Phôi chỉ sống sót khi người ta bổ sung một dung môi hữu cơ hay còn gọi là chất bảo vệ sinh học lạnh vào môi trường huyền phù ñể ñông lạnh. Các chất thường ñược sử dụng là: glycerol, dimethysufoxide (DMSO) và một số glycol (ethylen glycol, propylen glycol…) trong ñó glycol là chất bảo vệ sinh học lạnh ñược sử dụng phổ biến trên nhiều loài ñộng vật và có hiệu quả cao nhất. - Glycerol có phân tử lượng 92, có ñộc tính nhẹ, có tác dụng như một chất chống ñông, có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hoà tan trong nước và cồn. Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế bào làm cho tế bào không bị giảm dung tích. ðể phôi có thể cân bằng với glycerol, người ta chuyển phôi vào dung dịch PBS có nồng ñộ glycerol tăng dần trong một khoảng thời gian nhất ñịnh ñể thực hiện rút nước nội bào và thay thế bằng glycerol. ðiều quan trọng nhất là thời gian và nồng ñộ thích hợp ñể ngâm phôi, ñiều này phụ thuộc vào phôi của mỗi loài ñộng vật và trạng thái phát triển của phôi.
- Ethylene glycol, có phân tử lượng thấp hơn (62,07), chất này tương tự như glycerol nhưng thời gian ngâm phôi bò ngắn hơn. Ưu ñiểm của việc dùng ethylene glycol trong ñông lạnh phôi bò là khi giải ñông không cần rút chất này ra khỏi phôi theo các bước mà nó tự thẩm xuất ra khỏi tế bào, vì vậy người ta có thể cấy phôi ngay ñược. ðiều cần lưu ý là Ethylene glycol rất ñộc cho phôi do ñó phải thận trọng khi sử dụng.
- Dimethylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh có phân tử lượng thấp (78,13). Chất này ñầu tiên ñược Wilmut và Rowson (1973)[56] sử dụng ñể ñông lạnh phôi bò. Tuy nhiên, nhiều tác giả nhận thấy rằng, có sự khác nhau về khả năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phôi của các loài và ñối với phôi bò thì glycerol có khả năng thẩm thấu tốt hơn DMSO. Vì thế ñến cuối những năm 1970, glycerol ñược dùng nhiều hơn DMSO trong việc ñông lạnh phôi bò.
ðường (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic acid) cũng ñược dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường ñược dùng với các chất bảo vệ lạnh khác. Các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể sử dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh như dimethy sulphoside, acetamide, propylen glycol, glycerol, ethylene glycol, polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng ñộ khác nhau ñể ñông lạnh phôi ñộng vật có vú.
Theo Bui Xuan Nguyen (1997)[18], việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả năng sống của phôi ñông lạnh có sự khác nhau giữa các loài. ðối với thỏ, khả năng sống của phôi ñông lạnh trong hỗn hợp sucrose và glyceorol hay DMSO là rất thấp (0-5%) so với ñông lạnh bằng propaneol (92%). ðối với phôi dâu - phôi nang bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0%). Trong khi ñó phôi bò ñược ñông lạnh trong hỗn hợp bảo vệ lạnh sucrose-propaneol-glycerol có tỷ lệ sống cao hơn so với hỗn hợp sucrose-propaneol (65% so với 0%). Sự khác biệt về khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác nhau vẫn chưa ñược làm rõ.