THU TẾ BÀO TRỨNG TỪ BÒ SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1THU TẾ BÀO TRỨNG TỪ BÒ SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM

SIÊU ÂM

Phương pháp thu tế bào trứng từ bò sống với sự trợ giúp của máy siêu âm (OPU) cho phép thu các tế bào trứng từ con vật ñang sống. Con vật ñưa vào khai thác ñược cố ñịnh . Khi sử dụng máy siêu âm hút trứng, hình ảnh lần lượt hiện ra trên màn hình siêu âm giúp biết chính xác hướng ñi của kim, vị trí nang trứng và vị trí ñầu kim chọc vào nang. Sử dụng kim cỡ 16G dài 55cm với góc vát của ñầu kim dao ñộng 25o - 45o; áp suất nối ñến kim ñược ñiều chỉnh 120mmHg (tốc ñộ dòng chảy 25ml/phút. Sau khi chọc hút 2-4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng ñể tế bào trứng chảy vào ống falcon, tiến hành hút lặp lại ñến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào nữa thì chuyển sang buồng trứng ñối diện. Dịch nang trứng ñược thu vào ống tube falcon 50ml, ñược giữ ấm trong máy ổn nhiệt và chuyển về phòng thí nghiệm. Kết quả thu tế bào trứng ñược trình bày ở bảng 4.1

Tiến hành thí nghiệm trên 210 lượt buồng trứng: tổng số nang trứng có

ñường kính ≤ 8mm quan sát ñược là 1120; tổng số tế bào trứng thu ñược là

796 ñạt tỷ lệ 71,20% và số tế bào trứng trung bình thu ñược từ mỗi buồng trứng là 3,80.

Số nang trứng trung bình/buồng trứng trong thí nghiệm của chúng tôi thấp hơn so với kết quả trong báo cáo của Rizos và cs (2005)[47] là 10,4 và 7,8 nang trứng/buồng trứng (ở bò hậu bị và bò cái sau ñẻ). Tuy nhiên số tế bào trứng trung bình/buồng trứng trong thí nghiệm của chúng tôi không sai khác nhiều so với kết quả của tác giả này ở bò hậu bị và bò ñẻ (3,80 so với 4,7 và 2,8). Chính vì vậy mà tỷ lệ thu tế bào trứng của chúng tôi cao hơn so với tỷ lệ thu tế bào trứng mà tác giả ñã báo cáo: 71,20% so với 45,4% và 36,0%.

So với một số tác giả khác thì kết quả thu của chúng tôi thấp hơn: theo De Roover và cs (2005)[23] số lượng nang trứng trung bình ñược chọc hút và số tế bào trung bình thu ñược ở mỗi lần siêu âm là 11,9 nang và 5,6 tế bào.Theo tác giả Reis và cs (2002) [44] sử dụng phương pháp siêu âm hút trứng lặp lại 8 lần trong tổng số 3234 nang trứng và thu ñược 1242 tế bào trứng (38,4%). Trung bình thu ñược 7,2 tế bào trứng/bò/lần siêu âm thứ nhất và 5,7 tế bào trứng/bò/lần siêu âm lặp lại.

Bảng 4.1. Kết quả thu tế bào trứng từ bò sống bằng kỹ thuật siêu âm

Chỉ tiêu Kết quả

Số lượt buồng trứng (n) 210

Số nang trứng có ñường kính ≤ 8mm (n) 1120

Số nang trứng trung bình/buồng trứng (Xtb) 5,25 ± 1,28

Tổng số tế bào trứng thu ñược (n) 796

Tỷ lệ tế bào trứng thu ñược (%) 71,20 ±1,43

Số tế bào trứng thu ñược /buồng trứng (Xtb) 3,80 ±2,1 Khi sử dụng 2 quy trình siêu âm hút trứng là quy trình siêu âm 1lần/tuần và 2 lần/tuần, tác giả Viana và cs (2004)[52] ñã thu ñược kết quả như sau: số lượng tế bào trứng thu ñược ở quy trình siêu âm 1 lần/tuần là 8,9 tế bào lớn hơn ở quy trình siêu âm 2 lần/tuần là 7,0 tế bào như vậy tỷ lệ thu tế bào trứng ở quy trình thứ nhất là lớn hơn ở quy trình thứ hai (74,3% so với 59,0%). Như vậy ở quy trình siêu âm 1lần/tuần tỷ lệ thu tế bào trứng của các tác giả là cao hơn của chúng tôi (74,3% so với 71,2%) nhưng ở quy trình siêu âm 2 lần/tuần thì tỷ lệ thu tế bào trứng của các tác giả lại cho kết quả thấp hơn của chúng tôi (59,0% so với 71,2%).

Khi tiến hành thu tế bào bằng kỹ thuật siêu âm sử dụng quy trình 1lần/tuần, tỷ lệ tế bào trứng thu ñược và tế bào trứng thu ñược/buồng trứng của chúng tôi cho kết quả thấp hơn của các tác giả khác khi thu tế bào trứng bò từ lò mổ. Theo tác giả Nguyễn Văn Lý và cs (2006)[7]: số tế bào trứng trung bình thu ñược từ buồng trứng là 14,92 tế bào, tỷ lệ tế bào trứng thu ñược là 82,38%. Theo Nguyễn Thị Ước và cs (1999)[10] số tế bào trứng trung bình thu ñược từ buồng trứng mà các tác giả thu ñược trên bò Hà Ấn là 14,0 tế bào. Tuy nhiên khi sử dụng kỹ thuật này chúng tôi có thể áp dụng cho tất cả các giai ñoạn tuổi từ những con bê 2 tháng tuổi ñến những con bò già thời gian khai thác là rất lâu do vậy tổng số tế bào trứng khai thác từ một bò cho trứng sẽ cao hơn nhiều khi thu từ lò mổ. Và một ưu ñiểm nữa là chúng ta có thể biết rõ nguồn gốc cũng như tiềm năng di truyền của bò cho trứng.

Sau khi thu, tế bào và dung dịch thu tế bào trứng ñược ñưa về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcon có ñường kính lỗ lọc 20µm, và ñược chuyển vào ñĩa petri vô trùng có ñường kính 90mm ñể soi tìm tế bào trứng. Chúng tôi tìm và rửa sạch tế bào trứng ít nhất 8 lần trong các ñĩa petri vô trùng có chứa DPBS bổ sung 3% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000UI Pennicillin và 100µg Streptomycin/ml). Việc tìm và làm sạch tế bào trứng ñược thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi.

Phân loại tế bào trứng thu ñược

Tế bào trứng thu ñược ñược ñánh giá phân loại dưới kính hiển vi soi nổi theo phương pháp của Loos và cs (1989)[38] dựa trên ñặc ñiểm hình thái của tế bào Cumulus bao quanh tế bào trứng. Kết quả ñánh giá phân loại tế bào trứng ñược trình bầy ở bảng 4.2.

Bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt về tỷ lệ các loại tế bào trứng thu ñược. Tế bào trứng có chất lượng loại A thu ñược là cao nhất chiếm tỷ lệ 48,24% (384/796), tiếp ñến là tế bào trứng loại B và C (tương ứng là 26,88%

và 14,82%) và tỷ lệ tế bào trứng loại D thu ñược là thấp nhất ñạt 10,05%. Như vậy tỷ lệ tế bào trứng có thể nuôi cấy là 89,95%.

Bảng 4.2. Kết quả phân loại tế bào trứng thu ñược bằng phương pháp siêu âm

Tế bào trứng thu ñược Chất lượng tế bào Số lượng (n ) Tỷ lệ (% ) Loại A 384 48,24a Loại B 214 26,88 b Loại C 118 14,82c Loại D 80 10,05d Tổng số tế bào có thể nuôi cấy (A, B, C)

716 89,95

Tổng 796 100

Những chữ cái cùng cột khác nhau, các giá trị sai khác có ý nghĩa ở mức p <0,05

Theo Katska (1984)[32] ñã thông báo tỷ lệ thu tế bào trứng từ buồng trứng từ lò mổ ñạt 69,32% thấp hơn so với kết quả của chúng tôi (71,2%), tỷ lệ tế bào trứng loại A thu ñược của chúng tôi tương ñương với tỷ lệ tế bào trứng loại I của Katska (43%). Tuy nhiên tế bào trứng loại I thu bằng phương pháp giải phẫu nang trứng của Katska cao hơn kết quả của chúng tôi (63,20% so với 48,24%).

Tỷ lệ tế bào trứng loại A và B của chúng tôi cao hơn tỷ lệ tế bào trứng loại I và II của các tác giả Viana và cs (2004)[52] khi sử dụng quy trình siêu âm mỗi tuần 1lần (75,12% so với 29,0%) và 2 lần một tuần (75,12% so với 35%). Kết quả của chúng tôi cao hơn so với kết quả của Reis và cs (2002)[44]

ñã báo cáo, theo tác giả này tỷ lệ tế bào trứng loại I và II thu ñược ở lần siêu âm 1 và 2 tương ứng là 54,9% và 46,8%.

Hình 4.1.Tế bào trứng loại A Hình 4.2. Tế bào trứng loại B

Hình 4.3.Tế bào trứng loại C Hình 4.4. Tế bào trứng loại D 4.2 NUÔI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Các tế bào trứng sau khi ñược ñánh giá và phân loại không phải tất cả các tế bào trứng ñều ñược dùng ñể nuôi cấy mà chỉ những tế bào ñủ tiêu chuẩn (A, B, C) mới ñược ñem nuôi cấy trong ống nghiệm. Nuôi tế bào trứng ñược tiến hành trong giọt 100µl môi trường M-199 có bổ sung 5% huyết thanh bê mới sinh và kháng sinh với mật ñộ 20 tế bào/100µl trong ñĩa petri. ðĩa nuôi ñược phủ dầu khoáng vô trùng và duy trì ở nhiệt ñộ 38,5oC trong

ñiều kiện 5% CO2, ẩm ñộ tối ña. Sau khi nuôi cấy 20-24 giờ, kiểm tra sự thành thục của tế bào trứng dựa vào sự xuất hiện của thể cực thứ nhất và sự giãn nở của khối tế bào Cumulus. Những tế bào trứng sau khi nuôi thành thục sẽ ñược tách tế bào Cumulus ñể kiểm tra sự thành thục. Các tế bào này sau ñó sẽ không ñưa vào thụ tinh. Chúng tôi tiến hành 3 ñợt thí nghiệm nuôi thành thục tế bào trứng. Kết quả nuôi tế bào trứng ñược trình bày qua bảng 4.3

Bảng 4.3. Kết quả nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm

ðợt thí nghiệm

Số tế bào trứng ñem nuôi (n)

Số tế bào trứng ñược kiểm tra (n)

Số tế bào trứng thành thục (n ) Tỷ lệ thành thục (% ) 1 193 33 22 66,67 2 265 51 37 72,55 3 258 75 55 73,33 Chung 716 159 114 71,63 ± 1,02

Trong tổng số 796 tế bào trứng ñem nuôi, sau 20-24 giờ nuôi cấy chúng tôi tiến hành kiểm tra 159 tế bào thì có 114 tế bào trứng xuất hiện thể cực thứ nhất ñạt tỷ lệ 71,63%. Kết quả nuôi thành thục tế bào trứng của chúng tôi thấp hơn Nguyễn Hữu ðức và cs (2003)[3] ñã thông báo, theo tác giả kết quả này là 76,83%. Tuy nhiên kết quả này của chúng tôi cao hơn kết quả của Nguyễn Văn Lý và cs (2003) [6] , tỷ lệ tế bào trứng thành thục ñạt 62,13%.

Theo nhiều công trình nghiên cứu, tỷ lệ tế bào trứng thành thục phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng tế bào trứng trước khi nuôi cấy, kỹ năng thao tác tiến hành nuôi cấy, nhiệt ñộ, quá trình tiến hành thí nghiệm. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Lý và cs (2003)[6] khi sử dụng nguồn tế bào thu từ lò mổ, tế bào trứng thu ñược từ buồng trứng bảo quản trong 3 giờ cho tỷ lệ thành thục cao nhất. Trong thí nghiệm này thời gian bảo quản và vận chuyển tế bào trứng về tới phòng thí nghiệm là rất ngắn do vậy

ñã nâng cao ñược tỷ lệ thành thục của tế bào trứng. Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng còn phụ thuộc vào nhiệt ñộ của dung dịch bảo quản. Trong thực tế chúng tôi có sử dụng bình ổn nhiệt (nhiệt ñộ 25oC) nên ñã góp phần nâng cao khả năng sống của tế bào trứng. Hình thái của trứng là một ñặc ñiểm ban

ñầu ñáng lưu ý giúp chúng ta có thể nhanh chóng sơ bộ ñánh giá tiềm năng

phát triển của trứng về sau nghĩa là có mối liên hệ chặt chẽ giữa chất lượng trứng với khả năng tạo phôi dâu và phôi nang sau thụ tinh ống nghiệm. ðồng thời trứng thu từ các nang ở giai ñoạn tạo nang khác nhau có khả năng phát triển và thành thục trong ống nghiệm là không giống nhau. Trứng sau khi

ñược hút ra khỏi nang ñược phân loại và nuôi thành thục trong ống nghiệm

ñối với bò thời gian nuôi trứng ñể trứng có thể phát triển ñến giai ñoạn Metaphase II là dao ñộng xung quanh 24 giờ.

Theo nhiều tác giả, tỷ lệ trứng thành thục còn phụ thuộc vào ñường kính của nang trứng và hình thái của trứng. Tỷ lệ trứng thành thục cao khi trứng ñược thu từ những nang trứng có ñường kính 2-8mm. Một số tác giả

ñã báo cáo, thu tế bào trứng từ những nang trứng có ñường kính 1-2mm có

tỷ lệ thành thục giảm rõ rệt. Theo nghiên cứu của Fuhrer và cs (1989)[24], nếu nuôi cấy tế bào trứng thu từ những nang có ñường kính 2-8mm thì tỷ lệ thành thục ñạt 47%; nếu từ nang có ñường kính ≤ 0,9mm thì tỷ lệ thành thục

chỉ ñạt 1,40%. Theo Nguyễn Văn Lý (2006)[7] tỷ lệ thành thục của tế bào

trứng có ñường kính 2-5mm và lớn hơn 5-8mm cao hơn từ những nang trứng nhỏ hơn 2mm (84,81%; 82,24% và 56,66%).

Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng ñến sự thành thục

Trong các yếu tố ảnh hưởng ñến sự thành thục của tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng có vai trò quan trọng. Chất lượng tế bào trứng trước khi nuôi ảnh hưởng ñến tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trong ống nghiệm ñược thể hiện qua bảng 4.4 và biểu ñồ 4.1

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của chất lượng trứng tới tỷ lệ thành thục Chất lượng tế bào trứng Số lượng tế bào trứng ñem nuôi (n) Số lượng tế bào trứng thành thục (n) Tỷ lệ thành thục (%) Loại A 58 45 77,59a Loại B 60 46 76,67a Loại C 41 23 56,10b Chung 159 114 71,63 ± 1,02

Những chữ cái cùng cột khác nhau, các giá trị sai khác có ý nghĩa ở mức p <0,05

Qua bảng 4.4 cho thấy: có 58 tế bào trứng loại A ñem nuôi trong ñó có 45 tế bào trứng ñã thành thục ñạt tỷ lệ 77,59% ; 60 tế bào loại B ñem nuôi thì tỷ lệ thành thục ñạt 76,67% và trong 41 tế bào trứng loại C thì có 23 tế bào trứng thành thục ñạt tỷ lệ 56,10%. Như vậy tỷ lệ thành thục của tế bào loại A và B là cao nhất. Không có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ thành thục giữa tế bào trứng loại A và B, nhưng tỷ lệ thành thục của tế bào trứng loại C là thấp hơn hẳn so với loại A, B và sự khác biệt này là có ý nghĩa. Trong những ñiều kiện thích hợp thì sử dụng tế bào trứng loại A và B ñể nuôi thành thục là tốt nhất, tuy nhiên trong ñiều kiện các phòng thí nghiệm mới chưa làm chủ hoàn toàn các kỹ thuật về công nghệ phôi và cần nhiều phôi ñể tiến hành các nghiên cứu cơ bản thì vẫn có thể tận dụng tế bào trứng loại C.

Kết quả nuôi thành thục của chúng tôi không sai khác nhiều so với kết quả của Nguyễn Hữu ðức và cs (2003)[3], theo tác giả này tỷ lệ nuôi thành thục tế bào trứng loại A là 76,83% (so với 77,59%). Tuy nhiên tỷ lệ thành thục của tế bào trứng loại B và C của chúng tôi cao hơn hẳn (76,67% và 56,10% so với 58,88% và 8,69%). Theo tác giả này tỷ lệ thành thục của tế bào trứng loại A cao hơn hẳn so với loại B và C (76,83% so với 58,88% và 8,69%). Tỷ lệ nuôi thành thục tế bào trứng của chúng tôi cũng không sai khác

nhiều so với kết quả của Nguyễn Văn Lý (2006)[7], theo tác giả công bố tỷ lệ thành thục của tế bào trứng loại A, B, C lần lượt là 71,19%, 69,46% và 38,35%. Kết quả nghiên cứu của Newton và cs (1988)[40] về khả năng thành thục trong ống nghiệm của 310 trứng bò thu từ buồng trứng cho thấy tỷ lệ trứng phát triển ñến giai ñoạn thành thục dao ñộng từ 84% - 95%.

Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả trên thế giới cũng ñã khẳng ñịnh kết quả nuôi trứng thành thục phụ thuộc vào chất lượng tế bào trứng ñem nuôi (Holm và cs (1999)[30], Gomez và cs (2000)[28]). Trong một nghiên cứu của Shioya và cs (1988)[49], khi nghiên cứu nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm ở bò Holstein, các tác giả thu trứng từ buồng trứng và phân loại thành A, B, C. Theo sự phân loại này, trứng loại A là những trứng có nhiều tế bào Cumulus dày ñặc bao quanh, trứng loại B là trứng có những lớp tế bào Cumulus bao quanh nhưng không dày ñặc, trứng C là trứng trần. Kết quả nuôi thành thục với loại A là 97,40% ; loại B ñạt 89,80% và loại C chỉ ñạt 52,90%.

Khối tế bào trứng - Cumulus có ý nghĩa quan trọng trong việc thành thục của trứng. Sở dĩ như vậy là do Cumulus cung cấp dưỡng chất cho tế bào trứng trong lúc phát triển, tham gia vào việc hình thành màng trong suốt và tổng hợp chất gian bào. ðộ dầy của Cumulus liên quan chặt chẽ tới kích thước của nang trứng, sự ñồng ñều của Cumulus cũng thay ñổi theo trạng thái nang trứng. Do vậy một phương pháp ñơn giản ñể phân biệt khả năng phát triển của tế bào trứng là quan sát hình thái của tế bào Cumulus.

Sự tương tác trao ñổi chất giữa tế bào trứng và tế bào Cumulus ñóng một