ng b nh nhân leukemia Thành ph n protein huy t t ng c a b nh leukemia đ cơng trình nghiên c u th gi i c ng nh c cơng b m t s Vi t Nam nh c a Cochran c ng s (2003) [8], c a Tr nh H ng Thái Tr nh Th Thanh H ng n m 2005 2007 [3][25] Thành ph n protein t bào b ch c u c a b nh c ng đ c nghiên c u b i Wang c ng s (2004)[28], Cui c ng s (2004)[10], th m chí đ c phân tách ty th (Rezaul c ng s n m 2005)[21] Các k t qu nghiên c cho bi t s đa d ng, phong phú c a protein t bào b ch c u huy t t đ c sang t , li u protein đ huy t t ng Tuy nhiên nhi u m v n ch a c t ng h p b ch c u có đ c ti t vào ng hay khơng kh n ng nh n d ng protein này, nh t protein có ý ngh a nh ch th c a b nh Vì v y, nghiên c u ti p theo c n ph i sâu phân tách đ y đ rõ ràng protein t bào b ch c u huy t t ng c a b nh nhân leukemia, làm c s cho phân tích nh n d ng protein, ph c v cho ch n đốn u tr b nh http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN CH NG 4- K T LU N VÀ KI N NGH T nh ng k t qu nghiên c u thu đ c chúng tơi rút k t lu n sau: a s b nh nhân leukemia kinh lúc đ ng t bào b ch c u t ng cao Cơng th c b ch c u KIL OBO OKS CO M thi u máu v a, s l c ch n đốn xác đ nh có máu ngo i vi g p đ tu i c a dòng b ch c u h t T l t bào blast[...]... nhóm này K t qu này cho th y phân tích proteomics huy t t ng có th b sung các ph ng pháp trong vi c nh n d ng protein, các protein này có th có vai trò quan tr ng trong vi c xác đ nh s khác bi t v sinh h c và trong ch n đốn gi a các phân nhóm CLL 1.3.2 Phân tích proteomics t bào b nh nhân leukemia Wang và các c ng s (2004) đã ti n hành nghiên c u proteomics dòng t bào leukemia (K562/CR3) b ng vi c... LC/MS [28] Các t bào đ c dung gi i đã đ tách thành 96 phân đo n b ng đi n di khơng dòng, sau đó đ PAGE và nh ng phân đo n hi n b ng đ c ch y qua SDS- c ch y ti p qua LC/MS Trong 96 phân đo n đó có 35 phân đo n pH t 4,75 đ n 9,6 đ đã nh n d ng đ c phân c l a ch n đ xác đ nh và c 736 protein khác nhau C ng vào n m 2004, Cui và c ng s đã ti n hành phân tích proteomics t bào b nh nhân leukemia c p nh m... t l th p ng huy t s c ng tr c ti p đ n vi c phân tích các protein ng cao trong huy t t ng, đ ng, mu i và m ng đ n k t qu phân tích protein t bào b nh leukemia có th nghiên c u protein trong t bào b ch c u b nh leukemia thì c n ph i tách các t bào b ch c u Do đó chhúng tơi đã s d ng Ficoll™ 400 đ tách các t bào b ch c u Ficoll™ 400 F4375 là m t h p ch t cao phân t d c u t o là polysucrose Ficoll đ i... đã đ c s d ng cho đi n di 2 3.4 i n di hai chi u protein b nh leukemia i n di 2 chi u là k thu t n n t ng trong phân tích proteomics K thu t này đã đ c s d ng đ phân tách protein thu đ c u và c trong huy t t c trong d ch chi t t bào b ch ng c a b nh nhân leukemia M u đem phân tích là m u h n h p, bao g m t bào b ch c u c a các b nh nhân leukemia và h n h p huy t t bày nh ng c a chính các b nh nhân... 1,077g/ml, Ficoll đã tách riêng hai l p t bào có t tr ng khác nhau K t qu c th hi n hình 2 KIL OBO OKS CO M phân tách t bào đ D ch n i T bào b ch c u Ficoll 400 H ng c u Hình 2 Phân tách t bào b ch c u b ng Ficoll™ 400 L p t bào b ch c u đ c hút ra và r a s ch nhi u l n b ng đ m PBS ki m tra kh n ng tách t bào, chúng tơi đã ti n hành nhu m t bào b ch c u b ng Giêmsa và soi t bào trên kính hi n vi quang h c K... chúng ta phân tích sâu r ng v s khác bi t v gen, ARN và protein gi a b nh nhân và các m u đ i ch ng bình th ng Hi n nay, v i vi c áp d ng các k thu t proteomics trong phân tích leukemia ng i ta đã đi sâu vào nghiên c u leukemia theo nhi u con đ m c đích khác nhau T t c các nghiên c u này h ng và ng t i m c đích cu i cùng là làm t ng hi u qu đi u tr b nh leukemia Các nghiên c u proteomics b nh leukemia. .. López-Pedrera và nhóm nghiên c u c a mình đã ti n hành phân tích nh ng thay đ i trong bi u hi n protein các t bào leukemia c p dòng t y b ng các k thu t proteomics nh m đi sâu vào KIL OBO OKS CO M ch n đốn s m chính xác h n b nh ung th này B y protein đ c xác đ nh có thay đ i đáng k trong h u h t các t bào ngu n AML phân tích trong m i t quan v i các t bào máu đ n nhân bình th ng ng: alpha-enolase, RhoGD12,... các v t th mang đi n tích d i tác i n di hay đi n di trên gel áp d ng trong sinh h c phân t là m t k thu t đ phân tích các phân t ADN, ARN hay protein d a trên các đ c đi m v t lý c a chúng nh kích th c, hình d ng hay đi m đ ng đi n (isoelectric point) K thu t này ho t đ ng nh vào l c kéo c a đi n tr đ ng vào các phân t tích đi n và kích th đ ng tác c l c a th n n (gel) Các phân t c phân tách khi di chuy... ng phân lo i chúng [10] H th ng phân lo i c a Pháp-M -Anh (FAB) v leukemia c p v i các khác bi t di truy n đóng vai trò quan tr ng trong đi u tr và ch n đốn b nh Tuy http://kilobooks.com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN nhiên, vi c mơ t và xác đ nh các phân t protein khác nhau phân bi t gi a các phân nhóm c a h th ng phân lo i leukemia c p v n ch a rõ ràng Nghiên c u đ c th c hi n trên 61 b nh nhân leukemia. .. c phân bi t ALL v i AML Protein NM23-H1 có bi u hi n m nh t t c các phân nhóm tr d ng M3a có th có ích trong ch n đốn Nh ng k t qu nghiên c u này liên quan đ n vi c mơ t các con đ th ng bi u hi n gen b t ng trong phát sinh b nh leukemia có th làm cho vi c xác đ nh phân t h th ng phân lo i FAB đ m cđ c d dàng N m 2005, Rezaul và nhóm nghiên c u đã phân tích h protein ty th t các t bào T b nh nhân leukemia ...http:/ /kilobooks. com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN “B c đ u phân tích proteomics t bào b nh leukemia” nh... phân tách KIL OBO OKS CO M protein c a chúng ph c v cho nghiên c u proteome b nh leukemia http:/ /kilobooks. com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN CH NG – T NG QUAN 1.1 Khái qt v b nh leukemia KIL OBO... làm h ng q trình phá h y t bào ch t c ng nh q trình bi t hóa phân bào Nh ng đ t bi n có th http:/ /kilobooks. com THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN phát sinh m t cách ng u nhiên ho c k t qu c a vi c ph