28S rRNA
DNA của A. oryzae VTCC-F-045 sau khi tách chiết, đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 % cho thấy DNA tinh sạch và đủ để tiến hành nhân dòng và đọc trình tự. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi NL1 và NL4. Sau khi điện di, một vạch có kích thƣớc khoảng 614 bp xuất hiện (Hình 3.2A).
Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vector pJET1.2 sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5. Các dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc chọn lọc và cắt
kiểm tra bằng enzyme hạn chế XhoI và XbaI. Sản phẩm cắt kiểm tra trên gel 0,8% agarose (Hình 3.2C) có 2 băng DNA kích thƣớc khoảng 2974 bp tƣơng ứng với vector pJET1.2 và băng còn lại có kích thƣớc khoảng 600 bp tƣơng ứng với đoạn DNA ngoại lai.
A B C
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C).
P1: plasmid mang gene 28S rRNA; ĐC: plasmid không mang gene 28S rRNA Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene mong muốn đã đƣợc tách và tinh sạch bằng kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide. Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, nhận đƣợc đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 dài 614 bp (Bảng 4.2).
Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc so sánh với trình tự gene 28S rRNA của các chủng nấm sợi đã công bố trên GenBank bằng phần mềm DNAstar. Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng
A. oryzae VTCC-F-045 có quan hệ họ hàng gần gũi với một số đại diện thuộc
chi Aspergillus. Trong đó, có độ tƣơng đồng 99,7% với các chủng A. oryzae
RIB40 (AP007172), A. flavus IFM (AB363745), A. oryzae NRRL 506
ĐC P1 M 1 2 750 500 250 1000 614 bp 1500 3000 750 500 250 1000 1500 3000 614 bp
(AF459735), A. parasiticus NRRL 6433 (EF661568), A. oryzae MN (GQ38275), A. flavus UWFP 570 (AY216669) và A. parasiticus NRRL 424 (EF661557) (Hình 3.2). Trình tự 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F- 045 đã đƣợc đăng kí trong GenBank với mã số là GQ382276.
Nucleotide Subs titutions (x100)
0 0.2 Ap68 Ap57 Ao35 Af69 Ao75 Ao72 Af45 Ao76
Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045
Ao68: A. parasiticus NRRL 6433, Ap57: A. parasiticus NRRL 424, Ao75: A. oryzae MN; Af69: A. flavus UWFP570; Af45: A. flavus IFM 5436; Ao35: A. oryzae NRRL 506; Ao76:
A. oryzae VTCC-F-045, Ao72: A. oryzae RIB40