3.2.2.1Tuyển chọn dòng A. niger đặc hiệu đối với protease
- Đo đƣờng kính vòng phân giải casein trên môi trƣờng thạch casein : Xác định Khả năng sinh protease đƣợc đánh giá dựa trên sự thủy phân casein thông qua đƣờng kính của vòng phân giải casein với sự nhận biết dựa vào chất chỉ thị Coomassie Brilliant Blue R-250 (Shivakumar, 2012).
- Lên men lỏng trong môi trƣờng Czapeck Dox có 1% casein với thời gian lên men 48 giờ (Coral et al., 2003).
3.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính protease
Theo phƣơng pháp Anson cải tiến (Anson, 1938) sử dụng casein nhƣ cơ chất. Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với cơ chất là casein, sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt tính protease theo định nghĩa. Hoạt tính của protease đƣợc biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thuỷ phân casein bởi 1mL dung dịch hay 1 mg chế phẩm protease trong thời gian 1 phút ở điều kiện chuẩn (300
C, pH 7,6). Dựa vào Bảng 3.1 xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ tyrosine và xác định định phƣơng trình đƣờng chuẩn của tyrosine. Từ giá trị OD tƣơng ứng với hàm lƣợng tyrosine đã biết, xác định phƣơng trình đƣờng chuẩn của tyrosine và sử dụng để xác định hàm lƣợng tyrosine của các mẫu. Cách thực hiện đo hàm lƣợng tyrosine của mẫu đƣợc tiến hành theo Bảng 3.2.
Từ dung dịch tyrosin chuẩn 1 µM/L, xây dựng đƣờng chuẩn với dung dịch tyrosin có nồng độ từ 0,2 - 1,0 µM/L.
Bảng 3.1: Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ tyrosine
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (mL) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Dung dịch NaOH 0,5N (mL) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (mL) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lƣợng tyrosine (µmol) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 660 nm
Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đƣờng chuẩn tyrosine tƣơng quan tƣơng quan giữa lƣợng tyrosine (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN - ODKC ).
- Xác định hoạt tính protease trong mẫu khảo sát:
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không.
Bảng 3.2: Phƣơng pháp xác định lƣợng tyrosine trong mẫu
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Mẫu Đối chứng
Casein 1% (mL) 5 5
TCA 10% (mL) 0 5
Dịch enzyme mẫu (mL) 1 0
Lắc đều và giữ ở 300C, trong 30 phút
TCA 10% (mL) 5 0
Dịch enzyme mẫu (mL) 0 1
Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (mL) 1 1
Dung dịch NaOH 0.5N (mL) 2 2
Thuốc thử Folin 0,6 0,6
Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bƣớc sóng 660 nm
Từ kết quả đo OD và phƣơng trình đƣờng chuẩn tyrosine, số µmol tyrosine đƣợc xác định và tìm ra hoạt tính của protease trong 1mL dịch trích theo công thức:
x.V.K t.v Hoạt tính protease (U/mL) =
x: số µmol tyrosine suy ra từ đƣờng chuẩn
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 mL) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1mL)
K: độ pha loãng mẫu
t: thời gian phản ứng (30 phút)
1 U (Anson) = 1 µmol Tyrosin/mL/phút hoặc 1 U = 1 µmol/mg/phút.