TUYỂN CHỌN, NUÔI cấy CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG hợp ENDO β 1,4 GLUCANASE và xác ĐỊNH TÍNH CHẤT lý hóa của nó

MỞ ĐẦU Endoβ1,4glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β1,4glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tƣơng tự khác có cầu nối βglucan. Endoβ1,4glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình. Endoβ1,4glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus). Endoβ1,4glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endoβ1,4glucanase và nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endoβ 1,4glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endoβ1,4glucanase ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endoβ1,4 glucanase.

ĐẠI HỌC THÁI NGUY Ê N TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ P HẠM TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP EN DO- β -1,4- G LU C A N A SE VÀ XÁC Đ Ị N H TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA N Ó L UẬ N VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌ C HÀ NỘI -2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái t nu . e du . v n ĐẠI HỌC THÁI NGUY Ê N TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ P HẠM TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP EN D O - β -1,4- G LU C A N A SE VÀ XÁC Đ Ị N H TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA N Ó Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệ m L UẬ N VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌ C Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và công nghệ V i ệ t Nam HÀ NỘI -2009 MỤC L ỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI L I Ệ U 2 1.1. ĐỊNH NGHĨA 2 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN L O Ạ I 2 1.2.1. Nguồn g ốc 2 1.2.2. Phân loại enzyme 3 1.3. CẤU TRÚC 5 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất 5 1.3.2. Cấu trúc không gian 6 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC 8 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae 10 1.6. Ứng dụng 11 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 11 1.6.2. Trong công nghiệp chế b i ế n thực phẩ m 12 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nu ô i 13 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung m ô i hữu cơ 14 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác t h ả i và sản xuất phân bón vi sinh 14 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ N Ă NG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 16 1.7.1. Nguồn c a r bo n 16 1.7.2. Nguồn nitrogen 17 1.7.3. Nh i ệ t độ nu ô i cấy 18 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH m ô i t r ƣ ờ ng 18 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME 19 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 19 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH 20 1.8.3. Ảnh hƣởng của các i o n kim l oạ i 20 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung m ô i hữu cơ và các chất tẩy rửa 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22 2.1.1. Chủng gi ố ng 22 2.1.2. Thiết bị 22 2.1.3. Hóa c h ấ t 22 2.1.4. Dung d ị c h và đệm phá tế bào 23 2.1.5. Môi tr ƣ ờ ng 24 2.2. PHƢƠNG P HÁ P 25 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme 25 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố m ô i t r ƣ ờ ng l ê n khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 27 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase 29 2.2.6. Điện di S D S -PAGE 30 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của e n do - β -1,4-glucanase 30 2.2.8. Các ph ƣ ơ ng pháp sinh học phân tử 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp e n do - β -1,4- glucanase cao 36 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA 37 3.3. Tối ƣu các đ i ề u kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 39 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo t h ờ i gian 39 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 40 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 41 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ c a r bo n 43 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen 44 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen 45 3.3.7. Nh i ệ t độ nu ô i cấy 46 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nu ô i c ấ y 47 3.4. Tinh sạch sơ bộ e n do - β -1,4-glucanase 48 3.5. Tính chất lý hóa của e n do - β -1,4-glucanase 50 3.5.1. Nh i ệ t độ phản ứng tố i ƣ u 50 3.5.2. pH phản ứng t ố i ƣ u 51 3.5.3. Độ bền nhiệt 52 3.5.4. Độ bền pH 54 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung m ô i hữu cơ 55 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa 56 3.5.7. Ảnh hƣởng của i o n kim loại 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT L U Ậ N 59 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 TIẾNG VIỆT 61 TIẾNG A N H 64 PHỤ LỤC 69 DANH MỤC CÁC B ẢN G Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 22 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 2.3. Danh sách các dung d ị c h và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp e n do - β - 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 42 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 49 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase c ủ a chủng A. oryzae VTCC-F-045 57 Bảng 4. 1 . Đƣờng chuẩn glucose 69 Bảng 4.2. Trình tự nu c l e ot i de của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 69 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo t h ờ i gi a n 70 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh e n do - β -1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 70 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ l a c t o s e tới khả năng sinh e n do - β -1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh e n do - β -1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh e n do - β - 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh e n do - β -1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 74 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase 75 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase 76 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa t ớ i hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính e n do - β -1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại t ớ i hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 78 DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. grisea 7 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea 8 Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase 9 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ c e ll ul a s e 10 Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glu c os e 26 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 29 Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae 36 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). 38 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 39 Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo t h ờ i gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045 40 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp e n do - β - 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 41 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ l a c t os e đến khả năng sinh tổng hợp e n do - β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp e n do - β - 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 46 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 47 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH m ô i t r ƣ ờ ng tớ i khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 48 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 51 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng l ê n hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 52 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 53 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH l ê n độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 54 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung m ô i hữu cơ l ê n độ bền endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 55 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 56 [...]... chất lý hóa của nó Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A oryzae sinh tổng hợp endo- β1 ,4 -glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo- β- 1,4- glucanase ngoại bào từ chủng A oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo- β- 1, 4glucanase CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐỊNH NGHĨA Endo- β- 1,4- glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β- 1,4- glucoside... chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo- β- 1,4- glucanase và nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo- β- 1,4- glucanase và xác định tính chất lý. .. Weight/volume MỞ ĐẦU Endo- β- 1,4- glucanase là một trong ba dạng của cellulase Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β- 1,4- glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β- glucan Endo- β- 1,4- glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình Endo- β- 1,4- glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn... oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et al., 2008) Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo- β- 1,4- glucanase đƣợc gọi là endoglucanase hoặc 1,4 -β- D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4) Endo- β- 1,4- glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase Dạng 2 là exoglucanase, gồm 1,4 -β- D-glucan-4-glucanohydrolase... (46%) và EglB từ chủng A niger (49%) Ở chủng A oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo- β- 1, 4glucanase là CelA và CelB Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron Protein do CelA mã hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H Gene CelB chứa 1248 bp không chứa đoạn intron Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino acid và đƣợc xếp vào... mùn cƣa Những chất này thƣờng đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo- β- 1,4- glucanase Kawamori và cs (1987) khi nghiên cứu trên chủng Thermoascus aurantiacus A-131 và Thermoascus reese QM 9414 cho thấy Avicel là nguồn carbon thích hợp nhất để chủng T reese QM 9414 sinh tổng hợp CMCase, tiếp đến là bã mía, cellulose, lactose, CMC và xylan Trong khi lõi ngô và xylan lại... thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002) 1.3 CẤU TRÚC Endo- β- 1,4- glucanase đƣợc tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau Endo- β- 1,4- glucanase từ nấm A oryzae có khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng A oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng. .. do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS Trình tự amino acid của Cel-1 giống với endo- β- 1,4- glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I Trình tự amino acid của Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo- β- 1,4- glucanase CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase Khối lƣợng phân tử của Cel-1 và Cel-3 giống với CelB và CelA Cel-2 là β- glucosidase (EC... et al., 2002) Ngoài ra, endo- β- 1,4- glucanase cùng các enzyme khác nhƣ exo -β- 1,4glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo- β- 1,4- glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do Sau đó, exo -β- 1,4- glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose Các cellobiase... theo đặc điểm phân tử Endo- β- 1,4- glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3 Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo- β- 1,4- glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng là 62 kDa và 34 kDa Cel-1 và Cel-3 có trình tự . tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase. HỌC SƢ P HẠM TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP EN DO- β -1,4- G LU C A N A SE VÀ XÁC Đ Ị N H TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA N Ó L UẬ N VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌ C HÀ. cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ng oạ i bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4- glucanase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –