NHẤT
Hoạt tính protease đƣợc khảo sát dựa trên quá trình lên men lỏng trên môi trƣờng khoáng – bột mỳ. Ở hai tỷ lệ kết hợp tốt nhất 1 : 3 và 2:1 đƣợc tiến hành quá trình lên men, trích ly enzyme thô. Và hoạt tính này đƣợc xác định thông qua phƣơng pháp Anson cải tiến (1938) với casein là cơ chất. Từ giá trị đo quang phổ dựa và đƣờng chuẩn xây dựng đƣợc (Phụ lục 2), hoạt tính protease đƣợc suy ra. Kết quả về hoạt tính protease đƣợc thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5: Hoạt tính protease sinh ra từ sự kết hợp Sa2 và R4
TT Tỷ lệ kết hợp Sa2 và R4 Đƣờng kính vòng phân giải casein (vòng halo, d, mm) Hoạt tính protease (U/mL) 1 1:0 10,56a 0,24 0,030a±0,005 2 0:1 10,06a 0,31 0,029a±0,003 3 2:1 12,63b 0,43 0,042b±0,005 4 1:3 13,13b 0,48 0,126c±0,016
Các giá trị mẫu tự đi kèm giống nhau ở cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% theo phép thử LSD ở độ tin cậy 95%
Từ kết quả đo hoạt tính ở bảng 4.4 cho thấy ở tỷ lệ kết hợp 1 : 3 và 2 : 1 của hai dòng Sa2 và R4 đều có đƣờng kính vòng phân giải casein có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê so với hai dòng riêng lẻ Sa2 và R4. Ở hai tỷ lệ 1:3 và 2:1 không có sự khác biệt ý nghĩa giữa hai đƣờng kính phân giải casein. Tuy nhiên, đối với hoạt tính protease của hai tỷ lệ kết hợp này có sự khác biệt với nhau về mặt thống kê. Ở tỷ lệ 1: 3 có hoạt tính protase cao hơn rất nhiều (gấp 3 lần) so với tỷ lệ 2:1 khi tiến hành lên men lỏng. Và hoạt tính protease của cả 2 tỷ lệ kết hợp này cũng có sự khác biệt về mặt thống kê so với hai dòng riêng lẻ. Từ đó cho thấy hoạt tính protease của hai dòng Sa2 và R4 với tỷ lệ kết hợp 1 : 3 là cao nhất.
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN
Từ 29 dòng nấm Aspergillus niger ban đầu, sau quá trình tuyển chọn có 4 dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease tốt nhất N1, R1, R4, Sa2.
Việc kết hợp 2 dòng nấm mốc Aspergillus niger theo kiểu tƣơng tác cặp đã chứng tỏ đƣợc hiệu quả cải thiện khả năng sinh tổng hợp protease, dựa trên tỷ lệ đƣờng kính vòng phân giải casein (halo, d) và đƣờng kính sự tăng trƣởng nấm mốc. Trong đó Sa2 và R4 là 2 dòng có tỷ lệ d : D lớn nhất, đồng thời sự phân giải casein cũng nhƣ sự phát triển của nấm mốc đều có sự tăng trƣởng tốt.
Sự kết hợp giữa 2 dòng Sa2 và R4 với tỷ lệ là 1:3 cho hiệu quả sinh tổng hợp protease tốt nhất. Hoạt tính protease thu đƣợc thông qua phƣơng pháp lên men lỏng có bổ sung 1% casein là 0,126±0,016 U/mL.
5.2 ĐỀ NGHỊ
- Nghiên cứu các điều kiện lên men tối thích nhằm tăng hiệu quả sinh tổng hợp protease từ dòng A. niger đặc hiệu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành , 2010, Giáo trình Nấm học,NXB Đại học Cần Thơ, Việt Nam.
Đỗ Thị Bích Thủy, 2012. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sự thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của Bacillus amyloliquefacien N1. Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 71(2): 279-290.
Lê Đức Ngọc, Trịnh Thế Hùng, Võ Sỹ Hùng, Phạm Quý Hải, Vũ Anh Phƣơng, Lã Phúc Cƣờng, 1996. Nghiên cứu protease của bí đao, khảo sát nguồn protease trong bí đao Việt Nam. Tạp chí Hóa học, 34: 7-63.
Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010, Cơ sở Công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, NXB Giáo dục, Việt Nam.
Lê Thị Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng và Lê Thị Lan Chi, 2009, Các phương pháp phân tích ngành Công nghệ lên men,
NXB Khoa học Kỹ thuật, Việt Nam.
Lƣơng Đức Phẩm, 2004, Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội, Việt Nam.
Nguyễn Đức Lƣợng, 2004, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
Nguyễn Hữu Chấn, 1996. Enzyme và xúc tác sinh học, Nhà xuất bản Y học, Việt Nam.
Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi, 2004. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng lên quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp protease của chủng Serratia sp. DT3.
Tạp chí Công nghệ sinh học 2(2): 205-126.
Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998, Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, Việt Nam.
Phạm Thị Trân Châu, Phan Thị Hà, Nguyễn Tuyết Mai, Nguyễn Cẩm Vân, Nguyễn Lân Dũng, 1991. Nghiên cứu enzyme, chất ức chế trypsin nhằm nâng cao chất lƣợng bột dinh dƣỡng cho trẻ em. Tạp chí Khoa học, Trƣờng Đại học Tổng hợp, Hà Nội, Việt Nam: 3.
Phan Thị Bích Trâm, Dƣơng Thị Hƣơng Giang, Hà Thanh Toàn và Phạm Thị Ánh Hồng, 2007. Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các serine protease từ Trùn Quế. Tạp chí Công nghệ sinh học, 5(3): 345-354.
Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh và Nguyễn Thị Thảo, 2007. Tối ƣu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp protease. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(2): 187-196.
Quyền Đình Thi và Trần Thị Quỳnh Anh, 2007. Một số tính chất hóa lý của protease ngoại bào chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(2): 197-203.
Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, 2006. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 9(11): 59-67.
Trần Thanh Trúc, 2013. Phân lập và tuyển chọn một số dòng Aspergillus niger có khả năng sinh pectin methylesterase hoạt tính cao. Luận án Tiến sĩ ngành Vi sinh vật. Đại học Cần Thơ. Cần Thơ.
Vũ Ngọc Bội, 2004. Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme Protease từ B.subtilis S5. Luận án Tiến sĩ ngành Chế biến thủy sản. Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, Trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. TP. Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
Ahmed, I., M.A. Zia, T. Iftikhar and H.M.N. Iqbal, 2011. Characterization and detergent compatibility of purified protease produced from Aspergillus niger by utilizing agro wastes. BioResources, 6 :4505-4522.
Al-Musallam A.A.,1980, Aspergillus helicothrix sp.nov. Antonie van Leeuwenhoek, Journal of Microbiology and Derology, 46: 407– 411.
Aunstrup, K., 1980. Proteinases. In: A. H. Rose (Editors). Microbial Enzymes and Bioconversions: Economic Microbiology. Academic Press. London, UK. 5: 49- 114.
Boyer, P. D., 1971. The Enzymes, Hydrolysis: Peptide Bonds. Vol.3. Academic Press. New York, USA.
Braudo, E. E., A. N. Danilenko, V. T. Dianova, N. G Krokha, 2001. Alternative approaches to manufacture of plant protein products from grain legumes.
Coral, G., B. Arikan, M.N. Ünaldi and H. Güvenmez, 2003. Thermostable alkaline protease produced by an Aspergillus niger strain. Ann Microbiol,3: 491-498. Deepak, V., K. Kalishwaralal, S. Ramkumarpandian, S. V. Babu, S. R.
Senthilkumar and G. Sangiliyandi, 2008. Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology,
Bioresour Technol 99 (17): 8170-8174.
Gams, W., M. Christensen, A.H.S. Onions, J.I. Pitt and R.A. Samson, 1985. Intrageneric taxa of Aspergillus, In: Advances in Aspergillus and Penicillium systematics, New York, 55–62.
Gerritse, S.B., R.R. Shiva, N. Lokeswari and J. Raja, 2007. Optimization of Protease Production from Aspergillus oryzae Sp. using Box-Behnken Experimental Design.E-Journal ofChemistry, 4: 145-153.
Ghazi, S., J. A. Rooke, H. Galbraith, 2003. Improvenment of the nutritive value of soybean meal by protease and alpha-galactosidase treatment in broiler cockerels and broiler chicks. Br Poult Sci, 44(3): 410-418.
Godfrey, T. and S. West, 1996. Industrial Enzymology. 2nd edn., MacMillan Publishers Inc., New York.
Gripon, J. C., B. Auberger and J. Lenoir, 1980. Metalloproteases from Penicillium caseicolum and P. roquefortii: Comparison of specificity and chemical characterization. International Journal of Biochemistry, 12: 451-455.
Haq, I., H. Mukhtar and N. Riaz, 2004. Protease biosynthesis by mutant strain of
Penicillium griseoroseum and cheese formation. Pak. J. Biol. Sci., 7: 1473-1476. Hoffman, T., 1974. Food related enzymes. Adv Chem Ser, 136: 146-185.
Kaul, P., H. A. Sathish, and V. Prakash, 2002. Effect of metal ions on structure and activity of papin from Carica papaya. Nahrung, 46(1): 2-6.
Keay, L. and B. S. Wildi, 1970. Proteases of the genus Bacillus, I. Neutral proteases. Biotechnology and Bioengineering, 12: 179-212.
Keay, L., J. Feder, L. R. Garrett, M. H. Moseley and N. Cirulis, 1971. Bacillus megaterium neutral protease, a zinc-containing metalloenzyme. Biochimica et Biophysica Acta, 229(3): 829-835.
Keay, L., M. H. Mosley, R. G. Anderson, R. J. O’Connor and B. S. Wildi, 1972. Production and isolation of microbial proteases. Biotechnology and Bioengineering Symposium, 3: 63-92.
Klich, M.A., 2002. Identification of common Aspergillus species. Centraalbureau voor Schimmelcultures. The Netherlands: Utrecht.
Kovaleva, G. G., M. P. Shimanskaya and V. M. Stepanov. Site of diazoacetyl inhibitor attachment to acid proteinase of A. awamori, an analog of penicillopepsin and pepsin. Biochemistry Biophysics Research Communication. 1972, 49: 1075-1082.
Kraut, H., E. K. Frey, and E. Werle, 1933. Kallikrein. VIII. The detection and occurrence of kallikrein in blood. Hopp Seylers Z. Physiol. Chem, 222: 73-99. Kristinsson, H. G., B. A. Rasco, 2000. Fish protein hydrolysates: production,
biochemical, and functional properties. Crit Rev Food Sci Nutr, 40(1): 43-81. Malathi, S. and R. Chakraborty, 1991. Production of Alkaline Protease by a New
Aspergillus flavus Isolate under Solid-Substrate Fermentation Conditions for Use as a Depilation Agent. Applied Environmental Microbiology, 57: 712-716. Monhanty, A. K., U. K. Mukhopadhyay, S. Grover, and V. K. Batish, 1999. Bovine
chymosin: production by rDNA technology and application in cheese manufacture. Biotechnol Adv, 17(2-3): 205-217.
Mukhtar, H. and I. U. Haq, 2009. Production of acid protease by Aspergillus niger using solid state fermentation. Pakistan Journal of Zoology, 41: 253-260. Nakagawa, Y., 1970. Alkaline proteinases from Aspergillus. Methods in
Enzymology. 19: 581-591.
Narahara, H., Y. Koyama, T. Yoshida, S. Pichangkura, R. Ueda and H. Taguchi, 1982. Growth and enzyme production in a solid- state culture of Aspergillus oryzae. J Ferment Techno1ogy,69 :311-319.
North, M. J., 1982. Comparative biochemistry of the proteinase of eukaryotic microorganisms. Microbiological Review, 46: 308-340.
Onions, A. H. S., D. Allsopp and H. O. W. Eggins, 1981. Smith’s introduction to industrial mycology, 7th edition., Edward Arnnold, London.
Padmavathi, M. 2013. Identification, Characterization, Optimization. Studies and Applications of Protease Enzyme from Bacillus lichenifirmis. Journal of Chemical, Biological and Physical Sciences, 3: 1920-1926.
Panesar P.S., K. Shweta and R. Panesar, 2010. Potential applications of immobilized β-galactosidase in food processing industries. Enzyme Research, 10: 1–16.
Paranthaman, R., K. Alagusundaram and J. Indhumathi, 2009. Production of Protease from Rice Mill Wastes by Aspergillus niger in Solid State Fermentation. World Journal of Agricultural Sciences, 5 : 308-312.
Patil S.R., and A. Dayanand, 2006. Exploration of regional agrowaste for the production of pectinase by Aspergillus niger. Food Technology and Biotechnology, 44: 289–292.
Qazi, I.J., H. Jamshaid, M. Nadeem and S. S. Ali, 2008. Production of proteases by
Aspergillus niger, through solid state fermentation. Punjab Univ. J. Zool.,
23:037-046.
Radha, S., A. Sridevi, R. HimakiranBabu, V. J. Nithya, N. B. L. Prasad and G. Narasimha, 2012. Medium Optimization for Acid protease production from
Aspergillus sps under Solid state fermentation and mathematical modelling of protease activity. J. Microbiol. Biotech. Res., 2:6-16.
Rao, M. B., A. M. Tanksale, M. S. Ghatge and V. Deshpande, 1998. Molecular and biotechnology aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 597-635.
Raper K. B. and D. I. Femmell, 1965. The genus Aspergillus. Chemistry and Biochemistry Journal, 23: 686–705.
Riffel, A., A. Brandelli, 2002. Isolation and characterization of a feather-degrading bacterium from the poultry processing industry. J Ind Microbiol Biotechnol, 29(5): 255-258.
Samarntarn, W., S. Cheevadhanarak and M. Tanticharoen, 1999. Production of alkaline protease by a genetically engineered Aspergillus oryzae U1521. J Gen Appl Microbiol, 45: 99–103.
Samson R.A,1994, “Current systematic of the genus Aspergillus”, In: The genus Aspergillus: From taxonomy and genetics to industrial applications (eds. Powell K. A., Penwick A. and Peberdy J. F.), Plenum Press, pp. 216–276.
Samson, R.A., P. Noonim, M.Meijer, J. Houbraken, J.C. Frisvad and J.Varga, 2007. Diagnostic tools to identify black aspergilli. Study in Mycology, 59: 129-145. Schechler, I., and A. Berger, 1967. On the size of the active site in protease I
papain. Biochem Biophys Res Commun, 27: 157-162.
Shivakumar, S., 2012. Production and characterization of an acid Protease from a local Aspergillus Sp. by Solid substrate fermentation. Archives of Applied Science Research. 4: 188-199.
Sielecki, A. R., M. Fujinaga, R. J. Read, and M. N. G. James, 1991. Refined structure of pocine pepsinogen at 1.8A resolution. J Mol Biol, 219: 671-692. Singh, J., R.M. Voohra and D.K. Sahoo, 1999. Alkaline protease from a new
obligate alkalophilic isolate of Bacillus sphaericus. Biotechnol Lett., 21:921- 924.
Tremacoldi, C. R., N. K. Watanabe, E. C. Carmona, 2004. Production of extracellular acid protease by Aspergillus clavatus. Wld. J. Microbiol. Biotech., 20: 639-642.
Varela, H., M. D. Ferrari, L. Belobrajdic, A. Vazquez, and M. L. Loperena, 1997. Skin unhairing protease of Bacillus subtilis: production and partial characterization. Biotechnol. Lett, 19: 755-758.
Vishwanatha S. K., A. G. Appu Rao, and S. A. Singh, 2009. Characterisation of acid protease expressed from Aspergillus oryzae MTCC 5341. Food Chemistry, 114: 402–407.
Walti, A., 1938. Crystalline ficin. J. Biol. Chem, 87: 251-257.
Wang, X.J., J.G. Bai, and Y.X. Liang, 2006. Optimization of multienzyme production by two mixed strains in solid-state fermentation. Academic Journal, 73: 533 – 540.
Willstätter, R., W. Grassmann, and O. Ambros, 1926. Blausäure-Aktivierungund- Hemmung pflanzlicher Proteasen. Zweite Abhandlung tiber pflanzliche Proteasen. Z. Physiol. Chemie. 151: 286.
Willstätter, R., E. Bamann, 1929. Über die Proteasen der Magenschleimhaut. Erste Abhandlung über die Enzyme der Leukozyten. Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chemie, 180: 127-143.
Zhong-Tao, S., T. Lin Mao, Cheng L., D.Jin- Hua, 2009. Bioconversion of apple pomace into a multienzyme bio-feed by two mixed strains of Aspergillus niger in solid state fermentation. Electronic Journal of Biotechnology, 12: 1– 13.
Trang web
- Angel Yeast Co.,Ltd. 2011. Product angel acid protease.
http://en.angelyeast.com/contents/1285/20517.html, accessed on 25/08/2013.
- Kojima, K. Kubota, K. Takahashi and M. Tanokura, 2004. The three-dimensional structure of aspergilloglutamic peptidase from aspergillus niger.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=36589, accessed on 27/08/2013.
PHỤ LỤC 1 HÓA CHẤT, DUNG DỊCH ĐỆM SỬ DỤNG
Môi trƣờng và thuốc thử chuẩn bị tuyển chọn A. niger đặc hiệu với protease theo phƣơng pháp đo đuờng kính vòng phân giải protease
- Thuốc thử Coomassie Brilliant Blue: Hòa tan 10mg Coomassie Brilliant Blue vào 50ml etanol 96, thêm 100ml H3PO4 85%, định mức với nƣớc cất đến 1000ml. - Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nƣớc thành 250 ml
- Dung dịch KH2PO4 1/15M: hoà tan 0,9072g KH2PO4 trong nƣớc thành 100ml - Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 đo và chỉnh lại pH cho đúng.
- Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thuỷ 1g casein trong đệm sorensen đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng đệm sorensen cho đủ 100ml.
Các hóa chất sử dụng trong xác định hoạt tính protease
- Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hoà tan 10g TCA trong nƣớc cho đủ 100ml
- Dung dịch NaOH 0,5N: hoà tan 10g NaOH trong nƣớc cho đủ 500 ml - Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25ml HCl đậm đặc với nƣớc cho đủ 250 ml - Dung dịch tyrosin 20mM: khuấy nghiền 0,118 g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml
- Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM: pha loãng 5 ml tyrosin 20mM trong HCl 0,2N thành 100 ml.
PHỤ LỤC 2 CÁC DÕNG NẤM MỐC SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH TUYỂN CHỌN
Nguồn thu nhận Số chủng Ký hiệu mẫu
Cam sành 2 Sa2,Sa3
Cam soàn 1 So2
Hạnh 1 H4
Bƣởi da xanh 1 X3
Bƣởi Năm roi 2 R1,R4
Chanh giấy 2 G2,G4
Chanh núm 1 N1
Táo Red Delicious 4 Re1, Re2, Re3, Re4
Táo Gala 4 Ga 1,Ga 2,Ga 3, Ga 4 Táo ta 4 T 1,T 2,T 3, T 4 Sung 5 S 1,S 3,S 4, S 5,S 6 Đất 1 V (Viện NC & PT CNSH, ĐHCT)
PHỤ LỤC 3 XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN TYROSINE THEO PHƢƠNG PHÁP ANSON CẢI TIẾN (1938)
Kết quả đo OD Nồng độ tyrosine 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 OD 0,0799 0,2561 0,3101 0,5279 0,6440 0,7634 0,9130 1,0099 1,2675 1,2860 1,4670 OD 0 0,1763 0,2303 0,4480 0,5641 0,6835 0,8331 0,9300 1,1876 1,2061 1,3871 Xây dựng đƣờng chuẩn
PHỤ LỤC 4 KẾT QUẢ THỐNG KÊ
- So sánh tính đặc hiệu đối với protease dựa trên đường kính vòng phân giải protein của các dòng nấm mốc thuộc loài A. niger
+Dựa trên đƣờng kính vòng phân giải protease với chỉ thị Coomassie Brilliant Blue R-250 1%, đƣờng kính phát triển nấm mốc, tỷ lệ giữa đƣờng kính vòng phân giải và đƣờng kính phát triển nấm mốc.