tuyển chọn dõng nấm mốc aspergillus niger sinh tổng hợp protease

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG TRẦN THỊ NHƢ HÀ TUYỂN CHỌN DÕNG NẤM MỐC Aspergillus niger SINH TỔNG HỢP PROTEASE Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: TUYỂN CHỌN DÕNG NẤM MỐC Aspergillus niger SINH TỔNG HỢP PROTEASE Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực PGs.Ts Nguyễn Văn Mƣời Trần Thị Nhƣ Hà MSSV: 2101976 Lớp: CNTP K36 Cần Thơ, 2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu với hƣớng dẫn PGs Ts Nguyễn Văn Mƣời Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, thực chƣa công bố trƣớc Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Ngƣời hƣớng dẫn PGs.Ts Nguyễn Văn Mƣời Ngƣời viết Trần Thị Nhƣ Hà Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng i Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài nghiên cứu luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ thực phẩm, gặp không khó khăn nhƣng đến em hoàn thành trình nghiên cứu có đƣợc kết nhƣ mong muốn Những thành có đƣợc nhờ giúp đỡ thầy cô, gia đình, bạn bè Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Văn Mƣời Cô Trần Thanh Trúc, giảng viên Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Cần Thơ Những ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhƣng thầy cô thƣờng xuyên theo dõi, hƣớng dẫn giúp đỡ em tận tình suốt trình nghiên cứu, giúp em hoàn thành tốt đề tài luận văn Qua đây, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô Trƣờng Đại học Cần Thơ, đặc biệt quý thầy cô môn Công nghệ thực phẩm nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức hữu ích kinh nghiệm thực tế suốt thời gian em học tập, rèn luyện trƣờng Con kính xin gửi lời biết ơn chân thành đến cha mẹ, ngƣời sinh nuôi dạy Và ngƣời mong tốt đẹp đến với Sau cùng, em xin chân thành cảm ơn anh chị Cao học Công nghệ thực phẩm khóa 18, khóa 19, anh chị Cao học Công nghệ Sinh học khóa 19 bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 36 nhiệt tình đóng góp ý kiến động viên giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Cuối lời, xin kính chúc quý thầy cô, anh chị bạn dồi sức khỏe thành công sống! Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Sinh viên thực Trần Thị Nhƣ Hà Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Đề tài thực với mục tiêu tuyển chọn dòng Aspergillus niger đặc hiệu thông qua phương pháp xác định đường kính vòng phân giải casein môi trường thạch, sử dụng 29 dòng Aspergillus niger phân lập từ vỏ loại citrus (cam, chanh, bưởi), táo sung xác định tính chất, trữ mẫu Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Việc tuyển chọn dòng nấm mốc có khả sinh tổng hợp protease thực cách đo đường kính vòng phân giải casein môi trường agarose – casein với thành phần glycerol 0,5%, yeast extract 0,3%, NaCl 0,5% , agar 2% casein 1%(w/v) pH Kết cho thấy tất 29 dòng có khả sinh tổng hợp protease với đường kính phân giải casein khác Dựa kích thước vòng phân giảicasein 29 dòng nấm mốc tuyển chọn dòng có vòng phân giải casein môi trường thạch lớn ổn định, ký hiệu N1, R1, R4, Sa2 có nguồn gốc từ chanh núm, bưởi Năm roi cam sành Sự kết hợp dòng R4 Sa2 với tỷ lệ 1:3 cho kết sinh tổng hợp protease tốt hoạt tính protease sau ngày lên men lỏng môi trường Czapeck Dox có bổ sung 1% casein làm chất 0,126±0,016 U/mL Từ khóa: Aspergillus niger, đường kính vòng phân giải, hoạt tính, protease, tuyển chọn Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng iii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC  LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH HÌNH vi DANH SÁCH BẢNG vii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii Chƣơng ĐẶT VẤN ĐỀ .1 1.1 TỔNG QUAN .1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .2 Chƣơng LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 2.1.1 Lƣợc sử protease 2.1.2 Protease 2.1.3 Nguồn thu nhận protease 2.1.4 Đặc điểm tính chất protease vi sinh vật 10 2.1.5 Tầm quan trọng protease thực tiễn 11 2.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER 14 2.2.1 Giới thiệu chung 14 2.2.2 Đặc điểm hệ sợi nấm Aspergillus niger 15 2.2.3 Cấu tạo quan sinh sản 15 2.2.4 Phƣơng pháp tuyển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả sinh tổng hợp protease 16 2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 17 Chƣơng PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM .19 3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm 19 3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 19 3.1.3 Hóa chất sử dụng 19 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu 20 3.2.2 Phƣơng pháp phân tích đo đạc kết 20 3.2.3 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu 22 3.2.4 Phƣơng pháp thu thập xử lý kết 22 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .22 3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22 3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát sơ dòng nấm mốc A niger đặc hiệu cho trình sinh tổng hợp protease 22 Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng iv Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả kết hợp dòng nấm mốc A niger đặc hiệu có khả sinh tồng hợp protease cao 23 3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ kết hợp hai dòng nấm mốc đặc hiệu đến khả sinh tổng hợp protease 25 3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát sơ hoạt tính protease tỷ lệ kết hợp tối ƣu……… 25 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Tuyển chọn dòng nấm mốc có khả sinh tổng hợp protease hoạt tính cao .26 4.2 Khả kết hợp dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu thu nhận protease 29 4.3 Đánh giá khả kết hợp hai dòng Sa2 R4 đặc hiệu theo tỷ lệ khác đến hiệu sinh tổng hợp protease .32 4.4 Hoạt tính protease tỷ lệ kết hợp Sa2 R4 tốt 34 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 KẾT LUẬN .35 5.2 ĐỀ NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC HÓA CHẤT, DUNG DỊCH ĐỆM SỬ DỤNG ix PHỤ LỤC CÁC DÕNG NẤM MỐC SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH TUYỂN CHỌN…………… x PHỤ LỤC XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN TYROSINE THEO PHƢƠNG PHÁP ANSON CẢI TIẾN (1938) xi PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ xii PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH xxvi Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng v Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc aspergillopepsin II Hình 2.2 Cơ chế xúc tác enzyme Hình 2.3 Hình thái Aspergillus sp 15 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22 Hình 3.2 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp dòng nấm mốc A niger đặc hiệu có khả sinh tồng hợp protease cao 24 Hình 4.1: Vòng phân giải protease môi trƣờng casein - agarose sau 24 ủ 30°C nhận diện với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue R-250 1% 29 Hình 4.2: Vòng phân giải casein dòng A niger R1+R4 R1, R4 riêng lẻ 31 Hình 4.3: Vòng phân giải casein ứng với tỷ lệ khác hai dòng Sa2 R4 33 Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Phân loại enzyme protease Bảng 2.2 Đặc tính chung bốn loại protease Bảng 2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease Bảng 2.4 Một số tính chất protease vi sinh vật 11 Bảng 4.1: Các dòng Aspergillus niger có hiệu thủy phân casein trung bình thấp 27 Bảng 4.2: So sánh hiệu thủy phân casein dòng A niger mạnh 28 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng dòng nấm mốc Aspergillus niger kết hợp đến hiệu thủy phân casein 30 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng tỷ lệ kết hợp hai dòng Sa2 R4 đến hiệu sinh tổng hợp protease hoạt tính cao 32 Bảng 4.5: Hoạt tính protease sinh từ kết hợp Sa2 R4 34 Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng vii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT A Aspergillus Asp Aspartic aa acid amin cfu colony forming unit (mật số bào tử hình thành) PDA Potato Dextrose Agar U/g Units per weight (gram) of substrate U/mL Units per volume (mL) of substrate v/v volume/volume (tỷ lệ thể tích/thể tích) v/w volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lƣợng) w/w weight/weight (tỷ lệ khối lƣợng/khối lƣợng) Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng viii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 PHỤ LỤC Trường Đại học Cần Thơ KẾT QUẢ THỐNG KÊ - So sánh tính đặc hiệu protease dựa đường kính vòng phân giải protein dòng nấm mốc thuộc loài A niger +Dựa đƣờng kính vòng phân giải protease với thị Coomassie Brilliant Blue R-250 1%, đƣờng kính phát triển nấm mốc, tỷ lệ đƣờng kính vòng phân giải đƣờng kính phát triển nấm mốc * ĐK vòng halo d (mm) ANOVA Table for DK halo_ d by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 26,1845 4,36409 16,59 Within groups 9,20833 35 ,263095 Total (Corr.) 35,3929 41 P-Value 0,0000 Multiple Range Tests for DK halo_ d by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups T1 8,41667 X V 8,95833 X R4 10,125 X S1 10,2917 X R1 10,3333 X N1 10,5 X Sa2 10,625 X Contrast Sig Difference +/- Limits N1 - R1 0,166667 0,601196 N1 - R4 0,375 0,601196 N1 - S1 0,208333 0,601196 N1 - Sa2 -0,125 0,601196 N1 - T1 * 2,08333 0,601196 N1 - V * 1,54167 0,601196 R1 - R4 0,208333 0,601196 R1 - S1 0,0416667 0,601196 R1 - Sa2 -0,291667 0,601196 R1 - T1 * 1,91667 0,601196 R1 - V * 1,375 0,601196 R4 - S1 -0,166667 0,601196 R4 - Sa2 -0,5 0,601196 Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 R4 - T1 * 1,70833 0,601196 R4 - V * 1,16667 0,601196 -0,333333 0,601196 S1 - Sa2 S1 - T1 * 1,875 0,601196 S1 - V * 1,33333 0,601196 Sa2 - T1 * 2,20833 0,601196 Sa2 - V * 1,66667 0,601196 -0,541667 0,601196 T1 - V Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference * ĐK vòng nấm mốc D ANOVA Table for DK vong nam moc_D by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 51,8839 8,64732 11,83 Within groups 25,5938 35 0,73125 Total (Corr.) 77,4777 41 P-Value 0,0000 Multiple Range Tests for DK vong nam moc_D by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups T1 13,9583 X V 14,5 X R4 15,625 X Sa2 16,375 XX R1 16,4583 XX N1 16,9583 X S1 17,0 X Contrast Sig Difference +/- Limits 0,5 1,00229 1,33333 1,00229 N1 - S1 -0,0416667 1,00229 N1 - Sa2 0,583333 1,00229 N1 - R1 N1 - R4 * N1 - T1 * 3,0 1,00229 N1 - V * 2,45833 1,00229 R1 - R4 0,833333 1,00229 R1 - S1 -0,541667 1,00229 R1 - Sa2 0,0833333 1,00229 R1 - T1 * 2,5 1,00229 R1 - V * 1,95833 1,00229 Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xiii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 R4 - S1 * R4 - Sa2 -1,375 1,00229 -0,75 1,00229 R4 - T1 * 1,66667 1,00229 R4 - V * 1,125 1,00229 0,625 1,00229 S1 - Sa2 S1 - T1 * 3,04167 1,00229 S1 - V * 2,5 1,00229 Sa2 - T1 * 2,41667 1,00229 Sa2 - V * 1,875 1,00229 -0,541667 1,00229 T1 - V Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference * Tỷ lệ d: D ANOVA Table for d:D by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups ,0124 0,00206667 5,72 Within groups ,01265 35 0,000361429 Total (Corr.) ,02505 41 P-Value 0,0003 Multiple Range Tests for d:D by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups T1 0,603333 X S1 0,606667 XX V 0,616667 XX N1 0,621667 XX R1 0,628333 XX R4 0,648333 X Sa2 0,65 X Contrast Sig Difference +/- Limits -0,00666667 0,0222828 -0,0266667 0,0222828 0,015 0,0222828 -0,0283333 0,0222828 N1 - T1 0,0183333 0,0222828 N1 - V 0,005 0,0222828 R1 - R4 -0,02 0,0222828 R1 - S1 0,0216667 0,0222828 R1 - Sa2 -0,0216667 0,0222828 N1 - R1 N1 - R4 * N1 - S1 N1 - Sa2 * Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xiv Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 R1 - T1 * R1 - V R4 - S1 * R4 - Sa2 0,025 0,0222828 0,0116667 0,0222828 0,0416667 0,0222828 -0,00166667 0,0222828 R4 - T1 * 0,045 0,0222828 R4 - V * 0,0316667 0,0222828 S1 - Sa2 * -0,0433333 0,0222828 S1 - T1 0,00333333 0,0222828 S1 - V -0,01 0,0222828 Sa2 - T1 * 0,0466667 0,0222828 Sa2 - V * 0,0333333 0,0222828 -0,0133333 0,0222828 T1 - V Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference - Đánh giá hiệu kết hợp dòng nấm mốc tính đặc hiệu với protease + Thông qua đƣờng kính vòng phân giải protein với thị Coomassie Brilliant Blue R250 1%, đƣờng kính phát triển nấm mốc, tỷ lệ đƣờng kính vòng phân giải đƣờng kính phát triển nấm mốc * Đƣờng kính halo d ANOVA Table for DK halo_ d by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 16,724 10 1,6724 4,47 Within groups 11,6094 31 0,374496 Total (Corr.) 28,3333 41 P-Value 0,0006 Multiple Range Tests for DK halo_ d by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups R4 10,0625 X R1 10,25 X Sa2 10,375 X N1 10,5 X SA2 10,5625 X R1+R4 10,6875 XX N1+R4 10,75 XX SA2+R1 11,5 XX SA2+N1 11,5 XX R1+N1 11,5 XX SA2+R4 12,125 X Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xv Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Contrast Difference +/- Limits N1 - N1+R4 -0,25 0,882543 N1 - R1 0,25 0,882543 -1,0 0,882543 N1 - R1+R4 -0,1875 0,882543 N1 - R4 0,4375 0,882543 N1 - SA2 -0,0625 0,882543 N1 - R1+N1 Sig * N1 - SA2+N1 * -1,0 0,882543 N1 - SA2+R1 * -1,0 0,882543 N1 - SA2+R4 * -1,625 0,882543 N1 - Sa2 0,125 1,08089 N1+R4 - R1 0,5 0,882543 N1+R4 - R1+N1 -0,75 0,882543 N1+R4 - R1+R4 0,0625 0,882543 N1+R4 - R4 0,6875 0,882543 N1+R4 - SA2 0,1875 0,882543 N1+R4 - SA2+N1 -0,75 0,882543 N1+R4 - SA2+R1 -0,75 0,882543 -1,375 0,882543 0,375 1,08089 -1,25 0,882543 R1 - R1+R4 -0,4375 0,882543 R1 - R4 0,1875 0,882543 R1 - SA2 -0,3125 0,882543 N1+R4 - SA2+R4 * N1+R4 - Sa2 R1 - R1+N1 * R1 - SA2+N1 * -1,25 0,882543 R1 - SA2+R1 * -1,25 0,882543 R1 - SA2+R4 * -1,875 0,882543 R1 - Sa2 -0,125 1,08089 R1+N1 - R1+R4 0,8125 0,882543 R1+N1 - R4 * 1,4375 0,882543 R1+N1 - SA2 * 0,9375 0,882543 R1+N1 - SA2+N1 0,0 0,882543 R1+N1 - SA2+R1 0,0 0,882543 R1+N1 - SA2+R4 -0,625 0,882543 1,125 1,08089 R1+R4 - R4 0,625 0,882543 R1+R4 - SA2 0,125 0,882543 R1+R4 - SA2+N1 -0,8125 0,882543 R1+N1 - Sa2 * Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trường Đại học Cần Thơ xvi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 R1+R4 - SA2+R1 -0,8125 0,882543 -1,4375 0,882543 R1+R4 - Sa2 0,3125 1,08089 R4 - SA2 -0,5 0,882543 R1+R4 - SA2+R4 * R4 - SA2+N1 * -1,4375 0,882543 R4 - SA2+R1 * -1,4375 0,882543 R4 - SA2+R4 * -2,0625 0,882543 -0,3125 1,08089 R4 - Sa2 SA2 - SA2+N1 * -0,9375 0,882543 SA2 - SA2+R1 * -0,9375 0,882543 SA2 - SA2+R4 * -1,5625 0,882543 SA2 - Sa2 0,1875 1,08089 SA2+N1 - SA2+R1 0,0 0,882543 SA2+N1 - SA2+R4 -0,625 0,882543 1,125 1,08089 -0,625 0,882543 SA2+N1 - Sa2 * SA2+R1 - SA2+R4 SA2+R1 - Sa2 * 1,125 1,08089 SA2+R4 - Sa2 * 1,75 1,08089 Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference * ĐK vòng nấm mốc D ANOVA Table for DK vong nam moc_D by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 16,2798 10 1,62798 2,20 Within groups 22,9063 31 0,738911 Total (Corr.) 39,186 41 P-Value 0,0452 Multiple Range Tests for DK vong nam moc_D by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups R1+R4 15,25 X R4 15,375 X N1+R4 15,8125 XX SA2 16,0 XXX SA2+N1 16,375 XXX R1 16,625 XX Sa2 16,625 XXX SA2+R1 16,6875 XX SA2+R4 16,9375 XX R1+N1 17,0 XX Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xvii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 N1 17,0625 Trường Đại học Cần Thơ X Contrast Sig Difference +/- Limits N1 - N1+R4 * 1,25 1,23968 N1 - R1 0,4375 1,23968 N1 - R1+N1 0,0625 1,23968 N1 - R1+R4 * 1,8125 1,23968 N1 - R4 * 1,6875 1,23968 N1 - SA2 1,0625 1,23968 N1 - SA2+N1 0,6875 1,23968 N1 - SA2+R1 0,375 1,23968 N1 - SA2+R4 0,125 1,23968 N1 - Sa2 0,4375 1,51829 N1+R4 - R1 -0,8125 1,23968 N1+R4 - R1+N1 -1,1875 1,23968 N1+R4 - R1+R4 0,5625 1,23968 N1+R4 - R4 0,4375 1,23968 N1+R4 - SA2 -0,1875 1,23968 N1+R4 - SA2+N1 -0,5625 1,23968 N1+R4 - SA2+R1 -0,875 1,23968 N1+R4 - SA2+R4 -1,125 1,23968 N1+R4 - Sa2 -0,8125 1,51829 R1 - R1+N1 -0,375 1,23968 R1 - R1+R4 * 1,375 1,23968 R1 - R4 * 1,25 1,23968 R1 - SA2 0,625 1,23968 R1 - SA2+N1 0,25 1,23968 R1 - SA2+R1 -0,0625 1,23968 R1 - SA2+R4 -0,3125 1,23968 R1 - Sa2 0,0 1,51829 R1+N1 - R1+R4 * 1,75 1,23968 R1+N1 - R4 * 1,625 1,23968 R1+N1 - SA2 1,0 1,23968 R1+N1 - SA2+N1 0,625 1,23968 R1+N1 - SA2+R1 0,3125 1,23968 R1+N1 - SA2+R4 0,0625 1,23968 R1+N1 - Sa2 0,375 1,51829 R1+R4 - R4 -0,125 1,23968 R1+R4 - SA2 -0,75 1,23968 Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xviii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 R1+R4 - SA2+N1 -1,125 1,23968 R1+R4 - SA2+R1 * -1,4375 1,23968 R1+R4 - SA2+R4 * -1,6875 1,23968 R1+R4 - Sa2 -1,375 1,51829 R4 - SA2 -0,625 1,23968 R4 - SA2+N1 -1,0 1,23968 R4 - SA2+R1 * -1,3125 1,23968 R4 - SA2+R4 * -1,5625 1,23968 R4 - Sa2 -1,25 1,51829 SA2 - SA2+N1 -0,375 1,23968 SA2 - SA2+R1 -0,6875 1,23968 SA2 - SA2+R4 -0,9375 1,23968 SA2 - Sa2 -0,625 1,51829 SA2+N1 - SA2+R1 -0,3125 1,23968 SA2+N1 - SA2+R4 -0,5625 1,23968 SA2+N1 - Sa2 -0,25 1,51829 SA2+R1 - SA2+R4 -0,25 1,23968 SA2+R1 - Sa2 0,0625 1,51829 SA2+R4 - Sa2 0,3125 1,51829 Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference *d: D ANOVA Table for d:D by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups ,0477655 10 0,00477655 14,20 Within groups ,010425 31 0,00033629 Total (Corr.) ,0581905 41 P-Value 0,0000 Multiple Range Tests for d:D by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups N1 0,615 X R1 0,6175 X Sa2 0,625 X R4 0,6575 X SA2 0,66 X R1+N1 0,675 XX N1+R4 0,68 XXX SA2+R1 0,69 XX R1+R4 0,7025 XX Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xix Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 SA2+N1 0,7025 XX SA2+R4 0,7175 X Contrast Sig Difference +/- Limits N1 - N1+R4 * -0,065 0,0264466 -0,0025 0,0264466 N1 - R1 N1 - R1+N1 * -0,06 0,0264466 N1 - R1+R4 * -0,0875 0,0264466 N1 - R4 * -0,0425 0,0264466 N1 - SA2 * -0,045 0,0264466 N1 - SA2+N1 * -0,0875 0,0264466 N1 - SA2+R1 * -0,075 0,0264466 N1 - SA2+R4 * -0,1025 0,0264466 -0,01 0,0323903 0,0625 0,0264466 N1+R4 - R1+N1 0,005 0,0264466 N1+R4 - R1+R4 -0,0225 0,0264466 N1+R4 - R4 0,0225 0,0264466 N1+R4 - SA2 0,02 0,0264466 N1+R4 - SA2+N1 -0,0225 0,0264466 N1+R4 - SA2+R1 -0,01 0,0264466 N1 - Sa2 N1+R4 - R1 * N1+R4 - SA2+R4 * -0,0375 0,0264466 N1+R4 - Sa2 * 0,055 0,0323903 R1 - R1+N1 * -0,0575 0,0264466 R1 - R1+R4 * -0,085 0,0264466 R1 - R4 * -0,04 0,0264466 R1 - SA2 * -0,0425 0,0264466 R1 - SA2+N1 * -0,085 0,0264466 R1 - SA2+R1 * -0,0725 0,0264466 R1 - SA2+R4 * -0,1 0,0264466 -0,0075 0,0264466 -0,0275 0,0264466 R1+N1 - R4 0,0175 0,0264466 R1+N1 - SA2 0,015 0,0264466 -0,0275 0,0264466 -0,015 0,0264466 R1 - Sa2 R1+N1 - R1+R4 R1+N1 - SA2+N1 * * R1+N1 - SA2+R1 R1+N1 - SA2+R4 * -0,0425 0,0264466 R1+N1 - Sa2 * 0,05 0,0323903 R1+R4 - R4 * 0,045 0,0264466 Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trường Đại học Cần Thơ xx Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 R1+R4 - SA2 * 0,0425 0,0264466 R1+R4 - SA2+N1 0,0 0,0264466 R1+R4 - SA2+R1 0,0125 0,0264466 R1+R4 - SA2+R4 -0,015 0,0264466 0,0775 0,0323903 -0,0025 0,0264466 R1+R4 - Sa2 * R4 - SA2 R4 - SA2+N1 * -0,045 0,0264466 R4 - SA2+R1 * -0,0325 0,0264466 R4 - SA2+R4 * -0,06 0,0264466 R4 - Sa2 * 0,0325 0,0323903 SA2 - SA2+N1 * -0,0425 0,0264466 SA2 - SA2+R1 * -0,03 0,0264466 SA2 - SA2+R4 * -0,0575 0,0264466 SA2 - Sa2 * 0,035 0,0264466 SA2+N1 - SA2+R1 0,0125 0,0264466 SA2+N1 - SA2+R4 -0,015 0,0264466 SA2+N1 - Sa2 * 0,0775 0,0323903 SA2+R1 - SA2+R4 * -0,0275 0,0264466 SA2+R1 - Sa2 * 0,065 0,0323903 SA2+R4 - Sa2 * 0,0925 0,0323903 Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference - Sự thay đổi tỷ lệ kết hợp hai dòng nấm Sa2 R4 đến gia tăng hiệu sinh tổng hợp protease + Thông qua đƣờng kính vòng phân giải protein với thị Coomassie Brilliant Blue R250 1%, đƣờng kính phát triển nấm mốc, tỷ lệ đƣờng kính vòng phân giải đƣờng kính phát triển nấm mốc ANOVA Table for DK halo_ d by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 7,60714 1,26786 5,98 Within groups 4,45313 21 0,212054 Total (Corr.) 12,0603 27 P-Value 0,0009 Multiple Range Tests for DK halo_ d by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups 3:1 11,5 X 4:1 11,625 XX 1:4 12,1875 XX 1:1 12,3125 X Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xxi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 1:2 12,4375 X 2:1 12,625 XX 1:3 13,125 X Contrast Sig Difference +/- Limits -0,125 0,67716 -0,8125 0,67716 1:1 - 1:4 0,125 0,67716 1:1 - 2:1 -0,3125 0,67716 1:1 - 1:2 1:1 - 1:3 * 1:1 - 3:1 * 0,8125 0,67716 1:1 - 4:1 * 0,6875 0,67716 1:2 - 1:3 * -0,6875 0,67716 1:2 - 1:4 0,25 0,67716 1:2 - 2:1 -0,1875 0,67716 1:2 - 3:1 * 0,9375 0,67716 1:2 - 4:1 * 0,8125 0,67716 1:3 - 1:4 * 0,9375 0,67716 0,5 0,67716 1:3 - 2:1 1:3 - 3:1 * 1,625 0,67716 1:3 - 4:1 * 1,5 0,67716 -0,4375 0,67716 0,6875 0,67716 0,5625 0,67716 1:4 - 2:1 1:4 - 3:1 * 1:4 - 4:1 2:1 - 3:1 * 1,125 0,67716 2:1 - 4:1 * 1,0 0,67716 -0,125 0,67716 3:1 - 4:1 Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference * ĐK vòng nấm mốc D ANOVA Table for DK vong nam moc_D by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 9,15179 1,5253 5,69 Within groups 5,625 21 0,267857 Total (Corr.) 14,7768 27 P-Value 0,0012 Multiple Range Tests for DK vong nam moc_D by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xxii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups 1:1 16,875 X 1:2 16,9375 X 1:4 17,125 XX 2:1 17,1875 XX 1:3 17,3125 XX 3:1 17,8125 X 4:1 18,625 X Contrast Sig Difference +/- Limits 1:1 - 1:2 -0,0625 0,761062 1:1 - 1:3 -0,4375 0,761062 1:1 - 1:4 -0,25 0,761062 1:1 - 2:1 -0,3125 0,761062 1:1 - 3:1 * -0,9375 0,761062 1:1 - 4:1 * -1,75 0,761062 1:2 - 1:3 -0,375 0,761062 1:2 - 1:4 -0,1875 0,761062 1:2 - 2:1 -0,25 0,761062 1:2 - 3:1 * -0,875 0,761062 1:2 - 4:1 * -1,6875 0,761062 1:3 - 1:4 0,1875 0,761062 1:3 - 2:1 0,125 0,761062 1:3 - 3:1 -0,5 0,761062 -1,3125 0,761062 1:4 - 2:1 -0,0625 0,761062 1:4 - 3:1 -0,6875 0,761062 -1,5 0,761062 -0,625 0,761062 1:3 - 4:1 1:4 - 4:1 * * 2:1 - 3:1 2:1 - 4:1 * -1,4375 0,761062 3:1 - 4:1 * -0,8125 0,761062 Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference * Tỷ lệ d: D ANOVA Table for d:D by Dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups ,0559857 0,00933095 12,38 Within groups ,015825 21 0,000753571 Total (Corr.) ,0718107 27 Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng P-Value 0,0000 xxiii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Multiple Range Tests for d:D by Dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Dong nam moc Count Mean Homogeneous Groups 4:1 0,625 X 3:1 0,645 X 1:4 0,715 X 1:1 0,7175 XX 1:2 0,7175 XX 2:1 0,735 XX 1:3 0,7575 X Contrast Sig Difference +/- Limits 1:1 - 1:2 0,0 0,0403674 1:1 - 1:3 -0,04 0,0403674 1:1 - 1:4 0,0025 0,0403674 1:1 - 2:1 -0,0175 0,0403674 1:1 - 3:1 * 0,0725 0,0403674 1:1 - 4:1 * 0,0925 0,0403674 1:2 - 1:3 -0,04 0,0403674 1:2 - 1:4 0,0025 0,0403674 1:2 - 2:1 -0,0175 0,0403674 1:2 - 3:1 * 0,0725 0,0403674 1:2 - 4:1 * 0,0925 0,0403674 1:3 - 1:4 * 0,0425 0,0403674 0,0225 0,0403674 1:3 - 2:1 1:3 - 3:1 * 0,1125 0,0403674 1:3 - 4:1 * 0,1325 0,0403674 -0,02 0,0403674 1:4 - 2:1 1:4 - 3:1 * 0,07 0,0403674 1:4 - 4:1 * 0,09 0,0403674 2:1 - 3:1 * 0,09 0,0403674 2:1 - 4:1 * 0,11 0,0403674 0,02 0,0403674 3:1 - 4:1 * denotes a statistically significant difference + Thông qua hoạt tính protease theo phƣơng pháp lên men lỏng One-Way ANOVA - Protease by Su ket hop dong nam moc Dependent variable: Protease (U/mL) Factor: Su ket hop dong nam moc Number of observations: 24 Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xxiv Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Number of levels: ANOVA Table for Protease by Su ket hop dong nam moc Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups ,0393272 0,0131091 140,30 Within groups ,00186867 20 0,0000934333 Total (Corr.) ,0411958 23 P-Value 0,0000 Multiple Range Tests for Protease by Su ket hop dong nam moc Method: 95,0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups Sa2 0,0295 X R4 0,0298333 X 2:1 0,0418333 X 1:3 0,1265 X Contrast Sig Difference +/- Limits 1:3 - 2:1 * 0,0846667 0,0116412 1:3 - R4 * 0,0966667 0,0116412 1:3 - Sa2 * 0,097 0,0116412 2:1 - R4 * 0,012 0,0116412 2:1 - Sa2 * 0,0123333 0,0116412 0,000333333 0,0116412 R4 - Sa2 * denotes a statistically significant difference Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xxv Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 PHỤ LỤC (a)Tủ cấy Dalton (c) Thiết bị ly tâm (e) Tủ ủ Sanyo Trường Đại học Cần Thơ MỘT SỐ HÌNH ẢNH (b) Nồi trùng (d) Máy quang phổ (f) Nấm Aspergillus niger môi trƣờng thạch PDA Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xxvi [...]... thí nghiệm tổng quát Thí nghiệm 1: Tuyển chọn dòng nấm mốc sinh protease hoạt tính cao Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng kết hợp của các dòng nấm mốc sinh protease hoạt tính cao Thí nghiệm 3: Khảo sát tỷ lệ kết hợp dòng nấm mốc sinh protease hoạt tính cao Thí nghiệm 4: Khảo sát sơ bộ hoạt tính protease Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát sơ bộ dòng nấm mốc A niger đặc... hơn (Onions et al., 1981) Loài A niger đƣợc phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử đính màu đen 2.2.4 Phƣơng pháp tuyển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp protease Việc sàng lọc các dòng vi sinh vật có hoạt tính sinh học mong muốn thƣờng phụ thuộc vào từng sản phẩm cụ thể Đối với trƣờng hợp tuyển chọn dòng A niger sinh enzyme hoạt tính cao có thể... đột biến gene để chọn giống vi sinh vật sinh enzyme thƣờng không nhiều khi so sánh với việc tuyển chọn các dòng vi sinh vật có hoạt tính kháng sinh Trƣờng hợp chọn lọc tự nhiên trên môi trƣờng đặc hiệu hay đột biến tự nhiên dựa trên sự cạnh tranh của các dòng vi sinh vật sinh enzyme thƣờng đƣợc áp dụng (Zhong - Tao, 2009) Quá trình tuyển chọn dòng A niger có khả năng sinh tổng hợp protease cũng thƣờng... khả năng kết hợp của các dòng Aspergillus niger giúp tăng khả năng sinh tổng hợp protease (3) Khảo sát tỷ lệ kết hợp của hai dòng nấm mốc Aspergillus niger đã tuyển chọn giúp hiệu quả thu nhận protease đạt cao nhất Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 CHƢƠNG 2 2.1 Trường Đại học Cần Thơ LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 2.1.1... năng kết hợp của các dòng nấm tuyển chọn đến hoạt tính ezyme protease thu nhận Đổ đĩa trên môi trƣờng thạch casein 0,01 mL huyền phù bào tử nấm Ủ (30 oC, 24 giờ) Xác định đƣờng kính vòng phân giải Thuốc thử Coomassie Brilliant Blue R-250 Các dòng nấm mốc có khả năng tổng hợp protease hoạt tính cao Hình 0.2 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp của các dòng nấm mốc A niger đặc hiệu có khả năng sinh tồng hợp protease. .. Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 25 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 CHƢƠNG 4 Trường Đại học Cần Thơ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TUYỂN CHỌN DÕNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO Vòng phân giải casein có mối quan hệ với lƣợng protease tiết ra bởi nấm mốc (Vermelho et al., 1996) Do đó, việc khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của 29 dòng A niger đƣợc đánh giá... 2004) - Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn protease đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhƣ các chủng: Aspergillus oryzae, Aspergillus terricola, A fumigatus, A niger, Penicillium chysogenum… các loại nấm mốc này... trƣờng hợp khảo sát là protease chính là điều đầu tiên cần đƣợc thực hiện nhằm gia tăng hiệu quả tổng hợp enzyme đặc hiệu 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu khảo sát chính của đề tài là tuyển chọn dòng A niger đặc hiệu cho quá trình sinh tổng hợp đạt hiệu quả Trên cơ sở đó, đề tài tiến hành nghiên cứu 3 nội dung chính : (1) Tuyển chọn dòng Aspergillus niger đơn lẻ có khả năng sinh protease dựa trên đƣờng... khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3 Một số nấm mốc khác nhƣ: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat (Nguyễn Trọng Cẩn et al., 1998) Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất... Acinetobacter sp QN6 sinh tổng hợp protease Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 17 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nƣớc ở lĩnh vực tuyển chọn dòng vi sinh vật phù hợp cho hoạt động của enzyme đặc hiệu (protease) đến việc tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp enzyme này cho thấy, việc tuyển dòng vi sinh vật đặc ... khoa hc ó phõn loi cỏc protease vi sinh vt thnh bn nhúm protease serine; protease thiol; protease kim loi; protease acid Trong bn protease k trờn, cỏc protease serine v protease thiol cú kh nng... Tuyn chn dũng Aspergillus niger n l cú kh nng sinh protease da trờn ng kớnh vũng phõn gii casein (2) Nghiờn cu kh nng kt hp ca cỏc dũng Aspergillus niger giỳp tng kh nng sinh tng hp protease (3)... vi sinh vt sinh enzyme thng c ỏp dng (Zhong - Tao, 2009) Quỏ trỡnh tuyn chn dũng A niger cú kh nng sinh tng hp protease cng thng c thc hin da trờn (i) Tuyn chn s b dũng A niger sinh tng hp protease