nghiên cứu thụ tinh ống nghiệm từ tế bào trứng trên bò sữa cao sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HẢI NGHIÊN CỨU THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TỪ TẾ BÀO TRỨNG TRÊN BÒ SỮA CAO SẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CHĂN NUÔI Mã số : 60.62.40 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYỄN BÁ MÙI HÀ NỘI - 2009 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa ñược công bố công trình khác Mọi giúp ñỡ cho việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn ñều ñã ñược ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Văn Hải Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi tới Ban Giám hiệu trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Sau ðại Học, Khoa Chăn nuôi Nuôi trồng Thuỷ sản thầy cô giáo trường lời cảm ơn sâu sắc Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Bá Mùi giảng viên Bộ môn Hoá sinh Sinh lý ðộng vật – Khoa Chăn nuôi Nuôi trồng Thuỷ sản - Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã tận tình bảo, hướng dẫn suốt thời gian học tập giúp ñỡ hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới cô, chú, anh, chị em phòng Thí nghiệm Trọng ñiểm công nghệ tế bào ñộng vật, Viện chăn nuôi Quốc gia bạn bè ñồng nghiệp, ñặc biệt tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Thoa ñã nhiệt tình giúp ñỡ, góp ý, tạo ñiều kiện cho trình thực ñể luận văn hoàn thành Cuối xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia ñình, anh em, bạn bè, ñồng nghiệp ñã ñộng viên, khích lệ tạo ñiều kiện thuận lợi cho suốt trình hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng 10 năm 2009 Học viên Nguyễn Văn Hải Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… ii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục viết tắt vi Danh mục bảng biểu vii Danh mục ñồ thị viii Danh mục hình ix MỞ ðẦU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ 1.2 MỤC TIÊU 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 2.2 ðẶC ðIỂM SINH DỤC BÒ CÁI 2.2.1 Chu kỳ ñộng dục bò 2.2.2 Thần kinh thể dịch ñiều tiết hoạt ñộng sinh sản bò 2.2.3 Cấu tạo chức buồng trứng 2.2.4 Cấu tạo tế bào trứng 2.3 THU TẾ BÀO TRỨNG BÒ 10 2.4 NUÔI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM 11 2.5 KIỆN TOÀN NĂNG LỰC THỤ TINH CỦA TINH TRÙNG 13 2.5.1 Khái niệm 13 2.5.2 Phương pháp kiện toàn lực thụ tinh tinh trùng TTON.14 2.6 SINH LÝ QUÁ TRÌNH THỤ TINH 15 2.6.1 Quá trình thụ tinh 15 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… iii 2.6.2 ðặc ñiểm phôi giai ñoạn ñầu 17 2.7 TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM 18 2.8 NUÔI PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM 19 2.9 ðÔNG LẠNH PHÔI VÀ GIẢI ðÔNG PHÔI 20 2.9.1 Những chất bảo vệ sinh học lạnh thông dụng 21 2.9.2 Phương pháp ñông lạnh 22 2.9.3 Giải ñông phôi 24 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.3.1 Thu tế bào trứng từ bò sống máy siêu âm 26 3.3.2 ðánh giá phân loại tế bào trứng sau thu 27 3.3.3 Nuôi tế bào trứng bò thành thục ống nghiệm 28 3.3.4 Hoạt hoá tinh trùng cho thụ tinh ống nghiệm 29 3.3.5 Nuôi hợp tử ống nghiệm 29 3.3.6 ðông lạnh giải ñông phôi bò 30 3.3.7 Nuôi cấy in-vitro ñể ñánh giá chất lượng phôi bò sau ñông lạnh giải ñông 31 3.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 32 3.5 THỜI GIAN VÀ ðỊA ðIỂM THỰC TẬP 32 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 THU TẾ BÀO TRỨNG TỪ BÒ SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM 33 4.2 NUÔI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM 37 4.3 THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TẾ BÀO TRỨNG BÒ 43 4.4 NUÔI HỢP TỬ TRONG ỐNG NGHIỆM 50 4.5 ðÔNG LẠNH PHÔI TẠO RA TRONG ỐNG NGHIỆM 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… iv 4.5.1 Chất lượng phôi trước ñông lạnh 58 4.5.2 Chất lượng phôi sau giải ñông 61 4.5.3 Sự phát triển phôi sau ñông lạnh-giải ñông 63 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 66 5.1 KẾT LUẬN 66 5.1.1 Kết thu tế bào trứng bò phương pháp siêu âm hút trứng 66 5.1.2 Kết nuôi tế bào trứng thành thục ống nghiệm 66 5.1.3 Kết thụ tinh nuôi hợp tử ống nghiệm 66 5.1.4 ðông lạnh phôi bò 66 5.2 ðỀ NGHỊ 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT OPU Ovum Pick Up B2 Menezo’s B2 medium BO Brackett and Oliphan BSA Bovine Serum Albumin CR1 Milieu de Rosekrans DMSO Dimethyl Sulfoxide DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline FCS Foetal Calf Serum FSH Follicle Stimulating Hormone GnRH Gonadotropin Releasing Hormone IVM In vitro Maturation LH Luteining hormone COC Cumulus- Oocyte Complex PBS Photphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction TCM 199 Tissue Culture Medium 199 Vero Cellules de rein de singe vert TTON Thụ tinh ống nghiệm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Kết thu tế bào trứng từ bò sống kỹ thuật siêu âm 34 Bảng 4.2 Kết phân loại tế bào trứng thu ñược phương pháp siêu âm 36 Bảng 4.3 Kết nuôi thành thục trứng bò ống nghiệm 38 Bảng 4.4 Ảnh hưởng chất lượng trứng tới tỷ lệ thành thục 40 Bảng 4.5 Kết thụ tinh ống nghiệm trứng bò 44 Bảng 4.6 Ảnh hưởng chất lượng tế bào trứng tới kết thụ tinh ống nghiệm 46 Bảng 4.7 Kết nuôi hợp tử ống nghiệm 50 Bảng 4.8 Ảnh hưởng mật ñộ nuôi ñến phát triển hợp tử 52 Bảng 4.9 Ảnh hưởng chất lượng tế bào trứng ñến phát triển hợp tử 54 Bảng 4.10 Ảnh hưởng môi trường ñến phát triển hợp tử 56 Bảng 4.11 Phân loại phôi sau thu hoạch 59 Bảng 4.12 ðánh giá phân loại phôi trước ñông lạnh 60 Bảng 4.13 Chất lượng phôi sau ñông lạnh-giải ñông 62 Bảng 4.14 Sự phát triển phôi sau ñông lạnh-giải ñông 63 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… vii DANH MỤC BIỂU ðỒ Biểu ñồ 4.1 Kết thành thục loại tế bào trứng 42 Biểu ñồ 4.2 Tỷ lệ thụ tinh loại tế bào trứng 48 Biểu ñồ 4.3 Kết phát triển hợp tử mật ñộ nuôi 53 Biểu ñồ 4.4 Ảnh hưởng chất lượng tế bào trứng ñến phát triển hợp tử 58 Biểu ñồ 4.5 Kết phát triển hợp tử môi trường nuôi cấy 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… viii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1.Tế bào trứng loại A 37 Hình 4.2 Tế bào trứng loại B 37 Hình 4.3.Tế bào trứng loại C 37 Hình 4.4 Tế bào trứng loại D 37 Hình 4.5 Tế bào trứng có tế bào Cumulus giãn nở sau nuôi thành thục 43 Hình 4.6 Tế bào trứng ñã thành thục với xuất thể cực thứ 43 Hình 4.7 Tế bào trứng ñược ủ với tinh trùng 49 Hình 4.8 Tế bào trứng ñã ñược thụ tinh (xuất thể cực thứ 2) 49 Hình 4.9 Phôi dâu loại A 65 Hình 4.10 Phôi dâu loại B 65 Hình 4.11 Phôi nang loại A 65 Hình 4.12 Phôi nang loại B 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… ix KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Kết thu tế bào trứng bò phương pháp siêu âm hút trứng - Sử dụng phương pháp siêu âm hút trứng, tế bào trứng thu ñược /buồng trứng 3,8, tỷ lệ thu tế bào trứng ñạt 71,20% 5.1.2 Kết nuôi tế bào trứng thành thục ống nghiệm - Tỷ lệ tế bào trứng bò thành thục ñạt 71,63% - Tế bào trứng có chất lượng tốt có ảnh hưởng tích cực ñến kết nuôi thành thục, tỷ lệ thành thục cao sử dụng tế bào trứng loại A B (77,59% 76,67%) 5.1.3 Kết thụ tinh nuôi hợp tử ống nghiệm - Tỷ lệ thụ tinh ñạt 50,70% - Tế bào trứng có chất lượng tốt có ảnh hưởng tích cực ñến tỷ lệ thụ tinh phát triển hợp tử ống nghiệm Tỷ lệ thụ tinh ñạt cao sử dụng tế bào loại A B Sự phát triển hợp tử ñạt tỷ lệ cao sử dụng tế bào trứng loại A - Nuôi hợp tử mật ñộ 20 25 tế bào/giọt nuôi cho tỷ lệ phân chia phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu phôi nang cao nuôi mật ñộ 15 30 tế bào/giọt nuôi - Khi nuôi hợp tử môi trường TCM 199 CR1aa: tỷ lệ hợp tử phân chia phát triển ñến ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang môi trường CR1aa tốt nuôi môi trường TCM 199 5.1.4 ðông lạnh phôi bò ðông lạnh phôi phương pháp thuỷ tinh hoá cho kết phôi sống sau ñông lạnh-giải ñông phát triển ñến giai ñoạn thoát màng cao tương ứng ñạt 78,26% 64,44% Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 66 5.2 ðỀ NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu thu tế bào trứng phương pháp siêu âm hút trứng ñưa số kiến thức vào chương trình giảng dạy - Sử dụng phôi tạo từ trứng thu phương pháp siêu âm hút trứng chăn nuôi bò sữa nước ta Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Tiến Dũng, Dương ðình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002), Giáo trình Sinh lý Sinh sản gia súc, NXB Nông Nghiệp Nguyễn Hữu ðức, Nguyễn Thị Ước, Bùi Xuân Nguyên (1996),Trạng thái phát triển nhân tế bào trứng thu từ buồng trứng bò nội Việt Nam, Kỷ yếu Viện công nghệ sinh học Nguyễn Hữu ðức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quảng Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thuỳ Anh, Nguyễn Việt Liên, Bùi Xuân Nguyên (2003), Kết thụ tinh ống nghiệm cấy phôi bò lai Sind, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 699-702 Nguyễn Hữu ðức (2004), Nghiên cứu nuôi thành thục thụ tinh ống nghiệm trứng bò nội Việt Nam, Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Lưu Công Khánh, Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Thoa, Phan Lê Sơn, ðặng Vũ Hoà, Chu Thị Yến, Nguyễn Thị Kim Anh, Hoàng Kim Giao (2003), Nghiên cứu ứng dụng ñông lạnh phôi bò glycerol công nghệ cấy truyền phôi, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội : 720-722 Nguyễn Văn Lý, Hoàng Kim Giao, Lưu Công Khánh, Nguyễn Thị Thoa, Phan Lê Sơn, ðặng Văn Hoà, Chu Thị Yến (2003), Thu thập nuôi cấy tế bào trứng bò In-vitro, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Nguyễn Văn Lý (2006), Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng ñến kết thụ tinh ống nghiệm trứng bò Việt Nam Luận án tiến sĩ Nông nghiệp Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Hữu ðức, Lê Văn Ty, Nguyễn Thị Ước (1994), Kết bước ñầu nghiên cứu nuôi trứng thụ tinh in vitro trâu bò, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học 1994, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội: 166-168 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 68 Nguyễn Thị Ước (1996), Nghiên cứu gây rụng trứng nhiều gây ñộng rụng ñồng pha cấy phôi trâu bò, Luận án phó tiến sỹ khoa học nông nghiệp, 5-40 10 Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu ðức, Bùi Linh Chi, Hoàng Nghĩa Sơn, Bùi Xuân Nguyên (1999), Sản xuất phôi bò thụ tinh ống nghiệm, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, NXB khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 934-936 11 Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu ðức, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quảng Xuân Hữu, Nguyễn Thuỳ Anh, Hoàng Nghĩa Sơn, Dương ðình Long, Bùi Xuân Nguyên (2003), Nghiên cứu sản xuất giống bò sữa thương phẩm cấy phôi thụ tinh ống nghiệm xác ñịnh giới tính, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, NXB khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 717-719 TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI 12 Ali.A., BilodeauuJ.F., Sirard M.A., (2003), “Antioxidant requirements for bovine oocytes varies during in vitro maturation, fertilization and development”, Theriogenology 59 pp 939-949 13 Austin, C.R (1951), “Observations on the penetration of the sperm into the mammalian egg”, Australian Journal of Scientific Resreach 4, pp 581-596 14 Avery,B., Strobech,L., Jacobsen,T., Bogh,I.B and Greve, T (2003), “Invitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development”, Theriogenology 59, pp 987-999 15 Beker A.R.C.L., Colenbrander B., Bevers M.M.(2002), “Effect of 17βEstradiol on the in vitro maturation of bovine oocytes”, Theriogenology 58, pp 1666-1673 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 69 16 Bols, P.E.J Leroy, J.L.M.R., Vanholder, T and Van Som, A (2004), “A comparison of a chemical sector and linear array transducer for ultrasound-guided transvaginal oocyte retrieval (OPU) in cow”, Theriogenology 62, pp 906-914 17 Bui Xuan Nguyen., Heyman, Y and Renard, J P (1984), “Direct freezing of cattle embryos after partial dehydration at room temperature”, Theriogenology 22, pp 389-399 18 Bui Xuan Nguyen (1997), “Long term gamete and embryo preservation based on the asscociate treatments of partial dehydration and freezing Proceeding of International Worshop on Ultra-long- term cryogenic preservation network of biological and environmental specimens”, Senri Life Science Center, Osaka, Japan: 192-198 19 Brackett, R.G., Bousquet, D., Boice, M.L., Donawick, W.J., Evans, J.F and Drassel, M.A.(1982), “Normal development follwing in vitro fertilization in the cow”, Biology of Reproduction 27, pp 147-158 20 Callesen H., Greev T.nad Hyttel.P.(1987), “Premature ovulation in superovulation cattle”, Theriogenology 28, pp 155-156 21 Chang, M.C.(1951), “Fertilising capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tube”, Nature 168, pp 697-698 22 Chupin D and Procureur R.,(1982), “La Stimulation des I' ovaire pour produire embryos chez les bovins In: transplantation embryonaire " Ed Par I' Insttut Technique de l' elevage bovin, compte rendu des journees d' information ITEB-UNCWIA : 75-85 23 De Roover, R., Genicot, G., Leonard, S., Bols, P and Dessy, F (2005), Ovum pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol Animal Reproduction Science 86: 13 – 25 24 Fuhrer F., Mayr.B., Schelader,K., M and schlega.W (1989), “Maturation conpetence and chromatin behavior in growthing and full grow cattle oocytes”, Jounal of veterrinary 36 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 70 25 Fukui Y., Fukushima M and Ono H.(1983), “Fertilization in vitro of bovine oocytes after various sperm procedures”, Theriogenology 20, pp 651-660 26 Furuya, S., Endo, Y., Oda, M., Matsui, Y., Nozawa, S and Suzuki, S.(1992), “Protein phosphorlation regulates the mouse sperm acrosome reaction induced by the zona pellucia”, Journal of Assisted Reproduction and Genetics 9, pp 384-390 27 Galli C., Crotti G., Notari C., Turini P., Duchi R., Lazzani G.,(2001), “Embryo production by Ovum Pick Up from live donors”, Theriogenology 55, pp 1341-1357 28 Gomez E., Diez C.(2000), “Effects of glucose and protein sources on bovine embryo development in vitro”, Anim Reprod Sci 58, pp 23-37 29 Hasler J.F., Hurtgen, P.J., Jin Z.Q and Stokes, J,E., (1997), “Survival of IVF – derived bovine embryos frozen in glycerol or ethylene glycol”, Theriogenology 48, pp 563-579 30 Holm P., Booth P.J., Schmidt M.H., Greve T., Callesen H.(1999), “High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins”, Theriogenology 52, pp 683-700 31 Kajihara Y.,Roses G.,Lago I., Calvo J., Fila D and Crispo M.(1999), “Influence of culture medium on the development of bovine blastocysts”, Theriogenology, Vol 51, No.1, pp 239 32 Katska, L (1984), “Comparison of two methods for recovery of ovarian oocytes from slaughter cattle”, Animal Reproduction Scien , pp 461-463 33 Khurana N K., Niemann H (2000), “Effects of oocyte quality, oxygen tension, embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage and morula/blastocyst formation of bovine embryos”, Theriogenology 54, pp 741 - 756 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 71 34 Lazar L,J., Spak and V.David (2000), “The vitrification of in vitro fertilized cow blastocysts by the open pulled straw method” Therigenology 54,pp 571-578 35 Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.SS., Eyestone W.H., Northey D.L and First N.L.(1986), “Development potential of bovine oocytes matured in vitro”, Congress proceeding, p 342 36 Leibo S.P.,(1982), “A one - step method for direct nonsurgical transfer of frozen - thawed bovine embryos”, Theriogenology 21, pp 767 37 Lindner G,M and Wright R,W.,(1983), “Bovine embryo morphology and evaluatio, Theriogenology 20, pp 407-416 38 Loos, de F., Van Vliet,C., van Maurik, P and Kruip, T.A.M (1989), “Morphology of immature bovine oocytes”, Gamete Research 24, pp 197-204 39 Miyamoto.H., Ishibashi.T., (1987), “Protective action of glyceroles against freezing damage of mouse and embryos”, Journal of reproduction and fertility 54, pp 427-432 40 Newton C.R., Hansen P.J., and Low B.G.(1988), “Characterization of a high molecular weight Glycoprotein secreted the pre-implantation bovine conceptus”, Biology of Reproduction 39, pp 553-560 41 Niemann H and Nienhaus P.(1982), “Comparison of survial rate of day and bovine blastocysts after fast freezing and thawing” Theriogenology 18, pp 445-452 42 Pieterse MC., Kappen KA., Kruip ThAM., Taverne MAM.(1988), “Aspiration of bovine oocytes during transvagial ultrasound scanning of the ovaries”, Theriogenology 30, pp 751-761 43 Polge C., Wilmut I and Rowson L.E.A (1974), “The low temperature preservation of cow, sheep and pig embryos”, Cryobiology 11, pp 560 44 Reis , A., Steines, M.E., Watt, R.G., Dolman, D.F., McEvoy, T.G (2002), Embryo production using defined oocyte maturation and zygote culture media following repeated ovum pick-up (OPU) from FSH-stimulated Simmental heifers Animal Reproduction Science 72: 137-151 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 72 45 Renard, J.P., Ozil P and Heyman.Y (1982), “Crevical trans-fer of deep frozen cattle embryos”, Theriogenology 15 pp 311-320 46 Renard, J.P., Menez O.Y., saumande J and Heyman Y.(1987), “Attempts to predict the viability of cattle embryos produced by superovulation” In: control of reprod in the cow, Galmay, XX Ed, pp 398-417 47 Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P and Lonergan, P (2005), Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro Theriogenology 63: 939-949 48 Sang Runzi , Li Janguo, Wang Fengming, Zhao Yingjie, Lui Sujuan (1996), “Studies on improving survial and pregnancy rate of frozen bovine embryos”, 2nd Asian symposium on animal biotechnology, November, pp 11-14 49 Shioya Y., Kuwayama m., Fukushima M., Iwasaki S and Hanada A (1988), “In vivo fertilization and cleavage capability of bovine follicular oocytes classified by cumulus cells and matured in vitro” Theriogenology, Vol.13, No 3, pp 489-496 50 Seidel G.E (1983), “Field trains with cryopreserved bovine embryos” In: Beier H.M., Linder HR: Fertilization of the human egg vitro, pp 343-352 51 Trouson ,A.O., Woods,E and leeton, J (1982), “Freezing of embryos An ethicl obligation”, Med.J, Aust 2, pp 332-333 52 Viana, J.H.M., Camargo, L.S.A., Ferreira, A.M., de Sa., W.F., Fernandes, C.A.C., Junior, A.P.M (2004), Short intervals between ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but not prevent establishment of dominant follicles in the Gir breed (Bos indicus) of cattle Animal Reproduction Science 84: 1-12 53 Whittingham,D.G., Leibo S.P and Mazur.P (1972), “Survival of mouse embryos frozen to -196o C and -269o C”, Science 178, pp 411 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 73 54 Willadsen S.M (1980), “The viability of early clevage containing the normal number of blastomeres in the sheep”, J Reprod.Fert Vo 59, pp 357-362 55 Willet E.L., Black W.G., Casida L.E, Stone W.M and Buckner P.J (1951), “Successful transplantion of a fertilied bovine oum” 56 Wilmut.I and Rowson.L.E.A (1973), “Experiments on the lowtemperature preservation of cow embryos”, Vet Rec 92, pp 686 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 74 PHỤ LỤC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 75 MÔI TRƯỜNG CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DPBS Pha môi trường PBS(-) NaCl 8,0g KCL 0,2g Na2HPO4 1,15g KH2PO4 0,2g Nước cất 700ml Pha môi trường PBS(+) CaCl2 0,1g MgCl2.6H2O 0.1g Nước cất khử ion 200ml Sau ñã chuẩn bị xong, rót từ từ môi trường PBS (+) vào môi trường PBS (-) ñể tránh kết tủa Sau ñó bổ sung thêm 100ml nước cất khử ion ñể ñủ 1000ml Sau ñó bổ sung thêm 1,0g glucose 0,036g Natri pyruvate ñược mDBPS Sau ñó lọc seize bảo quản tủ lạnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 76 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG BO 2.1.Chuẩn bị môi trường BO gốc (BO= Brackett and Oliphan) Dung dịch A NaCl 4,3092g KCl 0,1974g CaCl2.2H2O 0,2171g NaH2PO4.2H2O 0,0840g MgCl2.6H2O 0,0697g Phenol Red (dung dich 0,5%) 0,1ml Nứơc khử ion Thêm ñủ 500ml Dung dịch B NaHCO3 2,5873g Phenol Red 0,5% 0,04ml Nước khử ion Thêm ñủ 200ml Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 77 2.2.Chuẩn bị môi trường BO Dung dịch A 76ml Na Pyruvate 0,01375g Penicilin 10.000UI Streptomycin 10mg Dung dịch B 24ml Sau chuẩn bị xong, lọc microfilter 2.3 Chuẩn bị môi trường hoạt hoá tinh trùng Dung dịch BO 50ml Na Caffein benzoate 0,1942g Heparin (Novo-heparin: 5000UI/ml) 50µl 2.4.Chuẩn bị dung dịch rửa tế bào trứng Dung dịch BO 40ml BSA 400mg 2.5 Dung dịch thụ tinh ống nghiệm Dung dịch BO 10ml BSA 200mg Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 78 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI PHÔI CR1aa Dung dịch A NaCl 6,7031g KCL 0,231g Na pyruvate 0,0440g NaHCO3 2,2011g Phenol Red 5% 2ml Nước cất khử ion Thêm ñủ 760ml Dung dịch B Hemicalcium lactate 0,5996g Nước cất khử ion Thêm ñủ 200ml Môi trường CR1aa Dung dịch A 76ml Dung dịch B 20ml BMEEssential Amino Acids 2ml MEM Non Essential Amino Acids 1ml L-glutamic Acid (2mg/ml) 1ml BSA 3mg/ml Penicillin-G 10.000UI (100UI/ml) Streptomycin Sulfate 10mg(100µg/ml) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 79 DỤNG CỤ HOÁ CHẤT - Các loại kính hiển vi soi : Kính hiển vi thao tác Niko TE 300; kính hiển vi soi Wild M3B; kính hiển vi soi Leica MZ6; kính hiển vi soi Olympus SD 30; kính hiển vi soi Olympus CH30 - Tủ nuôi cấy CO2 - Buồng vô trùng Labcaire - Cân phân tích Precisa - Máy li tâm Universal 32R - Bồn nước ổn nhiệt- Memer Waterbath - Máy ổn nhiệt Ht50 - Tủ sấy khô SL Shel lab - Tủ sấy ẩm Sanyo Incubator - Tủ sấy áp suất Tomy autoclave SS - 325 - Máy ñông lạnh CL-2000 - Buồng ñếm Thoma - Pippetteman cỡ - Các loại ñĩa petri - Pippete pasteur - Găng tay vô trùng, bơm tiêm 5ml, kim tiêm 18G, Microfilter 0,22µm - Các loại hoá chất chuyên dụng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 80 [...]... suất cao Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp……………… 1 Với mục ñích nâng cao hiệu quả của kỹ thuật TTON bằng tế bào trứng bò ñược khai thác từ con vật sống, tạo tiền ñề cho nghiên cứu sử dụng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng từ con vật sống ñể sản xuất phôi có chất lượng cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: Nghiên cứu thụ tinh ống nghiệm từ tế bào trứng trên. .. phôi bò bằng thụ tinh ống nghiệm và nghiên cứu sản xuất bò sữa giống thương phẩm bằng cấy phôi thụ tinh ống nghiệm và xác ñịnh giới tính (Nguyễn Thị Ước và cs (2003)[11]) Nguyễn Thị Ước (1996)[9] ñã nghiên cứu về sự chín nhân ở tế bào trứng trâu ñầm lầy nuôi trong ống nghiệm Bùi Xuân Nguyên và cộng sự (1994)[8] ñã báo cáo kết quả bước ñầu nghiên cứu nuôi trứng và thụ tinh ống nghiệm ở trâu bò Nguyễn Hữu... NGHIÊN CỨU - Thu tế bào trứng từ bò sữa cao sản với sự trợ giúp của máy siêu âm - Tạo phôi bằng phương pháp thụ tinh ống nghiệm - ðông lạnh phôi bằng phương pháp thuỷ tinh hoá (Vitrification) 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Thu tế bào trứng từ bò sống bằng máy siêu âm Là phương pháp thu tế bào trứng từ con vật sống với sự trự giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ở người Những bò. .. trứng, lớp tế bào vành phóng xạ của tế bào trứng cũng bị mất ñi một phần bởi tế bào hình trụ ống dẫn trứng bào mòn Sau khi thụ tinh (nhân tạo hay phối giống), tế bào tinh trùng tiến nhanh qua tử cung ñến 1/3 phía trên của ống dẫn trứng trong vòng 5-15 giờ tuỳ loài nhờ nhu ñộng của tử cung, ống dẫn trứng và hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng Quá trình thụ tinh xảy ra tốt nhất khi trứng và tinh trùng... giới, thụ tinh ống nghiệm ñã ñược nghiên cứu từ những năm ñầu của thế kỷ trước và con thỏ ñầu tiên ra ñời bằng kỹ thuật này vào năm 1959, em bé thụ tinh ống nghiệm ñầu tiên ra ñời năm 1978 ở Anh và con bê thụ tinh ống nghiệm ñầu tiên ra ñời năm 1981 tại Mỹ Thụ tinh ống nghiệm ñã ñược nghiên cứu trên gia súc từ ñầu những năm 1990 tại Việt Nam Nguyễn Thị Ước và cs (1999)[10] ñã báo cáo về sản xuất phôi bò. .. của trứng sau khi IVM và so sánh với hình thái của tế bào trứng thành thục in-vivo Các tác giả này kết luận rằng có một sự dao ñộng ñáng kể về hình thái giữa các tế bào trứng có khả năng phát triển bình thường Loại A (trứng tốt): Các lớp tế bào Cumulus chặt chẽ, tế bào ñông nhất, khối tế bào trứng – Cumulus (COC) sáng và trong suốt Loại B (loại tế bào trứng khá): Các lớp tế bào Cumulus chặt chẽ, tế bào. .. liên kết với nhau bằng những chỗ trống tiếp xúc và những chỗ trống tiếp xúc này cho phép các chất có phân tử lượng thấp ñi qua từ tế bào này sang tế bào khác Các tế bào Cumulus liên kết với các tế bào hạt, mà các tế bào hạt lại ñi kèm với các tế bào vỏ bên trong Như vậy, có khả năng các chất do tế bào hạt tạo ra sẽ ñi vào các tế bào nang trứng và sau ñó ñi vào tế bào trứng Trường ðại học Nông nghiệp... tế bào trứng; khối COC sáng và ít trong suốt Loại C ( tế bào trứng trung bình): Các lớp tế bào Cumulus ít chặt chẽ, trứng không ñều và có những ñám ñen, khối COC tối hơn loại A và B ở trên Loại D (tế bào trứng kém): Các lớp Cumulus giãn nở, tụ tập thành những ñám tối, trứng không ñều với những ñám tối, khối COC tối và không ñều 2.4 NUÔI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM Các trứng khai thác từ. .. in-vivo Nang trứng trước rụng trứng có thể coi là một cấu trúc mà ở ñó hàng triệu tế bào soma ñóng góp cho sự phát triển của tế bào sinh dục: tế bào trứng Trong nhiều năm người ta biết rằng tế bào trứng có quan hệ chặt chẽ với tế bào Cumulus Những tế bào Cumulus tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng có nguyên sinh chất kéo dài, xuyên qua màng trong suốt và kết thúc ở chỗ phồng ra gần với màng tế bào trứng Tầm... với các tế bào hạt bao quanh Những tế bào hạt bao quanh và tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng có khả năng phát triển ñược gọi là vành phóng xạ Khi rụng trứng xảy ra, nang trứng vỡ ñẩy dịch nang trứng, một số tế bào hạt và tế bào trứng có khả năng phát triển vào xoang cơ thể gần với chỗ mở ra của ống dẫn trứng Trong lúc giải phóng ra, tế bào trứng ñược bao quanh bởi vành phóng xạ và một khối tế bào hạt