4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3 THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TẾ BÀO TRỨNG BÒ
Thụ tinh ống nghiệm ñược thực hiện trong giọt 100µl môi trường thụ tinh BO
Sau khi ñược nuôi thành thục trong ống nghiệm, 20 tế bào trứng ñược chuyển vào 100µl môi trường thụ tinh BO có mật ñộ tinh trùng 6,25 x 106 tinh
trùng/ml trong ñĩa petri có phủ dầu khoáng vô trùng và ñược ñặt vào tủ nuôi ở nhiệt ñộ 38,5oC trong thời gian 5 giờ, duy trì chế ñộ khí 5% CO2 và ñộ ẩm tối ña. Tế bào trứng sau khi ủ 5 giờ trong môi trường thụ tinh cùng với tinh trùng ñược tách khối tế bào Cumulus bằng cách hút nhiều lần qua ống thuỷ tinh vô trùng. Chúng tôi kiểm tra sự thụ tinh bằng cách tìm thấy thể cực thứ hai (tạo thành hợp tử). Kết quả thụ tinh ống nghiệm ñược trình bầy qua bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả thụ tinh ống nghiệm trứng bò
ðợt thí nghiệm
Số tế bào ñem nuôi (n)
Số tế bào trứng sau 5 giờ thụ tinh tạo thành hợp tử (n) Tỷ lệ thụ tinh (%) 1 160 73 45,63 2 214 113 52,80 3 183 96 52,46 Chung 557 282 50,70 ± 1,45
Sau khi kiểm tra sự thành thục của tế bào trứng, những tế bào trứng ñã ñược kiểm tra không sử dụng ñể thụ tinh ống nghiệm do vậy chỉ còn 557 tế bào trứng cho thụ tinh. Sau 5 giờ ủ với tinh trùng, trong tổng số 557 tế bào trứng có 282 tế bào trứng ñã ñược thụ tinh (xuất hiện thể cực thứ 2) ñạt tỷ lệ 50,70%.
Kết quả của chúng tôi thấp hơn kết quả của Nguyễn Hữu ðức và cs (2003)[3], tác giả ñã dựa vào tỷ lệ phân chia ñể ñánh giá kết quả thụ tinh và kết quả thụ tinh ống nghiệm ở bò lai Sind ñạt 72,96%. Kết quả thụ tinh ống nghiệm của chúng tôi thấp hơn kết quả của Nguyễn Thị Ước và cs (1999)[10] ñã báo cáo trên bò vàng và trên bò Hà Ấn (50,70% so với 60,90% và 54,70%). Theo báo cáo của tác giả Nguyễn Văn Lý và cs (2003[6]), tỷ lệ thụ tinh ống nghiệm ở bò 54,14%.
Theo kết quả nghiên cứu của Khurana và Niemann (2000)[33], tỷ lệ thụ tinh ống nghiệm ñạt 66,22% trong ñó có 12,97% thụ tinh bất bình thường.
Còn theo kết quả của Avery và cs (2003)[14] tỷ lệ thụ tinh bình thường là 56,11%, tuy nhiên tác giả này chỉ sử dụng tế bào trứng loại A, B ñể nuôi cấy và thụ tinh.
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành thụ tinh với tinh trùng ở nồng ñộ 6,25 x 106/ml, theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu ðức (2004)[4] khi thụ tinh ở nồng ñộ 0,25 ñến 0,5 triệu/ml thì tỷ lệ thụ tinh là rất thấp (20,25% và 45,73%) còn khi tăng nồng ñộ tinh trùng bằng hoặc lớn hơn 1triệu/ml thì tỷ lệ thụ tinh tăng lên ñáng kể (69,31% - 72,38%). Theo một số nghiên cứu cho biết thời gian thụ tinh khác nhau sẽ cho tỷ lệ thụ tinh khác nhau, theo tác giả Nguyễn Hữu ðức (2004)[4]: Thời gian thích hợp cho quá trình thụ tinh ống nghiệm có thể từ 24-26 giờ với kết quả thụ tinh ống nghiệm thể hiện qua số phôi phân chia ñạt khoảng 68-70%
Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng ñến tỷ lệ thụ tinh
Thụ tinh ống nghiệm là một quy trình ñòi hỏi có nhiều bước và nhiều yếu tố tác ñộng do vậy kết quả thụ tinh ống nghiệm cũng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố trong ñó chất lượng tế bào trứng có ảnh hưởng trực tiếp. Kết quả ñược chúng tôi trình bày ở bảng 4.6 và biểu ñồ 4.2.
Qua bảng 4.6 cho thấy tiến hành thụ tinh 326 tế bào trứng loại A sau 5 giờ có 177 tế bào ñã ñược thụ tinh ñạt tỷ lệ 54,29%, thụ tinh 154 tế bào trứng loại B có 82 tế bào ñã ñược thụ tinh ñạt 53,25% và tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng loại C ñạt 29,87%. Như vậy không có sự sai khác có ý nghĩa về tỷ lệ thụ tinh giữa tế bào trứng loại A và B nhưng tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng loại C giảm rõ rệt và sự khác biệt này là có ý nghĩa.
Kết quả thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng loại A và B của chúng tôi thấp hơn của tác giả Nguyễn Văn Lý (2006)[7] nhưng tỷ lệ thụ tinh tế bào loại C lại cao hơn (54,29%; 53,25% và 29,87% so với 69,00%; 64,39% và 22,22%) Cũng theo tác giả này tỷ lệ thụ tinh cao nhất ñạt ñược ở những tế bào trứng ñược thu từ nang trứng có ñường kính > 5-8mm (66,89%)
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng tới kết quả thụ tinh trong ống nghiệm
Chất lượng tế bào trứng Số lượng tế bào trứng ñưa vào thụ tinh (n) Số lượng tế bào trứng ñã thụ tinh (n) Tỷ lệ thụ tinh (%) Loại A 326 177 54,29a Loại B 154 82 53,25a Loại C 77 23 29,87b Chung 557 282 50,70 ± 1,45
Những chữ cái cùng cột khác nhau, các giá trị sai khác có ý nghĩa ở mức p <0,05
Kết quả thụ tinh ống nghiệm của các tế bào trứng có chất lượng khác nhau trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với kết quả của Khurana và Niemann (2000)[33], tỷ lệ thụ tinh bình thường của tế bào trứng loại I, II, III và IV tương ứng là 67,10%; 63,70%; 44,60% và 16,30%. Theo các tác giả trên không có sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh giữa tế bào trứng loại I và II, song có sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh giữa tế bào nhóm I, II và III, IV.
Kết quả thụ tinh trứng loại A của chúng tôi thấp hơn kết quả thụ tinh của Nguyễn Hữu ðức và cs (2004)[4] (54,29% so với 71,09%) tuy nhiên theo tác giả này có sự sai khác về tỷ lệ thụ tinh giữa trứng loại A và loại B (71,09% so với 48,98%). Tác giả này ñánh giá kết quả thụ tinh thông qua số phôi phân chia ở giai ñoạn 2-4 tế bào sau 48 giờ nuôi trong tủ ấm.
Tỷ lệ thụ tinh phụ thuộc nhiều vào chất lượng tế bào trứng trong ñó sử dụng những tế bào trứng loại A, B (I, II) cho tỷ lệ thụ tinh cao hơn hẳn khi sử dụng tế bào trứng loại C (III, IV). Các trứng có chất lượng C ñã ñi vào chiều hướng thoái hoá từ trong buồng trứng nên khi nuôi chúng trong môi trường TCM-199 chúng vẫn không thể hồi phục và phát triển trở lại. Các trứng có
chất lượng A và B sau khi nuôi thành thục sẽ ñược ñưa vào môi trường thụ tinh bên trong chứa sẵn những tinh trùng có chất lượng tốt. Kết quả thụ tinh ống nghiệm và sau ñó phân chia ở giai ñoạn hai tế bào của tác giả Shioya và cs (1988)[49] thu ñược như sau: ñối với lô trứng có chất lượng A và B tỷ lệ thụ tinh ñạt 71,40% ñến 87,90%; tỷ lệ phân chia ở giai ñoạn hai tế bào ñạt 29,50%-63,70%. ðối với những trứng chất lượng loại C thì kết quả thụ tinh ống nghiệm chỉ ñạt 29,20% và tỷ lệ phân chia chỉ ñạt 17,70%.
Ngoài ra tỷ lệ thụ tinh còn phụ thuộc vào rất nhiều nguyên nhân trong ñó phải kể ñến các nguyên nhân quan trọng như chất lượng tinh trùng, kỹ thuật bảo quản tinh trùng, kỹ thuật hoạt hoá tinh trùng, xác ñịnh mật ñộ tinh trùng, thao tác nuôi cấy trong quá trình thụ tinh, ñường kính của nang trứng, thời gian thụ tinh… Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm. Hai phương pháp ñược dùng phổ biến cho mục ñích trên trong thụ tinh ống nghiệm là phương pháp lọc qua phân lớp percoll và phương pháp bơi ngược. Hiệu quả thụ tinh ống nghiệm của tinh trùng sau khi xử lý bằng hai phương pháp này là không khác nhau. Kỹ thuật hoạt hoá và kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng rất phức tạp ñòi hỏi ñộ chính xác cao từ khâu giải ñông, pha loãng tinh trùng, ly tâm tinh trùng… Nếu một trong những khâu trên làm chưa tốt sẽ dẫn ñến hiện tượng số lượng tinh trùng chết tăng lên làm cho chất lượng tinh trùng giảm ñi rõ rệt. Thụ tinh trong ống nghiệm với mật ñộ tinh trùng 6,25 x 106ml. Nếu xác ñịnh sai mật ñộ sẽ ảnh hưởng ñến kết quả thụ tinh. Mật ñộ quá ít thì không ñủ số lượng ñể thụ tinh, ngược lại mật ñộ tinh trùng quá nhiều sẽ dẫn ñến hiện tượng ña tinh trùng. Ngoài ra khâu bảo quản tinh trùng và pha chế môi trường cũng ảnh hưởng ñến tỷ lệ thụ tinh. Bảo quản tinh trùng không ñúng sẽ làm giảm chất lượng tinh trùng. Môi trường thụ tinh không ñảm bảo sẽ ngăn trở sự thụ tinh. Tất cả các nguyên nhân trên ñều trực tiếp ảnh hưởng ñến kết quả và tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng trong thụ tinh ống nghiệm.
54,29 53,25 29,87 29,87 0 10 20 30 40 50 60 A B C Cht lng t bào trng T ỷ l ệ t h ụ t in h ( % ) Biểu ñồ 4.2. Tỷ lệ thụ tinh của các loại tế bào trứng
Hình 4.7. Tế bào trứng ñược ủ với tinh trùng
Hình 4.8. Tế bào trứng ñã ñược thụ tinh (xuất hiện thể cực thứ 2)