4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.4NUÔI HỢP TỬ TRONG ỐNG NGHIỆM
Sau thời gian 5 giờ thụ tinh các hợp tử ñược chuyển sang môi trường nuôi cấy hợp tử. Các hợp tử ñược nuôi trong hai môi trường nuôi cấy là TCM -199 và CR1aa với các mật ñộ 15, 20, 25, 30 hợp tử/100µl trong 7 ngày. Sự phân chia của hợp tử ñược ñánh giá dựa vào sự phân chia tế bào 48 giờ sau thụ tinh. Sự phát triển của phôi ñược ñánh giá bằng kính hiển vi soi nổi ở ngày thứ 7 sau khi nuôi trong ống nghiệm dựa vào tỷ lệ phôi phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang. Chúng tôi tiến hành nuôi hợp tử thành 3 ñợt Kết quả nuôi hợp tử ñược trình bầy ở bảng 4.7
Bảng 4.7 Kết quả nuôi hợp tử trong ống nghiệm
Kết quả Chỉ tiêu theo dõi
ðợt 1 ðợt 2 ðợt 3 Chung
Số hợp tử giả ñịnh (n) 160 214 183 557
Số hợp tử phân chia sau 48 giờ nuôi (n) 74 115 97 286 Số hợp tử phát triển ñến giai ñoạn
phôi dâu, phôi nang (n) 42 68 52 162
Tỷ lệ phân chia (%) 46,25 53,74 53,01 51,35±0,86
Tỷ lệ phôi dâu, phôi nang (%) 26,25 31,78 28,42 29,08±1,22 Sử dụng 557 tế bào trứng ủ với tinh trùng, sau 48 giờ kiểm tra số hợp tử phân chia là 286 ñạt tỷ lệ phân chia là 51,35%. Sau 5 giờ thụ tinh có 282 tế bào trứng ñã ñược thụ tinh tuy nhiên có 286 hợp tử phân chia như vậy ñã có một số tế bào trứng ñã ñược thụ tinh nhưng xuất hiện thể cực thứ hai muộn hơn so với những tế bào trứng khác. Sau 7 ngày kiểm tra số lượng phôi dâu, phôi nang thu ñược là 162 ñạt tỷ lệ 29,08%.
Theo Nguyễn Hữu ðức (2004)[4], nuôi hợp tử trong môi trường B2 + tế bào Vero tỷ lệ phân chia ñạt 73,31%, sau 7 ngày nuôi cấy tỷ lệ phôi dâu ñạt
48,23% và 23,51% phôi nang. Khurana và Niemann (2000)[33] cũng có một kết quả tương tự về tỷ lệ phân chia và tỷ lệ phát triển tới giai ñoạn phôi dâu phôi nang tương ứng là 48,25% và 16,05%.
Tỷ lệ hợp tử phân chia (51,35%) của chúng tôi cao hơn kết quả ñã báo cáo (48,7% từ tế bào trứng bò cái và 45,7% từ trứng bò hậu bị) của Rizos và cs (2005)[47]. Tuy nhiên kết quả của chúng tôi thấp hơn kết quả phân chia của một số tác giả khác khi báo cáo sử dụng tế bào trứng thu từ bò sống. Theo Galli và cs (2001)[27] tỷ lệ hợp tử phân chia là 64,4%, theo Rizos và cs (2005)[47], Reis và cs(2002)[44] tỷ lệ này lần lượt là 80,8% và 81,1%. Tỷ lệ phôi dâu phôi nang thu ñược trong thí nghiệm của chúng tôi cao hơn tỷ lệ của Galli và cs (2001)[27] (29,08% so với 25,39%) nhưng thấp hơn của Rizos và cs (2005)[47] (46,5% phôi nang ở bò hậu bị và 33,3% phôi nang ở bò cái).
Kết quả nuôi cấy của chúng tôi cao hơn kết quả của Nguyễn Thị Ước và cs (1999)[10]. Theo Nguyễn Thị Ước, nuôi phôi 2 tế bào trong 6- 10 ngày tỷ lệ phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang ở bò vàng là 22,80% và ở bò Hà Ấn là 26,90%. Theo tác giả Nguyễn Văn Lý và cs (2003)[6], tỷ lệ phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu phôi nang ñạt 30,78%.
Ảnh hưởng của mật ñộ nuôi ñến sự phát triển của hợp tử
Chúng tôi nuôi hợp tử trong giọt nuôi với những mật ñộ khác nhau,
ñiều ñó ảnh hưởng ñến sự phân chia và phát triển của hợp tử nuôi trong ống
nghiệm. Ảnh hưởng của mật ñộ nuôi ñến sự phát triển của hợp tử ñược trình bày qua bảng 4.8 và biểu ñồ 4.3
Qua bảng 4.8 cho thấy: Nuôi theo nhóm 15 hợp tử cho tỷ lệ phân chia và tỷ lệ phát triển ñến phôi dâu, phôi nang là 30,77% và 13,46%; theo nhóm 20 là 59,38% và 35,62% còn theo nhóm 25, 30 lần lượt là 60%; 34,67% và 33,33%; 16,67%. Như vậy, nuôi theo nhóm 20 và 25 hợp tử/giọt nuôi có tỷ lệ phân chia và phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu phôi nang cao nhất. Không có sự khác nhau có ý nghĩa về tỷ lệ phân chia và phát triển ñến giai ñoạn phôi
dâu phôi nang giữa nhóm nuôi theo mật ñộ 20 hay 25 hợp tử/giọt nuôi (59,38%; 35,62% và 60%; 34,67%). Tuy nhiên khi nuôi hợp tử với mật ñộ 15 hay 30 thì tỷ lệ phân chia và tỷ lệ phát triển ñến giai ñoan phôi dâu, phôi nang giảm rõ rệt. Có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ phân chia và phát triển giữa nhóm 20, 25 hợp tử và nhóm 15, 30 hợp tử.
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của mật ñộ nuôi ñến sự phát triển của hợp tử
Hợp tử phân chia Hợp tử phát triển ñến phôi dâu, phôi nang Số lượng hợp tử / giọt nuôi Số lượng nuôi n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%) 15 52 16 30,77a± 1,22 7 13,46a± 1,14 20 160 95 59,38b± 0,59 57 35,62b± 1,34 25 225 135 60,00b±0,88 78 34,67 b± 1,62 30 120 40 33,33c± 1,48 20 16,67c±,07
Những chữ cái cùng cột khác nhau, các giá trị sai khác có ý nghĩa ở mức p <0,05
Nhiều tác giả ñã chứng minh rằng ở nhiều loài nuôi phôi trong thể tích môi trường giảm hay nuôi phôi theo nhóm ñã tăng sự phát triển của phôi ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang cũng như tăng số phôi bào và quan trọng hơn là ñã làm tăng khả năng sống của phôi sau khi cấy.
Khurana và Niemann (2000)[33] ñã nghiên cứu ảnh hưởng nuôi phôi loại I và II theo nhóm 20 và 40 phôi trong 0,5ml môi trường TCM -199, các tác giả nhận thấy rằng những hợp tử của tế bào trứng tốt nhất (loại I) không bị ảnh hưởng của số lượng phôi trên ñơn vị thể tích môi trường. Tỷ lệ phát triển
ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang của nhóm nuôi theo 20 là 36,5% và theo
nhóm 40 là 33,7%. Tuy nhiên tỷ lệ phát triển của phôi một tế bào trứng loại II tăng lên khi nuôi theo nhóm 40 thay vì nuôi theo nhóm 20 (22,7% và 13,6%) trong 0,5ml môi trường nhưng vẫn thấp hơn so với phôi của tế bào loại I. Số
lượng phôi tăng trên một ñơn vị thể tích thì nồng dộ các chất ức chế trong môi trường giảm tác ñộng lên mỗi phôi hay duy trì nồng ñộ một số chất nội bào cần thiết như axit amin ở mức ñộ chức năng. Cũng có thể tác dụng của mật ñộ phôi cao khi nuôi có thể là do một lượng lớn hơn tế bào Cumulus ñi cùng với phôi. Các tế bào này có thể tiết các chất dinh dưỡng nuôi phôi hay là loại bỏ các thành phần ức chế hay cả hai khỏi môi trường nuôi. Có thể số lượng tế bào Cumulus có mặt trong lúc nuôi 20 hợp tử của tế bào trứng loại I có ñủ ñiều kiện và giải ñộc môi trường vì vậy tăng số lượng thêm là không cần thiết.
30,77 59,38 60 59,38 60 33,33 16,67 34,67 35,62 13,46 0 10 20 30 40 50 60 70 15 TB 20 TB 25 TB 30 TB Mt ñ t bào trng T ỷ l ệ h ợ p t ử p h â n c h ia , p h á t tr i ể n (% ) Hợp tử phân chia Hợp tử phát triển Biểu ñồ 4.3. Kết quả phát triển của hợp tửở các mật ñộ nuôi
Chất lượng tế bào trứng nuôi thành thục, thụ tinh và nuôi trong ống nghiệm ñã có ảnh hưởng ñến kết quả phân chia và phát triển ñến phôi dâu, phôi nang. Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng ñến kết quả nuôi hợp tử ñược trình bầy qua bảng 4.9 và biểu ñồ 4.4
Bảng 4.9. Ảnh hưởng chất lượng tế bào trứng ñến sự phát triển của hợp tử
Số hợp tử phân chia Số hợp tử phát triển ñến phôi dâu, phôi nang Chất lượng tế bào trứng Số lượng tế bào Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Loại A 326 180 55,21a ± 0,25 108 33,13a± 1,73 Loại B 154 83 53,90a ± 1,46 42 27,28b ± 1,11 Loại C 77 23 29,87b ± 2,18 12 15,58c ± 0,79 Chung 557 286 51,35 ± 0,68 162 29,08±1,22 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Những chữ cái cùng cột khác nhau, các giá trị sai khác có ý nghĩa ở mức p <0,05
Khi nghiên cứu kết quả nuôi các loại tế bào trứng khác nhau ñến sự phát triển của hợp tử chúng tôi nhận thấy rằng: sau 48 giờ nuôi cấy tỷ lệ phân chia của nhóm tế bào trứng loại A, B và C lần lượt là: 55,21%; 53,90% và 29,87%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ phân chia giữa 2 nhóm chất lượng tế bào loại A và B, nhưng tỷ lệ phân chia của nhóm tế bào loại C giảm rõ rệt. Tuy nhiên sau 7 ngày nuôi cấy ñã có sự khác biệt về tỷ lệ hợp tử phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang giữa 3 nhóm chất lượng tế bào trứng. Tế bào trứng loại A có tỷ lệ phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang cao nhất ñạt 33,13%, tiếp ñến là tế bào trứng loại B ñạt 27,28% và thấp nhất là tế bào trứng loại C (15,58%).
Tỷ lệ phân chia ở nhóm tế bào trứng loại A của chúng tôi thấp hơn kết quả của Nguyễn Hữu ðức (2004)[4] nhưng ở nhóm tế bào loại B và C của chúng tôi cho kết quả cao hơn (55,21%; 53,90% và 29,87% so với 71,43%; 27,78% và 5,64%). Tuy nhiên tỷ lệ phát triển ñến phôi dâu, phôi nang giữa nhóm tế bào loại A của chúng tôi thấp hơn còn nhóm tế bào loại B và C lại
cao hơn kết quả của tác giả ở các nhóm tế bào tương ứng (33,13%; 27,28% và 15,58% so với 40,89%; 5,09% và 0%). Cũng theo tác giả tỷ lệ phôi phân chia cũng như phát triển ñến phôi dâu, phôi nang ñối với nhóm tế bào trứng loại A luôn cao hơn rõ rệt. Theo kết quả của Nguyễn Văn Lý (2006)[7] tỷ lệ phân chia của các nhóm tế bào trứng loại A, B, C lần lượt là 69,81%; 64,70% và 22,49% ñồng thời không có sự khác biệt về tỷ lệ phân chia giữa nhóm tế bào loại Avà B. Và tỷ lệ phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang ở các nhóm tế bào loại A, B, C lần lượt là 43,74%; 35,80%; 7,04%.
Kết quả của chúng tôi tương ñương với kết quả của Shioya và cs (1988)[49] ñã báo cáo, theo tác giả này tỷ lệ phân chia ñối với tế bào trứng loại A và B dao ñộng từ 29,5% ñến 63,7% và của tế bào trứng loại C là 17,7%. Tuy nhiên kết quả tỷ lệ phân chia tế bào của chúng tôi thấp hơn kết quả của Khurana và Niemann (2000)[33] ñã báo cáo. Theo các tác giả này tỷ lệ phân chia của tế bào trứng loại I, II, III và IV tương ứng là 61,4%; 52,0%; 26,0% và 12,1%. Tỷ lệ phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang của tế bào loại I, II, III và IV tương ứng là 33,9%; 13,1%; 0% và 0%. Kết quả này cho thấy tế bào trứng loại III và IV ñã không thể phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang. Như vậy ñể nâng cao hiệu quả của việc sản xuất phôi trong ống nghiệm cần phải sử dụng những loại trứng có chất lượng tốt và nâng cao tỷ lệ phát triển của tế bào trứng có chất lượng kém.
Loos và cs (1989)[38] ñã phân chia tế bào trứng thu ñược thành 4 loại, trong ñó loại III và IV gồm những tế bào trứng có dấu hiệu thoái hoá. Các tác giả này ñã kết luận rằng mặc dù có sự dao ñộng lớn về hình thái của tế bào trứng nhưng chỉ những tế bào trứng có dấu hiệu thoái hoá rõ ràng mới chứng tỏ giảm khả năng thành thục trong ống nghiệm. Hơn nữa các tác giả này cũng nhận thấy rằng nhiều tế bào trứng có dấu hiệu giãn nở tế bào Cumulus cũng ñã thành thục khi nuôi.
Sự phát triển của hợp tử trong môi trường TCM-199 và CR1aa
Chúng tôi tiến hành nuôi hợp tử trong hai môi trường nuôi cấy là TCM- 199 và CR1aa. Kết quả nuôi cấy hợp tử trong từng môi trường ñược trình bày qua bảng 4.10 và biểu ñồ 4.5.
Qua thời gian nuôi cấy chúng tôi thấy rằng môi trường nuôi cấy ảnh hưởng ñến sự phát triển của hợp tử
Thụ tinh 332 tế bào và ñem nuôi trong môi trường CR1aa có 174 tế bào phân chia sau 48 giờ ñạt tỷ lệ 52,41%, sau 7 ngày nuôi cấy số lượng tế bào phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang là 108 ñạt tỷ lệ 32,23%. Trong môi trường TCM-199, nuôi 225 tế bào có 122 tế bào ñã phân chia ñạt tỷ lệ 49,78% và có 55 tế bào phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang ñạt tỷ lệ 24,44%.
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát triển của hợp tử
Số hợp tử ñã phân chia
Số hợp tử phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu,
phôi nang Môi trường Số tế bào trứng ñưa vào thụ tinh - nuôi cấy n (%) n (%) CR1aa 332 174 52,41a ± 1,08 108 32,23a ± 0,90 TCM-199 225 122 49,78b ±1,33 55 24,44b ± 1,42 Chung 557 286 51,35± 0,86 162 29,08 ± 1,22
Những chữ cái cùng cột khác nhau, các giá trị sai khác có ý nghĩa ở mức p <0,05
Kết quả của chúng tôi cao hơn kết quả của Nguyễn Văn Lý (2006)[7], theo tác giả tỷ lệ phân chia và phát triển ñến phôi dâu, phôi nang khi nuôi trong môi trường TCM-199 lần lượt là 44,44% và 26,94% còn nuôi trong môi trường CR1aa là 54,54% và 31,66%.
Tỷ lệ hợp tử phân chia và phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang của chúng tôi thấp hơn của Nguyễn Hữu ðức (2004)[4], theo tác giả này tỷ lệ phân chia và phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang khi nuôi trong môi trường
TCM-199 lần lượt là 67,91%; 28,35% còn trong môi trường M-199 + tế bào Cumulus là 69,20%; 39,75% (phôi dâu) và 8,93% (phôi nang). Khurana và Niemann (2000)[33] ñã sử dụng môi trường M-199 có bổ sung 20% huyết thanh bò ñộng dục ñể làm môi trường nuôi. Tỷ lệ phân chia của các tác giả này là 61,50%, tuy nhiên tỷ lệ phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang là 26,70%.
Khi so sánh tỷ lệ phân chia và tỷ lệ phát triển ñến phôi dâu, phôi nang khi nuôi trong môi trường CR1aa và TCM-199 chúng tôi thấy rằng có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ phân chia cũng như phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang. Tỷ lệ tế bào phân chia và phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang khi nuôi trong môi trường CR1aa cao hơn khi nuôi trong môi trường TCM-199 (52,41% và 32,23% so với 49,78% và 24,44%).
Kajihara và cs (1999)[31] ñã nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của môi trường TCM-199 và môi trường CR1aa ñến sự phát triển của phôi trong ống nghiệm, các tác giả này ñã nhận thấy rằng không có sự khác biệt về tỷ lệ phân chia sau 48 giờ tuy nhiên tỷ lệ phôi dâu, phôi nang trong môi trường CR1aa cao hơn so với môi trường TCM-199. Từ các nghiên cứu trên của các tác giả, nhìn chung không có sự khác biệt về tỷ lệ phân chia khi nuôi hợp tử trong môi trường TCM-199 có bổ sung thêm huyết thanh và môi trường CR1aa, tuy nhiên sau 7 ngày nuôi cấy tỷ lệ hợp tử phát triển ñến giai ñoạn phôi dâu, phôi nang trong môi trường CR1aa cao hơn trong môi trường TCM-199.
Ngoài ra trong qui trình thụ tinh ống nghiệm, sự phân chia và phát triển của hợp tử còn chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố khác như chất lương ñực giống, thời gian tiến hành thụ tinh, phương pháp xử lý tinh trùng… Tuỳ vào ñiều kiện cụ thể của phòng thí nghiệm, của thực tế mà lựa chọn các cách thức tiến hành thụ tinh nhằm mục ñích cuối cùng là nâng cao tỷ lệ phát triển ñến giai ñoan phôi dâu, phôi nang.
55,21 53,9 53,9 29,87 33,13 27,28 15,58 0 10 20 30 40 50 60 A B C Cht lng t bào trng T ỷ l ệ h ợ p t ử p h â n c h ia , p h á t tr i ể n ( % ) Hợp tử phân chia Hợp tử phát triển
Biểu ñồ 4.4. Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng
ñến sự phát triển của hợp tử 52,41 49,78 32,23 24,44 0 10 20 30 40 50 60 CR1aa TCM-199 Môi tr ng nuôi cy T ỷ l ệ h ợ p t ử p h â n c h ia , p h á