trình sinh tổng hợp protease
Mục đích: Sơ bộ chọn các dòng nấm mốc có khả năng tạo ra protease.
Phƣơng pháp: Đo đƣờng kính vòng phân giải casein trên môi trƣờng thạch casein. Khả năng sinh protease đƣợc đánh giá trên dựa trên sự thủy phân casein thông qua đƣờng kính của vòng phân giải casein với sự nhận biết dựa vào chất chỉ thị Coomassie Brilliant Blue R-250 (Shivakumar, 2012).
Các dòng A. niger đƣợc nuôi cấy trên dĩa petri với môi trƣờng PDA, sau 2-3 ngày, ở nhiệt độ 30 ± 2°C. Sau đó, các dòng nấm mốc này đƣợc sử dụng để pha dung dịch huyền phù bào tử nấm với mật số 105
cfu/mL.
Bước 2: Tiến hành
Môi trƣờng thạch với pH=5 có bổ sung các thành phần: glycerol 0,5%, yeast extract 0,3%, NaCl 0,5%, agar 2% và casein 1% (w/v). Môi trƣờng trên đƣợc đun tan và phân phối vào các dĩa petri, sau đó dùng khoan nút đục lỗ trên đĩa thạch.
Hút vào mỗi lỗ 0,1 mL huyền phù bào tử nấm (mật số 105
cfu/mL) đã chuẩn bị, nuôi ở nhiệt độ 30 ± 2ºC.
Sau 24 giờ ủ, nhỏ dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250 lên bề mặt thạch và đo vòng phân giải casein sau 2 giờ.
Kết quả thu nhận: Các dòng nấm mốc có khả năng tổng hợp protease cao dựa trên đƣờng kính vòng phân giải casein.
3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng kết hợp của các dòng nấm mốc
A. niger đặc hiệu có khả năng sinh tồng hợp protease cao.
Mục đích: Lựa chọn phƣơng án kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu để hoạt tính protease thu đƣợc là cao nhất (dự kiến 4 dòng nấm, ký hiệu 1, 2, 3 và 4, kết hợp cặp đôi theo tỷ lệ huyền phù bào tử 1:1).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc tiến hành với một nhân tố Nhân tố A: Phƣơng thức kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu A1: Dòng 1 A2: Dòng 2 A3: Dòng 3 A4: Dòng 4 A5: Kết hợp dòng 1 và 2 A6: Kết hợp dòng 1 và 3 A7: Kết hợp dòng 1 và 4 A8: Kết hợp dòng 2 và 3 A9: Kết hợp dòng 2 và 4 A10:Kết hợp dòng 3 và 4
Số nghiệm thức khảo sát: 10 nghiệm thức
Hình 0.2. Sơ đồ thí nghiệm kết hợp của các dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu
có khả năng sinh tồng hợp protease cao
Huyền phù bào tử nấm mốc (105 cfu/mL) 4 dòng nấm mốc đặc hiệu (A1, A2, A3, A4) Các phƣơng thức kết hợp A1 A2 A3 A4 A1 x A3 A6 A1 x A2 A5 A1 x A4 A7 A2 x A4 A9 A2 x A3 A8 A3 x A4 A10
Đánh giá khả năng kết hợp của các dòng nấm tuyển chọn đến hoạt tính ezyme protease thu nhận
Đổ đĩa trên môi trƣờng thạch casein
Ủ (30 oC, 24 giờ)
Xác định đƣờng kính vòng phân giải
Các dòng nấm mốc có khả năng tổng hợp protease hoạt tính cao 0,01 mL huyền phù bào tử nấm
Thuốc thử
Coomassie Brilliant Blue R-250
Phƣơng pháp: Thí nghiệm đƣợc thực hiện tƣơng tự thí nghiệm 1.
Ở các nghiệm thức kết hợp của hai dòng nấm mốc, pha loãng huyền phù đến mật số mong muốn, phối trộn trong điều kiện vô trùng (phối trộn trong tủ cấy đã khử trùng) huyền phù của hai mẫu nấm mốc tƣơng ứng với tỷ lệ 1:1.
Kết quả thu nhận: Hai dòng nấm mốc kết hợp thích hợp có khả năng tạo ra protease nhiều nhất dựa theo đƣờng kính vòng phân giải.