Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HỮU QUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI-2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HỮU QUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Quyền Đình Thi

Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học

Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI-2009

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Quyền Đình Thi

trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, CN Đào Thị Tuyết và

tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trường ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như ngày hôm nay

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó !

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009

Học Viên

Nguyễn Hữu Quân

1.6.1 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 11

1.6.2 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 12

1.6.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 13

1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 14

1.6.5 Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 14

1.7 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 16

1.8.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại 20

1.8.4 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa 21

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22

2.2.7 Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 30

2.2.8 Các phương pháp sinh học phân tử 32

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp glucanase cao 36

endo-β-1,4-3.2 Phân loại chủng nấm sợi A oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA 37

3.3 Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 39

3.3.1 Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 39

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 40

3.3.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon 41

3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ carbon 43

3.3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 44

3.3.6 Ảnh hưởng của nồng độ nitrogen 45

3.3.7 Nhiệt độ nuôi cấy 46

3.3.8 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy 47

3.4 Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase 48

3.5 Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 50

3.5.1 Nhiệt độ phản ứng tối ưu 50

3.5.2 pH phản ứng tối ưu 51

3.5.3 Độ bền nhiệt 52

3.5.4 Độ bền pH 54

3.5.5 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ 55

3.5.6 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa 56

3.5.7 Ảnh hưởng của ion kim loại 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 22Bảng 2.2 Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm 23Bảng 2.3 Danh sách các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm 23

Bảng 3.1 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A oryzae 37

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 42

Bảng 3.2 Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A

glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 70

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 71

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 71

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 72

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ bột đậu tương tới khả năng sinh

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 72

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 72

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 73

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 73

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

của chủng A oryzae VTCC-F-045 74

Bảng 4.13 Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase 75Bảng 4.14 Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase 76Bảng 4.15 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

của chủng A oryzae VTCC-F-045 77

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 77

Bảng 4.17 Ảnh hưởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

của chủng A oryzae VTCC-F-045 78

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của

Cel12A từ H grisea 7

Hình 1.2 Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H grisea 8

Hình 1.3 Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase 9

Hình 1.4 Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 10

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gene của A oryzae 11

Hình 2.1 Đường chuẩn glucose 26

Hình 2.2 Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A oryzae VTCC-F-045 29

Hình 3.1 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A oryzae 36

Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C) 38

Hình 3.3 Cây phân loại chủng A oryzae VTCC-F-045 39

Hình 3.4 Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A oryzae VTCC-F-045 40

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp 1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 41

β-Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 44

endo-Hình 3.7 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp 1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 45

endo-β-Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ bột đậu tương đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 46

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 47

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 48

Hình 3.11 Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của

chủng A oryzae VTCC-F-045 (B) 49

endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 51

Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở

M Marker (thang protein chuẩn)

PCR Polymerase chain reaction

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane

MỞ ĐẦU

Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tương tự khác có cầu nối β-glucan Endo-β-1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình

Endo-β-1,4-glucanase được sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau như động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt ngũ cốc như đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật Tuy nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật Vi sinh vật sinh enzyme hết sức

đa dạng như nấm sợi (Aspergillus niger, A oryzae, A aculeatus, Trichoderma

viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus)

Endo-β-1,4-glucanase được ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác nhau như công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh

Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài:

Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A oryzae sinh tổng hợp

endo-β-1,4-glucanase cao; b) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-endo-β-1,4-glucanase

ngoại bào từ chủng A oryzae và xác định tính chất hóa lý của

endo-β-1,4-glucanase

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐỊNH NGHĨA

Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose Enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh mẽ trên cellulose vô định hình

1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 1.2.1 Nguồn gốc

Endo-β-1,4-glucanase được thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn) Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu được nhiều lần trong năm và chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng như dễ dàng điều khiển có định hướng nguồn enzyme hoặc gia tăng lượng enzyme Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phương pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi bật mà các đối tượng động vật, thực vật ít áp dụng như gây đột biến nhân tạo

Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng sinh

endo-β-1,4-glucanase như Bacillus subtilis, B licheniformis, B pumilis (Gordon et

al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999, Nguyễn Lan

Hương and Hoàng Đình Hòa, 2003) Ngoài ra còn có các loài ưa kiềm như

Cephalosporium sp RYM-202 (Kang and Rhee, 1995)

Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lượng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và

Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme

Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus như A.niger (Coral et al., 2002, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A candidus (Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A flavus (Ojumu et al., 2003),

A fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A oryzae và các chủng Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cường and

Nguyễn Đức Lượng, 2003) đều có khả năng sinh enzyme Các nhóm thuộc

chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá, 2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao

1.2.2 Phân loại enzyme

1.2.2.1 Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế

Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng enzyme của hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương

tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et

al., 2008)

Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4) Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase Dạng 2 là exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio

hydrolase) (EC 3.2.1.91) Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose

(cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002)

1.2.2.2 Phân loại theo đặc điểm phân tử

Endo-β-1,4-glucanase được phân chia dựa vào đặc điểm phân tử như khối lượng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể.

Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzyme thủy phân cellulose được chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3 Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lượng là 62 kDa và 34 kDa Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS Trình tự amino acid của Cel-1 giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có độ tương đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I Trình tự amino acid của Cel-3 có độ tương đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase Khối lượng phân tử của Cel-1 và Cel-3 giống với CelB và CelA Cel-2 là β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối lượng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của

Cel-2 chưa được xác định (Yamane et al., 2002)

Khi nghiên cứu trên A niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase (CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, cả hai enzyme này đều thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7); trong đó CbhB bao gồm cấu

trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi các amino acid

giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên kết

peptide Sự phiên mã của gene CbhA và CbhB được cảm ứng bởi D-xylose Ở chủng A kawachi, (Hara et al., 2003) đã phát hiện ba gene mã hóa

endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A Trong đó, cel5A và cel61A có liên kết CBD1; còn cel5A và cel5B thuộc glycosyl hydrolase nhóm 5 (GH5), cel5B có cấu trúc rất giống cel5A, nhưng thiếu CBD1 và sự liên kết Cel5A gồm 4 đoạn intron, cel5B gồm 5 đoạn intron, còn cel61A thuộc nhóm GH61 không có intron

Dựa vào cấu trúc bậc một cơ bản, phức cellulase được chia làm 6 họ là

A, B, C, D, E và F (Henrissat et al., 1989) Dựa vào trung tâm xúc tác phức cellulase được chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes et al.,

1991) Hiện nay, cellulase được xếp thành 12 họ khác nhau là 5, 6, 7, 8, 9, (10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74 Trong đó, họ 9 chứa cellulases của vi khuẩn (hiếu khí và kỵ khí), nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm

hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002).

1.3 CẤU TRÚC

Endo-β-1,4-glucanase được tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần

cấu tạo và cấu trúc khác nhau Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A oryzae có khối lượng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng

A oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A terreus

M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008)

1.3.1 Cấu trúc bậc nhất

Nghiên cứu của Nozaki và cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase

thuộc họ 5 (GH 5) chứa CBM ở đầu nitơ, có trọng lượng phân tử khoảng

44 kDa và được gọi là ThEG ThEG từ chủng Trametes hirsuta là một chuỗi

polypeptide có chứa 384 amino acid và có độ tương đồng cao với En-1 từ

chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) và EglB từ chủng A niger (49%)

Ở chủng A oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân

tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là CelA và CelB Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron Protein do CelA mã hóa gồm 239 amino acid và được xếp vào họ cellulase H Gene CelB chứa 1248 bp không chứa đoạn intron Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino acid và được xếp vào họ cellulase C Sau khi tinh sạch, protein của CelA và CelB có khối lượng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa

Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có

những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên các chuỗi α, β và các vùng nối

1.3.2 Cấu trúc không gian

Phân tử Cel12A được cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β là A và B Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β (B1-B9) Hai phiến này xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp Bề mặt lõm của phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề mặt của enzyme Trung tâm hoạt động của enzyme là hai gốc glutamyl 120 và

205 ở chủng H grisea Sáu gốc phía ngoài phân bố phía trên phân tử giống

như gài các amino acid tự do Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu nitơ Các dải xoắn β được nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ 29-32, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tương ứng với chuỗi β: B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7 Ba gốc cysteine là C175, C206 và C216 được định vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4 Các chuỗi bên tập

trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác được tăng lên

(Hình 1.1)

Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn α Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến β, liên kết với 6 amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực vanderval Liên kết giữa các amino acid có kích thước từ 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.2A) Gốc cysteine 206 nằm gần trung tâm xúc tác Glu 205 trên chuỗi B4 Đầu của chuỗi bên ở lõi phiến β, nơi có hệ thống tương tác chặt chẽ với các chuỗi bên của 8 gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204; cùng với sự tách rời giữa các nguyên tử trong chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.2B)

Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề mặt xúc tác của enzyme Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên dưới điểm hoạt động, nơi tương tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89, F214 và F219 có kích thước từ 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.2C)

Hình 1.1 Cấu trúc không gian từ trên xuống (A)

và từ bên sang (B) của Cel12A từ H Grisea (Sang et al., 2003)

Hình 1.2 Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H Grisea

1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC

Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau Tuy nhiên, để thủy phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau

Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose) Sau đó các sợi

này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải

phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cơ chế thủy phân cellulose (A)

và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002)

Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4)

exo-β-1,4-Hình 1.4 Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase

1.5 Khái quát về Aspergillus oryzae

A oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002)

Bào tử của A oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin

A oryzae tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như cellulase, pectinase,

xylanase và hemicellulase khi sống trên môi trường có nguồn cơ chất tương

ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose Nên A oryzae đã được ứng

dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công

nghiệp sản xuất các enzyme Ở Nhật Bản A oryzae được sử dụng trong quá

trình sản xuất thức ăn như xì dầu, rượu sakê và trong công nghiệp sản xuất enzyme như amylase, protease, hemicellulose, cellulase, oxidoreductase,

lipase, phytase và pectinase Ở Việt Nam A oryzae được sử dụng chủ yếu

trong quá trình làm tương

Năm 2001, bộ gene di truyền của A oryzae đã được phân tích và giải mã Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base (Galagan

et al., 2005, Machida et al., 2005) (Hình 1.5)

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gene của A Oryzae (Machida et al., 2005)

1.6 Ứng dụng

Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase được ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau như công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh

1.6.1 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần

hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn

trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004)

1.6.2 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm

Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt được nghiền, thu được thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu được dịch quả Dịch này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất quan trọng Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa Sự kết hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó

giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả

năng lọc và gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004)

Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượng thẫm mầu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng

thời cản trở cho việc bóc vỏ Khi sử dụng chế phẩm A niger có tên thương

mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

1.6.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc Ngoài protein, lipit, chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate Trong đó, các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các chất dinh dưỡng Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dưỡng như protein, tinh bột và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh

dưỡng này Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật

Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc Trong lĩnh vực này, nấm sợi thường được sử dụng lên men các nguồn phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lượng các amino acid cân đối, các vitamin và tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi (Đặng

Thị Thu et al., 2004, Vũ Duy Giảng, 2009)

1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột

với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5% (Đặng Thị Thu et

al., 2004)

1.6.5 Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh

Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải

Sau khi nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ưa

nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải (Lý Kim Bảng et al., 1999) đã tuyển chọn được

3 chủng xạ khuẩn, 4 chủng vi khuẩn ưa nhiệt trong bể rác thải có khả năng

phân giải cellulose mạnh Đặng Minh Hằng (1999) cũng phân lập được 2 chủng nấm có khả năng phân giải cellulose mạnh và đã tối ưu được các điều kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase Hai mươi chủng xạ khuẩn, 40 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã được phân lập và khi bổ sung các chủng đó vào bể ủ sẽ rút ngắn thời gian ủ 5-7

ngày (Nguyễn Lan Hương et al., 1999) 192 chủng xạ khuẩn có khả năng phân

giải cellulose đã được phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm mục, gỗ mục; trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh chiếm 42%

(Phạm Thị Ngọc Lan et al., 1999) Nguyễn Lan Hương và Hoàng Đình Hòa (2003) cũng đã phân lập được 15 chủng Bacillus có hoạt tính CMCase từ các

mẫu rác sinh hoạt chứa cacboxymetyl cellulose

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất Chế phẩm Micromix 3 được tạo ra bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao đã được bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí sẽ rút ngắn được thời gian ủ 15 ngày, giảm một nửa thời gian lên men, đồng thời lượng mùn tạo thành cũng cao hơn 29% và

các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng (Lý Kim Bảng et al.,

1999)

Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao (Trần Đình Toại and Trần Thị Hồng, 2007)

1.7 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Nấm sợi A oryzae chủ yếu sống hoại sinh phân giải nguồn cơ chất trong

môi trường nơi chúng sống dựa vào hệ enzyme ngoại bào do chúng tiết ra để sinh trưởng và phát triển Tốc độ tiết enzyme phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, nguồn carbon và nguồn nitrogen

1.7.1 Nguồn carbon

Tùy loài vi sinh vật mà nguồn carbon được sử dụng để sinh glucanase là khác nhau, có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài lại thích hợp với nhiều nguồn carbon Nguồn carbon có thể là các loại carbohydrate đơn giản như đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như tinh bột, cellulose, xylan Nguồn carbon phức tạp này thường tồn tại ở hầu hết các sản phẩm, phế phẩm như trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bã mía, vỏ cà phê, mùn cưa Những chất này thường được sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

endo-β-1,4-Kawamori và cs (1987) khi nghiên cứu trên chủng Thermoascus

aurantiacus A-131 và Thermoascus reese QM 9414 cho thấy Avicel là nguồn

carbon thích hợp nhất để chủng T reese QM 9414 sinh tổng hợp CMCase,

tiếp đến là bã mía, cellulose, lactose, CMC và xylan Trong khi lõi ngô và

xylan lại là nguồn carbon thích hợp cho chủng T aurantiacus A-131 sinh tổng hợp CMCase (Kawamori et al., 1987) Nguồn phế phẩm từ quả cam ngọt

(vỏ, cùi) đã được sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh

cellulase ở chủng A niger, T longi và Saccharomyces cerevisae (Omojasola and Jilani, 2008) Các loài Penicillium pinophilum, P persicium, P

brasilianum sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự

nhiên, còn đối với nguồn carbon là xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng

sinh tổng hợp cellulase rất kém (Henning et al., 2005) Lê Thị Thanh Xuân và cs (2005) khi nghiên cứu chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces cho thấy

chúng sinh trưởng mạnh nhất trên nguồn carbon là glucose và tinh bột, nhưng nguồn carbon thích hợp để chủng sinh tổng hợp cellulase là cellulose và

CMC Trịnh Đình Khá (2006), khi nghiên cứu chủng Penicillium sp

DQT-HK1 cho thấy, chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trên nguồn carbon là rơm với nồng độ 0,6%

1.7.2 Nguồn nitrogen

Nguồn nitrogen ảnh hưởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi sinh vật Nguồn nitrogen tồn tại ở dạng vô cơ như urea, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử như cao thịt, cao thịt bò, bột đậu tương, bột cá hay peptone Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitrogen được sử dụng là khác nhau Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitrogen để

sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài Tang và cs (2004) khi tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng B subtilis nhận thấy nguồn nitrogen vô cơ không thích

hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase; còn nguồn nitrogen là cao nấm men và bột đậu tương rất thích hợp cho khả năng sinh

enzyme (Tang et al., 2004) Nguồn nitrogen là urea và bột đậu tương ảnh hưởng mạnh mẽ tới quá trình tổng hợp cellulase của chủng A niger NRRL-363 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003); Acharya và cs (2008) khi nghiên cứu trên chủng A niger cho thấy peptone, ammonium sulfate và urea là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng A niger sinh tổng hợp cellulase Ở

một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt nguồn nitrogen vô cơ là KNO3 thích hợp cho

tổng hợp cellulase mạnh nhất (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) Bột đậu tương là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng Penicillium sp DQT-HK1 sinh

tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006)

1.7.3 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung

và của nấm mốc nói riêng Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt

độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm là nhóm vi sinh vật ưa lạnh và chịu lạnh; nhóm vi sinh vật ưa ấm và nhóm vi sinh vật chịu nhiệt Các loài ưa lạnh sinh trưởng được trong điều kiện nhiệt độ dưới 15°C; các loài ưa ấm sinh trưởng và phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37°C Các loài chịu nhiệt sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50°C Khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endo-β-

1,4-glucanase cho thấy, ở chủng vi khuẩn B subtilis nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme là 37°C (Tang et al., 2004) Đối với các chủng vi

khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt thì nhiệt độ thích hợp để các chủng này sinh

enzyme cao từ 45-55°C (Nguyễn Lan Hương et al., 1999, Tăng Thị Chính et

al., 1999) Ở các chủng nấm mốc nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp

endo-β-1,4-glucanase nằm trong khoảng từ 28-50°C (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Ojumu et al., 2003, Narasimha et al., 2006, Omojasola and Jilani, 2008) Chủng Penicillium sp DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase tối đa ở nhiệt độ

30°C (Trịnh Đình Khá, 2006)

1.7.4 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, trung tính hay kiềm pH thích hợp đối với các chủng vi khuẩn ưa ấm sinh tổng hợp cellulase là 6,5-7,0 và pH tối ưu là 7,0; còn các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt là 7,0-7,5 và pH

tối ưu là 7,5 (Trần Đình Toại et al., 2008) Chủng Bacillus sinh tổng hợp mạnh

nhất ở pH 7,5 Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp

cellulase mạnh trong môi trường có pH ban đầu là 8,0 (Tăng Thị Chính et al., 1999) Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus lại thích hợp ở pH trung tính

(Nguyễn Đức Lượng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999) Các chủng nấm

Aspergillus lại thích hợp trong khoảng pH từ 4,5-6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999,

Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani,

2008)

1.8 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME

Mỗi loại enzyme được tổng hợp từ các loài khác nhau có cấu trúc và hoạt tính sinh học khác nhau Nhiệt độ, pH, các dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa hay các ion kim loại có ảnh hưởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme

1.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp và khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50°C Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0°C hoạt độ của enzyme giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích

hợp Endo-β-1,4-glucanase gồm Cel 1 và Cel 3 từ chủng A oryzae hoạt động

mạnh nhất ở nhiệt độ lần lượt là 50C và 60C (Fukuda et al., 2002) 1,4-glucanase gồm Cel A và Cel B từ chủng A oryzae KBN616 có hoạt tính

Endo-β-mạnh nhất ở nhiệt độ lần lượt là 55C và 45C (Kitamoto et al., 1996) Endoglucanse III từ Trichoderma reesei có hoạt tính tối đa đạt 55C (Macarron

et al., 1993), nhiệt độ tối ưu của -glucosidase từ chủng Trichoderma reesei QM 9414 và chủng Trametes hirsuta là 50C (de la Mata et al., 1992, Nozaki

et al., 2007)

1.8.2 Ảnh hưởng của pH

Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trường, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các enzyme mà pH thích hợp có thể là trung tính, kiềm hoặc là acid Endo-β-1,4-glucanase do các loài khác nhau có pH tối ưu khác nhau Theo những nghiên cứu trước đây, pH

thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng A niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất là 5,5 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003) Endo-β-1,4-glucanase của Chủng Trametes hirsuta là 5,0 và chủng A oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lượt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002) CMCase của A niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002)

1.8.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại

Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme có độ bền rất lớn; đồng thời các ion kim loại này tạo ra một dạng thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn được với cơ chất Do đó tốc độ thủy phân của enzyme được tăng lên Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của enzyme Theo những nghiên cứu trước đây cho thấy, các ion kim loại như Cu2+

; Hg2+, Ag+ức chế mạnh hoạt tính của các enzyme như xylanase, endoglucanase, mannanase, protease, cellulase (Nguyễn Thị Thảo, 2005, Trịnh Đình Khá,

2006, Đỗ Thị Tuyên et al., 2008, Gao et al., 2008) Trong khi đó ion Ca2+

làm

tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp D04 lên 40% so với đối chứng, Mg2+

làm giảm nhẹ hoạt tính (chỉ đạt 92%) và Zn2+

ức chế mạnh hoạt tính so với

đối chứng (đạt 37%) (Sang et al., 1995) Chinedu và cs (2008) nghiên cứu trên chủng Penicillium chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+

và Fe2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% và 162%); trong khi Mg2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+ và EDTA ức chế mạnh hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và 43% với Hg2+

) (Chinedu et al.,

2008)

1.8.4 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa

Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất mạnh tới hoạt tính của enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa là khác nhau Trịnh Đình Khá (2006) khi nghiên cứu trên

chủng Penicillium sp DTQ-HK1 cho thấy các chất tẩy rửa Tween 20, Tween

80, Trixton X-100, SDS đều làm giảm hoạt tính của cellulase và SDS làm giảm mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% Các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, isopropanol và aceton) đều ức chế hoạt tính cellulase, riêng n-butanol ức chế mạnh mẽ hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63% Đỗ Thị

Tuyên và cs (2008) các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol không ảnh hưởng mạnh tới hoạt tính xylanase từ chủng A ozyzae DSM1863,

riêng n-butanol làm tăng và aceton làm giảm nhẹ hoạt tính xylanase Tween 20 và Triton X-100 không ảnh hưởng mạnh ở nồng độ thấp (0,2-1%) nhưng làm giảm hoạt tính xylanase ở nồng độ cao 2%, trong khi đó SDS làm giảm hoạt tính enzyme mạnh ở tất cả các nồng độ

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Chủng giống

Ba mươi lăm chủng nấm A oryzae do Viện vi sinh vật và Công nghệ

sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp được sử dụng để tuyển chọn chủng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất

2.1.2 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm Tên thiết bị Hãng sản xuất

Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ) Việt Nam

Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức)

Tủ lạnh 4C, -20C, -80C Toshiba, Sanyo (Nhật bản)

2.1.3 Hóa chất

Các hóa chất dùng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết (bảng 2.2)

Bảng 2.2 Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

Dung dịch APS 10% ammonium persulfate

Dung dịch arsenomolypdate 5% (w/v) ammonium molybdate; 5% (v/v) H2SO4 đặc; 0,6% (w/v) Na2HAsO4.7H2O

Dung dịch muối B 15% CuSO4.5H2O; thêm vài giọt H2SO4 đặc

Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue; 30% (v/v)

methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide

Dung dịch phá tế bào 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0 Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K

Dung dịch RNase 10 μg/ml Rnase

Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic

Dung dịch Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8,0 Dung dịch Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS

Dung dịch Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4 Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH

Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol

Hỗn hợp muối AB Dung dịch muối A: dung dịch muối B = 25:1

2.1.5 Môi trường

Các chủng A oryzae được nuôi cấy trong 3 ml môi trường khoáng

(MTK): 0,1% (w/v) peptone; 0,2% (w/v) KH2PO4; 0,03% (w/v) CaCl2.2H2O; 0,14% (w/v) (NH4)2SO4; 0,03% MgSO4.7H2O; 0,1% (w/v) cao nấm men; 1 ml dung dịch muối (18 mM FeSO4; 6,6 mM MnSO4; 4,8 mM ZnSO4.7H2O; 15 mM CoCl2); pH 6,5 khử trùng (Hong et al., 2001)

Cazpek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4; 0,05% (w/v) KCl; 2% sucrose; pH 6,5 khử trùng Môi trường đặc bổ sung 2% (w/v) agar

Chủng E coli DH5α được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria-Bertani):

1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 6,5 khử trùng, với môi trường đặc bổ sung 2% (w/v) agar Đối với việc chọn chủng mang plasmid tái tổ hợp, môi trường được bổ sung 100 μg/ml ampicillin

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme

Chủng nấm A oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase được nuôi cấy

trong môi trường khoáng MTK chứa 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng ở nhiệt độ 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ

2.2.2 Định tính endo-β-1,4-glucanase

Hoạt tính enzyme được định tính theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong nước cất dày khoảng 0,5 cm, được đục lỗ đường kính 0,5 cm Năm mươi μl dịch enzyme được cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong 4C cho enzyme khuếch tán Sau đó, đĩa thạch được ủ 4-6 giờ ở 37C lấy ra và nhuộm bằng lugol 1% Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tương đối của enzyme

2.2.3 Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

Hoạt tính enzyme được xác định theo phương pháp định lượng đường khử của Nelson/Samogi (Nelson N, 1944) Đơn vị hoạt độ là lượng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đường khử tương đương 1 l glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm

Xây dựng đường chuẩn: Glucose được pha trong 100 mM đệm natri

acetate pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100 µg/ml Một ml dung dịch glucose chuẩn được đo ở bước sóng 660 nm Độ hấp phụ và nồng độ

glucose được vẽ theo chương trình Excel Kết quả cho thấy, đường nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 20-90 µg/ml Đường chuẩn có phương trình y = 0,0064x - 0,0024 Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 660 nm, x là nồng độ glucose (µg/ml) (Hình 2.1)

Hình 2.1 Đường chuẩn glucose

Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC pha trong

100 mM đệm natri acetate pH 5,0 được cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dịch enzyme Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50C sau đó bổ sung ngay các hóa chất định lượng đường khử tạo thành

Ống kiểm tra: Hút 0,5 ml cơ chất CMC, thêm các hóa chất định lượng

đường khử, sau đó bổ sung 0,5 ml dịch enzyme và tiến hành định lượng đường khử ngay

Một ml dung dịch cần định lượng đường khử được cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml hỗn hợp muối AB Hỗn hợp được đun sôi cách thủy đúng 20 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 1 ml dung dịch asenomolybdate lắc đều đến khi hết bọt khí Sau đó hỗn hợp được ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa

y = 0.0064x - 0.0024

00.20.40.6

cơ chất còn dư và so màu ở bước sóng 660 nm Mẫu đối chứng thay dung dịch cần định lượng đường khử bằng nước cất Đối chiếu với đồ thị chuẩn suy ra hàm lượng đường khử

2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

2.2.4.1 Khảo sát thời gian sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

Chủng A oryzae VTCC-F-045 được nuôi cấy trong môi trường MTK

pH 6,5 ở 30C, có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24-56 giờ (cách nhau 12

giờ) để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

2.2.4.2 Tối ưu nồng độ cơ chất cảm ứng

Chủng A oryzae VTCC-F-045 được nuôi cấy trong môi trường MTK

pH 6,5 ở 30C và bổ sung cơ chất CMC ở các nồng độ khác nhau 0,5; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 2,7 Dịch enzyme được thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính

2.2.4.3 Tối ưu nguồn carbon

Chủng A oryzae VTCC-F-045 được nuôi trong môi trường MTK

pH 6,5 ở 30C và bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng Trong đó, nguồn cao nấm men được thay bằng các nguồn carbon khác là lactose, glucose, lõi ngô, bã mía, vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cám, CMC, vỏ quýt ở cùng nồng độ ban đầu (0,1%) Dịch enzyme được thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính

Sau khi xác định được nguồn carbon tốt nhất, để tối ưu nồng độ

carbon, chủng A oryzae VTCC-F-045 được nuôi trong môi trường MTK

pH 6,5 ở 30C có nồng độ carbon khác nhau: 0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau 0,2%) Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme được xác định

2.2.4.4 Tối ưu nguồn nitrogen

Trong môi trường MTK nuôi cấy chủng nấm A oryzae VTCC-F-045 ban

đầu, nguồn nitrogen sử dụng là peptone nhưng không phù hợp để sản xuất chế phẩm enzyme do giá thành chi phí sản xuất rất cao Với mục tiêu là sử dụng nguyên liệu sẵn có, peptone được thay thế bằng các nguồn nitrogen khác như NaNO3, (NH4)2SO4, bột cá, bột đậu tương, urea với cùng nồng độ ban đầu (0,1%), bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng và nguồn carbon đã được tối ưu ở 30C, pH 6,5 Dịch enzyme được thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính

Sau khi xác định được nguồn nitrogen tốt nhất, để tối ưu nồng độ nitrogen

chủng A oryzae VTCC-F-045 được nuôi trong môi trường có nồng độ nitrogen

khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 1,5; 1,8 và 2% Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme được xác định

2.2.4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Chủng A oryzae VTCC-F-045 được nuôi cấy trong môi trường MTK bổ

sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng cùng nguồn carbon và nitrogen đã được tối ưu, nuôi lắc 200 vòng/phút ở pH 6,5 và các nhiệt độ khác nhau: 28, 30 và 37C Dịch enzyme được thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính

2.2.4.6 Ảnh hưởng của pH môi trường

Chủng nấm A oryzae VTCC-F-045 được nuôi cấy 120 giờ trong môi

trường MTK có pH thay đổi từ 3,5-8,5 ở 28C, lắc 200 vòng/phút để xác định pH môi trường tối ưu

2.2.5 Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase

Dịch enzyme thô ↓

Ly tâm 10 phút ở12500 vòng/phút ↓

Dịch trong ↓

Tủa muối ammonium sulfate 65% ↓

Thẩm tích loại muối ↓

Qua cột Sephadex G100 ↓

Enzyme tinh sạch

Hình 2.2 Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A oryzae VTCC-F-045

Bốn mươi ml dịch enzyme sau khi ly tâm 10 phút ở 12500 vòng/phút được tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và để ở 4C qua đêm Sau khi ly tâm thu tủa ở 12500 vòng/phút, tủa được hòa vào đệm 100 mM acetate

pH 5,5 và thẩm tích loại muối (Hong et al., 2001) Để thấm tích loại muối,

15 ml mẫu được hút vào trong túi thẩm tích đã hoạt hóa và kẹp chặt hai đầu Cho túi vào cốc chứa 200 ml nước cất có khuấy từ liên tục và đặt cốc vào trong đá Sau 3 giờ mẫu được thay nước một lần để loại muối Dịch tủa sau khi loại muối đưa qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 Cột có kích thước 2,6 x 60 cm Cột được cân bằng với đệm phosphate 50 mM, pH 7,5 Tốc độ chảy là 25 ml/h Thể tích mỗi phân đoạn được thu 2 ml (thu 20 phân đoạn) Hàm lượng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn