Mục đích: Khảo sát hoạt tính protease sinh ra từ hai chủng nấm mốc đặc hiệu với 2 tỷ lệ kết hợp thích hợp nhất (từ thí nghiệm 3).
Cách tiến hành: Lên men lỏng trên môi trƣờng Czapeck Dox có bổ sung 1% casein làm nguồn cung cấp protein chính.
Quá trình lên men trong bình tam giác 250 mL chứa 60 mL môi trƣờng Czapeck Dox đƣợc bổ sung 1% casein, thanh trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút. Chủng vào 1 mL huyền phù bào tử nấm (105
cfu/mL) và ủ ở nhiệt độ 30 ± 2°C trong 2 ngày. Enzyme thô thu đƣợc sau quá trình lọc sinh khối bằng giấy lọc Whatman số 1, sử dụng để xác định hoạt tính protease (U/mL) theo phƣơng pháp Anson.
Kết quả thu nhận: Hoạt tính protease thu đƣợc tƣơng ứng, từ đó xác định đƣợc tỷ lệ kết hợp của hai dòng nấm mốc sinh tổng hợp protease hoạt tính cao nhất.
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 TUYỂN CHỌN DÕNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO
Vòng phân giải casein có mối quan hệ với lƣợng protease tiết ra bởi nấm mốc (Vermelho et al., 1996). Do đó, việc khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của 29 dòng A. niger đƣợc đánh giá thông qua đƣờng kính vòng phân giải casein trên môi trƣờng casein – agarose sau 24 giờ ủ ở 30 C. Dựa vào kết quả, các dòng nấm mốc đƣợc phân thành các nhóm với khả năng phân giải casein khác nhau, trong đó 2 nhóm có tỷ lệ đƣờng kính vòng phân giải casein (d) và đƣờng kính vòng phát triển của nấm mốc (d :D) nhỏ hơn 0,6 đƣợc tổng hợp ở bảng 4.1, nhóm có tỷ lệ d : D từ 0,6 đƣợc tổng hợp và thống kê, so sánh sự sai biệt giữa các kết quả, thể hiện ở bảng 4.2.
Từ kết quả tổng hợp ở bảng 4.1 và 4.2 cho thấy khả năng sinh tổng hợp protease của 29 dòng nấm mốc có thể chia ra thành 3 nhóm riêng biệt theo tỷ lệ giữa đƣờng kính vòng phân giải casein (d) và đƣờng kính vòng phát triển của nấm mốc (D) dao động từ 0,39 đến 0,65. Trong đó, khả năng sinh tổng hợp protease đƣợc thể hiện thông qua đƣờng kính vòng phân giải casein và đƣờng kính phát triển cho thấy khả năng phát triền của nấm mốc trên môi trƣờng. Hầu hết các nguồn từ táo Gala, Táo Red Delicious và gừng đều xuất hiện dòng nấm mốc cho hoạt tính protease không cao (thể hiện ở giá trị tỷ lệ d:D nhỏ), đồng thời trong các dòng tuyển chọn (d:D ≥ 0,6), không có dòng nào đƣợc phân lập từ chanh giấy, bƣởi da xanh, hạnh, cam xoàn. Ngƣợc lại, với 2 dòng đƣợc phân lập từ cam sành nhƣng cả hai dòng đều cho hoạt tính protease tƣơng đối cao là Sa2 và Sa3. Với 4 dòng đƣợc phân lập từ táo ta đã thu đƣợc dòng T1 có hoạt tính protease cao. Trong 5 dòng phân lập đƣợc từ sung, dòng S1 thể hiện khả năng sinh tổng hợp protease cao. Điều này góp phần khẳng định tác động của nguồn phân lập đến khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme đặc hiệu, cụ thể ở đây là protease. Từ kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm 1 có thể nhận thấy rằng, với cùng một nguồn phân lập, không phải tất cả các dòng nấm mốc cùng loài đều có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nhất định giống nhau (Sharma et al., 2011).
Bảng 4.1: Các dòng Aspergillus niger có hiệu quả thủy phân casein trung bình và thấp
TT Dòng A. niger Đƣờng kính vòng phân giải casein (vòng halo, d, mm) Đƣởng kính phát triển của nấm mốc (D, mm) Tỷ lệ d:D Nhóm 1(d:D <0,5) 1 Re1 7,800,96 15,921,11 0,490,06 2 Ga4 7,560,32 15,571.30 0,490,03 3 Nga 6,841,22 14,250,73 0,480,05 4 Re3 5,020,75 12,970,69 0,390,06 Nhóm 2 (0,5 d: D<0,6) 5 S3 8,290,59 14,330,87 0,580,06 6 S6 7,850,32 13,560,82 0,580,03 7 S4 7,830,77 13,501,35 0,580,02 8 S5 8,950,61 15,820,77 0,570,04 9 So2 7,110,94 12,751,45 0,560,04 10 T4 8,750,68 15,560,74 0,560,03 11 X3 7,950,74 14,070,76 0,560,03 12 G2 7,651,36 13,750,91 0,560,06 13 Ga2 6,111,24 10,971,22 0,550,07 14 G4 8,470,28 15,401,05 0,550,04 15 Sa3 7,630,95 14,061,29 0,540,03 16 T3 8,581,39 16,071,30 0,530,07 17 H4 6,130,57 11,600,82 0,530,04 18 Re4 7,360.60 13,970,80 0,530,03 19 T2 7,890,55 15,080,70 0,520,02 20 Re2 8,530,89 16,590,72 0,510,04 21 Ga3 7,700,80 15,041,28 0,510,03 22 Ga1 7,361,24 14,561,42 0,500,04
Bảng 4.2: So sánh hiệu quả thủy phân casein của các dòng A. niger mạnh
TT Dòng A. niger Đƣờng kính vòng phân giải casein (vòng halo, d, mm) Đƣởng kính phát triển của nấm mốc (D, mm) Tỷ lệ d:D Nhóm 3 (d:D0,6) 1 Sa2 10,63b0,47 16,38bc0,97 0,65c 0,03 2 R4 10,12b0,41 15,63b0,77 0,65c 0,02 3 R1 10,33b0,49 16,46bc0,89 0,63bc 0,02 4 N1 10,50b0,52 16,96c0,77 0,62ab 0,01 5 V 8,96a0,19 14,50a0,32 0,62ab 0,02 6 S1 10,29b0,43 17,00c0,77 0,61ab 0,02 7 T1 8,42a0,85 13,96a1,27 0,60a 0,02
Các giá trị mẫu tự đi kèm giống nhau ở cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% theo phép thử Duncan ở độ tin cậy 95%
- Ở tỷ lệ d:D <0,5 thể hiện khả năng phân giải casein thấp gồm 4 dòng: Re1, Ga4, Nga, Re3. Thông qua giá trị thu đƣợc về đƣờng kính vòng phân giải nằm trong khoảng 5,027,80mm chứng minh 4 dòng này mang khả năng sinh tổng hợp protease thấp mặc dù đƣờng kính vòng phát triển của nấm mốc tƣơng đối lớn (12,9715,92).
- Ở tỷ lệ (0,5 d:D <0,6) gồm 18 dòng (S3, S6, S4, S5, So2, T4, X3, G2, Ga2, G4, Sa3, T3, H4, Re4, T2, Re2, Ga3, Ga1) với khả năng phân giải casein và phát triển ở mức tƣơng đối. Trong đó, các dòng Re2 và T3 có đƣờng kính vòng phát triển tƣơng đối lớn nhƣng khả năng sinh tổng hợp protease hạn chế làm tỷ lệ d:D không cao. Các dòng này có khả năng sinh tổng hợp protease nhƣng không phải là dòng đặc hiệu.
- Các dòng còn lại có tỷ lệ d:D> 0,6 (bảng 4.2) với vòng phân giải và phát triển lớn gồm 7 dòng: Sa2, R4, N1, R1, V, S1, T1. Đặc biệt dòng Sa2 có tỷ lệ d:D cao nhất trong các dòng khảo sát với đƣờng kính vòng phân giải 10,63mm và đƣờng kính phát triển của nấm mốc là 16,38mm. Và các dòng V, T1 có vòng phân giải casein không cao lần lƣợt là 8,96mm và 8,42mm nhƣng tỷ lệ với sự phát triển của nấm mốc nên tỷ số d:D lớn.
Các dòng trong nhóm d:D >0,6 có khả năng sinh tổng hợp protease lớn và khả năng phát triển mạnh tuy nhiên không có khác biệt về mặt thống kê về giá trị tỷ lệ giữa đƣờng kính vòng halo phân giải casein và đƣờng kính phát triển của nấm mốc thể hiện thông qua bảng 4.1. Các dòng Sa2, R4, R1, N1, V có tỷ lệ d:D cao (d:D ≥ 0,62) nhƣng khả năng sinh tổng hợp protease của các dòng này khác nhau. Đƣờng kính
vòng halo phân giải casein của các dòng Sa2, R4, N1, R1 lớn dao động từ 10,12 đến 10,63 mm nhƣng ngƣợc lại giá trị d của dòng V lại thấp (8,96 mm). Chính vì vậy, các dòng Sa2, R4, N1, R1 đƣợc chọn là các dòng đặc hiệu với khả năng sinh tổng hợp protease.
Hình ảnh minh họa hiệu quả thủy phân protein của 2 dòng A. niger điển hình R4
(hình 4.1 a) và Re4 (hình 4.1 b) cho thấy, đƣờng kính vòng phân giải casein của dòng Re4 khá nhỏ khi so sánh mẫu R4.
(a) (b)
Hình 4.1: Vòng phân giải protease trên môi trƣờng casein - agarose sau 24 giờ ủ ở 30°C và nhận diện với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue R-250 1%
Tính chất nguồn nấm mốc là một trong những yếu tố quan trọng nhất có tác động đến hiệu quả lên men sinh tổng hợp enzyme (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009). Chính vì thế, việc nghiên cứu hoạt hóa sự hoạt động của dòng nấm mốc đƣợc chọn lọc cho từng enzyme cần đƣợc quan tâm. Việc khảo sát sự tƣơng tác của hai dòng nấm mốc cùng loại nhằm tăng cƣờng hiệu quả hoạt động sinh enzyme là bƣớc cơ bản, đầu tiên có thể đƣợc áp dụng (Zhong-Tao et al., 2009).
Trên cơ sở này, đề nghị xác định khả năng kết hợp 4 dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease đạt hiệu quả cao nhất (dòng Sa2, N1, R4, R1).
4.2 KHẢ NĂNG KẾT HỢP DÕNG NẤM MỐC ĐẶC HIỆU ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẬN PROTEASE
Việc khảo sát khả năng kết hợp từng cặp của 4 dòng nấm mốc đặc hiệu đối với hiệu quả thu nhận protease (dòng R4, N1, Sa2, R1) là cơ sở cho việc chọn ra tỷ lệ kết hợp giữa hai dòng nấm mốc thích hợp sinh tổng hợp protease tiếp theo.
Khi quan sát sự phát triển của nấm mốc và sự thay đổi đƣờng kính vòng phân giải casein trên môi trƣờng casein – agarose cho thấy, việc kết hợp hai dòng nấm mốc có cùng hoạt tính thấp (R4 và R1) hay cùng hoạt tính cao (Sa2 và N1) đều tạo nên vòng phân giải dạng tỏa tròn, đồng đều. Trong khi đó, sự kết hợp của một dòng mạnh và một dòng yếu (N1và R4; Sa2và R1;R1 và N1, Sa2 và R4) tạo nên vòng phân giải không đồng đều.
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của dòng nấm mốc Aspergillus niger kết hợp đến hiệu quả thủy phân
casein
TT Dòng A. niger Đƣờng kính vòng phân giải casein (vòng halo, d, mm) Đƣờng kính phát triển của nấm mốc (D, mm) Tỷ lệ d: D 1 N1 10,50a 0,74 17,00c 1,01 0,62a 0,01 2 R1 10,25a 0,20 16,50bc 0,48 0,62a 0,01 3 R4 10,06a 0,31 15,38ab 0,52 0,65b 0,01 4 Sa2 10,56a 0,24 16,00abc 0,41 0,66b 0,03 5 N1+R4 10,75ab 1,17 15,81abc 1,43 0,675bc 0,02 6 R1+N1 11,50bc 0,74 17,00c 0,68 0,68bcd 0,02 7 Sa2+R1 11,50bc 0,61 16,69c 0,94 0,69cd 0,01 8 R1+R4 10,69ab 0,55 15,25a 0,65 0,70de 0,02 9 Sa2+N1 11,50bc 0,54 16,38abc 0,60 0,70de 0,02 10 Sa2+R4 12,13c 0,48 16,94c 1,30 0,72e 0,03
Các giá trị mẫu tự đi kèm giống nhau ở cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% theo phép thử Duncan ở độ tin cậy 95%
Hình ảnh minh họa hiệu quả thủy phân protein của 2 dòng A. niger là R1 và R4 kết hợp cho thấy, đƣờng kính vòng phân giải casein của R1+R4 không có sự khác biệt so với hai dòng R1, R4 riêng lẻ. Điều này có lẽ là do 2 dòng này đều xuất phát từ một nguồn phân lập (bƣởi Năm roi) nên không có sự khác biệt rõ về đặc điểm và không có tác độg kích thích hoạt động , sinh tổng hợp enzyme từ nấm mốc này. Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy, 4 dòng nấm mốc đã tuyển chọn đều có khả năng sinh tổng hợp protease tốt, cụ thể là dòng N1, Sa2 , R4 và R1.
Ở tỷ lệ kết hợp hai dòng nấm mốc là 1 : 1, việc kết hợp hai dòng nấm có cùng hoạt tính thấp (R1 +R4) hay sự kết hợp một dòng yếu (R4) với một dòng mạnh (N1) cũng không cho hiệu quả trong việc cải thiện hoạt tính protease. Đƣờng kính vòng phân giải casein cũng nhƣ hoạt tính protease thu nhận đƣợc đều ở mức tƣơng đồng với dòng đối chứng R1và R4. Trong khi đó, sự kết hợp của hai dòng có hoạt tính mạnh
tƣơng đồng nhau (Sa2+N1) hay các sự kết hợp còn lại giữa một dòng yếu với một dòng mạnh đều cho hiệu quả cải thiện tốt hơn mẫu riêng lẻ.
Hình 4.2: Vòng phân giải casein của 2 dòng A. niger R1+R4 và R1, R4 riêng lẻ.
Đƣờng kính vòng phân giải casein của tổ hợp R1+R4 có giá trị là 10,69 0,55mm không có khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê khi so sánh với hai dòng R1 và R4 riêng lẻ (10,25 0,20mm và 10,06a 0,31mm). Tuy nhiên, trƣờng hợp kết hợp hai dòng có khả năng tổng hợp protease với hoạt tính cao hơn (Sa2 và N1) lại có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê so với hai dòng riêng lẻ tƣơng ứng với đƣờng kính vòng phân giải tăng từ 10,56 0,24mm và 10,5 0,74mm lên đến giá trị 11,50 0,54 mm. Tuy nhiên giá trị tỷ lệ d:D của 2 sự kết hợp trên tƣơng đối cao. Bên cạnh đó, sự kết hợp của hai dòng Sa2 và R4 cho hiệu quả thu nhận protease cao vƣợt trội và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê khi so sánh với các nghiệm thức còn lại. Và giá trị tỷ lệ d:D của sự kết hợp này cũng mang giá trị lớn nhất (0,72) mặc dù không có sự khác biệt so với các dòng kết hợp còn lại. Nghiên cứu của Xiu-Juan Wang et al. (2006) cũng cho thấy sự kết hợp giữa hai dòng sinh tổng hợp protease mạnh nhất (3,385±26 U/g và 1,049±18 U/g) lại không cho hiệu quả cao (1,675±22 U/g). Trong khi đó, sự kết hợp giữa dòng mạnh nhất (3,385±26 U/g) với một dòng yếu hơn (1,030±19 U/g) lại cho kết quả tốt nhất (3,944±34 U/g). Nghiên cứu của Colombatto et al. (2005) đã chứng minh sự tuơng tác của hai dòng đồng khả năng nhằm gia tăng hiệu quả sinh tổng hợp một loại enzyme khác (cellulase). Điều này hoàn toàn phù hợp với quy luật phát triển của vi sinh vật trong quá trình sinh trƣởng và phát triển (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009).
Dựa trên kết quả khảo sát, hai dòng nấm mốc R4 và Sa2 đƣợc lựa chọn để nghiên cứu tỷ lệ kết hợp của hai dòng này trong quá trình sinh tổng hợp protease.
4.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KẾT HỢP HAI DÕNG SA2 VÀ R4 ĐẶC HIỆU THEO TỶ LỆ KHÁC NHAU ĐẾN HIỆU QUẢ SINH TỔNG HỢP PROTEASE
Cặp nấm mốc Sa2 và R4 sẽ đƣợc kết hợp với các tỷ lệ khác nhau nhằm tìm ra tỷ lệ kết hợp tốt nhất cho sự sinh tổng hợp protase. Ảnh hƣởng tỷ lệ kết hợp giữa hai dòng nấm mốc Sa2 và R4 đến khả năng sinh protease đƣợc tổng hợp ở bảng 4.4.
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng Sa2 và R4 đến hiệu quả sinh tổng hợp protease hoạt tính cao
TT Tỷ lệ kết hợp hai dòng A. niger (Sa2:R4)
Đƣờng kính vòng phân giải casein (vòng halo, d, mm) Đƣờng kính phát triển của nấm mốc (D, mm) Tỷ lệ d: D 1 1:1 12,31c 0,43 16,88a 0,25 0,72bc 0,04 2 1:2 12,44c 0,31 16,94a 0,31 0,73bc 0,03 3 1:3 13,13d 0,48 17,31ab 0,38 0,76c 0,03 4 1:4 12,19bc 0,24 17,13ab 0,14 0,71b 0,01 5 2:1 12,63cd 0,43 17,19ab 0,75 0,74bc 0,02 6 3:1 11,50a 0,35 17,81b 0,38 0,65a 0,02 7 4:1 11,63ab 0,78 18,63c 0,92 0,62a 0,04
Các giá trị mẫu tự đi kèm giống nhau ở cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% theo phép thử Duncan ở độ tin cậy 95%
Hình ảnh minh họa hiệu quả thủy phân protein của tỷ lệ 2 dòng A. niger Sa2 : R4
cho thấy, đƣờng kính vòng phân giải casein ở tỷ lệ 1 : 3 lớn hơn và tròn đều hơn những tỷ lệ khác.
Hình 4.3: Vòng phân giải casein ứng với các tỷ lệ khác nhau của hai dòng Sa2 và R4
Từ kết quả thống kê đƣờng kính vòng phân giải casein trên môi trƣờng thạch casein thấy rằng sự thay đổi tỷ lệ kết hợp của hai dòng nấm mốc có sự khác biệt lớn đến hiệu quả sinh tổng hợp protease. Ở các tỷ lệ kết hợp của Sa2 và R4 là 3:1, 4:1 đƣờng kính vòng phân giải protease không đƣợc cải thiện. Khả năng sinh tổng hợp protease ở các tỷ lệ kết hợp này thấp (11,50-11,63mm) và tỷ số d:D thấp. Ở tỷ lệ kết hợp của dòng Sa2 và R4 là 1:4 cho hiệu quả cải thiện hoạt tính enzyme thấp thể hiện ở vòng phân giải casein và giá trị tỷ lệ d:D. Bên cạnh đó, tỷ lệ kết hợp của dòng Sa2
và R4 là 1:1, 1:2 cho hiệu quả cải thiện hoạt tính protease khá cao với giá trị tỷ lệ d:D ở 0,72-0,73. Chỉ ở tỷ lệ sử dụng 1:3 hay 2:1 của hai dòng nấm mốc này, hiệu quả thu nhận protease đạt cao nhất thể hiện ở đƣờng kính phân giải casein lần lƣợt là 13,13 và 12,63mm. Nghiên cứu của Xiu-Juan Wang et al. (2006) cũng tìm ra tỷ lệ 1: 4 của sự kết hợp hai dòng A. niger sinh tổng hợp protease mạnh và yếu cũng nhƣ tỷ lệ 1 : 1 của hai dòng A. niger đồng khả năng là điều kiện kết hợp thích hợp cho sự cải thiện đáng kể sự sinh tổng hợp đồng thời hemicellulase, pectinase, cellulase, glucoamylase và protease.
Dựa vào đƣờng kính vòng phân giải casein, ở tỷ lệ kết hợp 1: 3 có sự khác biệt về mặt thông kê. Tuy nhiên, giá trị tỷ lệ d:D cuả sự kết hợp ở tỷ lệ 1: 3 không có sự khác biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức khác trong thí nghiệm. Mặt khác, ở tỷ lệ kết hợp ở 2:1 thể hiện hoạt tính tƣơng đối cao so với các dòng còn lại về cả
vòng phân giải casein và giá trị kết hợp d: D mặc dù khả năng sinh tổng hợp protease của tỷ lệ kết hợp này thấp hơn so với tỷ lệ kết hợp 1: 3. Từ các kết quả thu nhận cho thấy, việc nghiên cứu tuyển chọn và kết hợp cạnh tranh hai dòng A. niger
trong quá trình sinh tổng hợp protease là có tính khả thi. Hai dòng nấm mốc đặc hiệu đối với protease là A. niger Sa2 và R4 có thể gia tăng hơn nữa hoạt tính protease