Tuyển chọn nuôi cấy chủng aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1, 4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1, 4-glucanase

Tuyển chọn nuôi cấy chủng aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1, 4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1, 4-glucanase

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

NGUYỄN VĂN TUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

THÁI NGUYÊN- 2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

NGUYỄN VĂN TUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Quyền Đình Thi

Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học-

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

THÁI NGUYÊN - 2009

LỜI CẢM ƠN!

Trước hết tôi xin gửi lời cảm Sâu sắc tới TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm khoa Khoa học Cơ bản, Trường đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi đi học

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.

Thái Nguyên tháng 9 năm 2009 Học viên

Nguyễn Văn Tuân

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulphate BSA Bovine serum albumin CMC Carboxyl methyl cellulose

LB Luria and Bertani

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE 3

1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 4

1.2.1 Nguồn gốc 4

1.2.2 Phân loại 6

1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 7

1.3.1 Cấu trúc bậc một 7

1.3.2 Cấu trúc không gian 9

1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất 9

1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 11

1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 12

1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 12

1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc 13

1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 15

1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 15

1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa 16

1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 16

1.6 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 17

1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 20

1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 25

2.1.1 Chủng nấm 25

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 25

2.1.3 Hóa chất 26

2.1.4 Môi trường 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO 42

3.1.1 Tuyển chọn 42

3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA 43

3.2 TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE 45

3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian 45

3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy 47

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 48

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon 50

3.2.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen 52

3.2.6 pH môi trường nuôi cấy ban đầu 54

3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE 55

3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 55

3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE 56

3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE 57

3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 57

3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ưu 58

3.4.3 pH phản ứng tối ưu 60

3.4.4 Độ bền nhiệt độ 61

3.4.5 Độ bền pH 63

3.4.6 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ 64

3.4.7 Ảnh hưởng của ion kim loại 65

3.4.8 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

PHỤ LỤC 79

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm 25

Bảng 2.2 Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm 26

Bảng 2.3 Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm 27

Bảng 2.4 Thành phần gel điện di biến tính protein 33

Bảng 3.1 Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A awamori 43

Bảng 3.2 Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A awamori VTCC-F-099 79

Bảng 3.3 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian 79

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 80

Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ cơ chất cảm ứng 80

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nguồn carbon 50

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ lõi ngô 80

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 52

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ ammonium acetate 81

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu 81

Bảng 3.11 Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 81

Bảng 3.12 Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE 82

Bảng 3.13 Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 57

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase 82

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase 82

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase 83

Bảng 3.17 Độ bền nhiệt độ của endoglucanase 83

Bảng 3.18 Độ bền pH của endoglucanase 84

Bảng 3.19 Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase 85

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase 86

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của ion kim loại 66

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase 86

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase 3

Hình 1.2 Trình tự amino acid tương ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số

chủng vi sinh vật 8

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B)

của Cel12A từ H grisea 9

Hình 1.4 Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea 10

Hình 1.5 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các

enzyme thuộc phức hệ cellulase 11

Hình 2.1 Đường chuẩn nồng độ glucose 30 Hình 2.2 Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 33 Hình 2.3 Đường chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn 36 Hình 3.1 Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A awamori nghiên cứu 42 Hình 3.2 Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA

tách chiết từ chủng A awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng

XbaI và XhoI (C) 44

Hình 3.3 Cây phân loại chủng A awamori VTCC-F-099 45

Hình 3.4 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng

A awamori VTCC-F-099 46

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

endoglucanase của chủng A awamori VTCC-F-099 48

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase

của chủng A awamori VTCC-F-099 49

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp

endoglucanase của chủng A awamori VTCC-F-099 51

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp

endoglucanase của chủng A awamori VTCC-F-099 53

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

endoglucanase của chủng A awamori VTCC-F-099 54

Hình 3.10 Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase

từ chủng A awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 56

Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel

Hình 3.17 Ảnh hưởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng

A awamori VTCC-F-099 theo thời gian 64

Hình 3.18 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A awamori VTCC-F-099 65

Hình 3.19 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A awamori VTCC-F-099 68

1 MỞ ĐẦU

Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp

Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose (cellulase) Enzyme này tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tương tự khác tạo thành các oligosaccharide

Endo-β-1,4-glucanase có thể được sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xương sống khác Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau Điều này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ưu của các enzyme

Hiện nay, việc sử dụng các enzyme như endo-β-1,4-glucanase trong một số ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu cơ và xử lý môi trường là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn

Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan được sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nước hiện nay chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam Nước ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các enzyme như endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú Xuất phát từ những lý do

trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề

tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp

glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori

endo-β-1,4-sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch được endo-β-1,4-glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó

2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết

-1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39] Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất

Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các oligosaccharide)

Hình 1.1 Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase

2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 2.2.1 Nguồn gốc

Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

Nấm mốc là một trong những đối tƣợng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhất Nhiều chủng nấm mốc thuộc

các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã đƣợc

nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ:

Aspergillus niger [25], [26], A flavus, A fumigatus [27] A terreus [29] Trichoderma reesei [53], Penicillium persicinum, P brasilianum [33], Penicillium sp [10], Phanerochaete chrysosporium [34]

Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng đƣợc xem là một trong những đối tƣợng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase khá phong phú Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp

endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus

pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C udai [20], [21], Pseudomonas fluoressens [42] Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn

kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ

Clostridium [57]

Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus [13], Streptomyces reticuli [61]

Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật

Arabidopsis [23], ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xương

sống khác như mối [62], ở động vật thân mềm như Mytilus edulis [63]

Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme

Trước hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ) Vi sinh vật sinh trưởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme

Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao Có thể nói rằng, với vi sinh vật, người ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên các đối tượng khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme Tuy vậy, trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp

2.2.2 Phân loại

Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân, tổ 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, nhóm 1: thủy phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; http://afmb.cnrs-mrs.fr/ pedro/CAZY/db.html) Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thành các nhóm khác nhau Trước đây, cellulase được chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng Các enzyme Cx được chia thành hai loại: exo -1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo -1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử cellulose [7]

Hiện nay, cellulase được chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4--D-glucanglucanohydrolase (còn gọi là cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase)(EC 3.2.1.91), dạng 3 là

-glucosidase hoặc -glucosideglucohydrolase (EC 3.2.1.21) Endoglucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose -glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose [30], [39], [45]

Các cellulase có nguồn gốc khác nhau được sắp xếp thành các họ Trước đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase được chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F [35] Sau đó, cellulase được chia thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác [31] Hiện nay, các cellulase được sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 và 74 [45]

2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 2.3.1 Cấu trúc bậc một

Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi

polypeptide Chủng A oryzae KBN616 có khả năng sinh tổng hợp hai loại

endoglucanase là Cel A và Cel B Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid, trọng lượng phân tử 31 kDa, được xếp vào họ cellulase H Trong khi đó, Cel B được xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino acid và

khối lượng phân tử 53 kDa [43] Phân tử endoglucanase từ A aculeatus

bao gồm 410 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 43,7 kDa [59] Các

endoglucanase từ chủng A niger Z10 có khối lượng phân tử 83 kDa và 50 kDa [25], từ A terreus là 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và

55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp D04 có khối lượng 35 kDa [56]

Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt

Humicola grisea Cel12A của H grisea là một chuỗi polypeptide gồm 224

amino acid cấu tạo nên các chuỗi ,  và các vùng nối (Hình 1.2) [55]

Hình 1.2 Trình tự amino acid tương ứng với cấu trúc bậc 2 của

Cel12A từ một số chủng vi sinh vật [55]

2.3.2 Cấu trúc không gian

Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng

Phân tử Cel12A của H grisea cấu tạo bởi 1 chuỗi , 2 chuỗi  (A và B) Chuỗi -A được cấu tạo bởi 6 dải xoắn  (A1-A6), chuỗi -B được cấu tạo bởi 9 dải xoắn  (B1-B9) Các dải xoắn  được nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối lớn 29-32, 40-47, 92-96, và 165-169 nối tương ứng các dải xoắn : B2-A2, A2-A3, A5-B5 và A6-B7 (Hình 1.3A) [55]

2.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất

Trung tâm xúc tác của Cel12A từ H grisea gồm 2 amino acid là glutamic acid E-120 và E-205 (Hình 1.3B), còn ở Cel12A từ Trichoderma

reesei là E-116 và E-200 [55]

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác

(B) của Cel12A từ H grisea [55]

Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân cellulose của các cellulase được thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu cellulose bind domain (CBD) Các CBD có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc không Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo

hóa học và cấu trúc không gian khác nhau Cel12A của H grisea có 3 vùng

liên kết với sự tham gia của các amino acid, trong đó cystein (C175, C206, C216) đóng vai trò trung tâm CBD1 với C175 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A6 liên kết yếu với các amino acid T85, I123, A144, F173, I177, và F180 bằng tương tác Van der Walls Liên kết giữa các amino acid trong CBD1 có kích thước 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.4A) CBD2 với C206 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -B4 liên kết với các amino acid Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204 Liên kết giữa các amino acid trong CBD2 có kích thước 3,3 đến 4,9 Å và CBD2 chứa trung tâm hoạt động (Glu 205) (Hình 1.4B) CBD3 với C216 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A4 liên kết với các amino acid W48, V87, W89, F214 và F219 Liên kết giữa các amino acid trong CBD3 có kích thước 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.4C) [55]

Hình 1.4 Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea [55]

2.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chất theo một cơ chế riêng Tuy nhiên, những enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose

Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β-1,4 glucoside ở

bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tương tự khác Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các oligosaccharide, cellobiose và glucose -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose [45], [58] (Hình 1.5)

Hình 1.5 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose

(B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase

2.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Các cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng được

ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh

2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phương hướng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme Viscozyme 120L được ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào đậu tương [14] Trong quá trình sản xuất nước cà rốt thường sử dụng endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn

Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đường, protein còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như cellulose và -glucan, làm ảnh hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản phẩm Người ta thường sử dụng -glucanase để loại bỏ những thành phần

này Các chế phẩm như Finizym 200L gồm các cellulase từ A niger,

-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã được

sử dụng trong sản xuất bia

Ngoài ra, endoglucanase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất

bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng Glucanase từ Humicola

insolens được ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho

bánh mỳ Glucanase từ Trichoderma reesei, A niger được ứng dụng trong sản

xuất fructooligosaccharide Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) được sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dược phẩm cũng như có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe Khi được bổ sung vào cơ thể người và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh lý quan trọng như: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ các chức năng của gan, làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng [38], [64] Các phế phụ phẩm nông nghiệp như lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất các oligosaccharide Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc Hiện nay, nhu cầu sử dụng các oligosaccharide ở các nước trên thế giới là rất lớn Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về các oligosaccharide vào khoảng 1000-2000 tấn/năm [48]

2.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc

Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành nông nghiệp Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm như trứng, thịt, sữa cho thị trường mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho ngành trồng trọt Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói giảm nghèo, nâng cao đời sống cho người dân Việt Nam Tuy nhiên, ngành nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn Một trong những vấn đề cần được giải quyết hiện nay là làm thế nào để nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn cho môi trường xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con người

Trước tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã được đưa ra và một trong những giải pháp được nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học như sản xuất và bổ sung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi Bổ sung chế phẩm enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thụ chất dinh dưỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trưởng phát triển, nâng cao chất lượng vật nuôi Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn được tiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lượng vốn có, tiết kiệm chi phí chăn nuôi, đồng thời làm giảm lượng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng trong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Thức ăn gia súc, gia cầm được chế biến từ các loại ngũ cốc có chứa nhiều cellulose và glucan Những thành phần này thường không được tiêu hóa triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu các chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật Bổ sung

-glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn [14] Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung glucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi làm tăng đáng kể tốc độ tăng trưởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm glucanase và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng tiêu hóa so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme như sau: khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác tăng 10-18%, phytate tăng 59-70% [52]

Tiềm năng ứng dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm Một số chế

phẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau có thể kể đến như: Rovazyme G2 (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 3 loại enzyme (cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease, amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF, Đức) là hỗn hợp của endoxylanase và endoglucanase; Rhodizyme-CF (Rampart-Power Bangladesh Ltd) là tổ hợp của 5 loại enzyme (cellulase, amylase, protease, lipase, pectinase) Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang bán tại thị trường Việt Nam là tổ hợp của 6 loại enzyme: β-glucanase (200 BGU/g), phytase (1000 PU/g), α-amylase (30 FAU/g), pectinase (4000 AJDU/g), protease (700 HUT/g) và xylanase (100 XU/g) [3]

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn nuôi Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn cho gia súc [2]

2.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

Sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trước khi lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5% Nhiều chế phẩm enzyme đã được sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase 0,5L có chứa -glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất

ethanol Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium

sinh tổng hợp glucanase được sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ, acetic acid [24], sản xuất acetone, butanol và isopropanol [28]

2.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ được tách riêng khỏi nhau

chuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì được giữ lại Phương pháp thông thường là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide Đây là một phương pháp tốn kém và thường gây ô nhiễm môi trường do thành phần chlor tồn dư trong nước thải Vì thế, trong những năm gần đây một giải pháp mới được đưa ra để thay thế phương pháp truyền thống, đó là sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có glucanase để xử lý bột giấy

Glucanase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Đồng thời xử lý glucanase trước khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin [14], [15] Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, glucanase được sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh [37]

2.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa

Cùng với protease, lipase, amylase, cellulase và hemicellulase được ứng dụng để sản xuất chất tẩy rửa Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợi của sợi vải là nơi bám của các phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo Tính đến năm 2002 đã có nhiều cellulase được sản xuất dùng cho bột giặt như:

endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces lanuginous [51]

2.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh

Việc sử dụng enzyme quan trọng nhất trong công tác bảo vệ môi trường là sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành sản phẩm có ích, hoặc trong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các phế thải

thành sản phẩm có ích Trong nhiều năm qua cả ở thế giới và Việt Nam, các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt

Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cs đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam [1], [5], [8], [12]

Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải Trong đó, chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với đối chứng Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải được phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường [1]

Ngoài ra, đã có những nghiên cứu ảnh hưởng của cellulase đến nấm

gây bệnh cây trồng như cellulase của Trichoderma harzianum, từ đó ứng

dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học [6]

2.6 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mình Khả năng

sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nguồn carbon, nguồn nitrogen

Nguồn carbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase có thể

sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh bột, cellulose

Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12

là lactose [5]; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cưa Nguồn

carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ưu ấm là vỏ lạc hoặc rơm [12] Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên,

đặc biệt là các phế phụ phẩm nông nghiệp Theo Acharya và cs (2008), nguồn carbon thích hợp nhất cho các chủng A niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cưa [18] Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A

flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng hợp cellulase khi sử

dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cưa được xem là nguồn cơ chất tối ưu

Các loài Penicillium pinophilum, P persicinum, P brasilianum

sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối

với nguồn carbon xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất kém [33] Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon

thích hợp nhất cho chủng Penicillium sp DTQ-HK1 là rơm [10]

Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau

đối với nguồn nitrogen Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong môi trường chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men [5]

Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình

sinh tổng hợp cellulase của chủng A niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase

tổng số từ 46 đến 76 IU/g [11] Nghiên cứu của Narasimha và cs (2006) cho

thấy, các chủng A niger có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau như:

urea, peptone, ammonium nitrate Trong đó, urea là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp các cellulase của các chủng nấm này [49]

Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các

loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 15C, các loài ưa ấm thường sinh trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50C

Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể chịu được nhiệt độ 65-80C [5] Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hương và cs (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50C [9] Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả năng sinh tổng hợp

cellulase tối ưu ở nhiệt độ 58C [13] Trong khi đó, các chủng nấm mốc N1 và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợp cellulase tối ưu là 31 và 34C [8] Acharya

và cs (2008) cho rằng, các chủng A niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi

lên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18]

pH môi trường nuôi cấy ban đầu: pH môi trường ban đầu ảnh hưởng

quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban đầu là 8,0 [5]; còn chủng

xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trường ban đầu là 6,7

[13] Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở

môi trường có pH ban đầu là 4,5 và 5,5 [8]; các chủng A niger sinh tổng hợp

cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trường ban đầu từ 6,0-7,0 [19]

Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vào ban đầu

2.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức độ và tính chất chịu ảnh hưởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay ion kim loại cũng có sự khác nhau

Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác

chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50C Ở nhiệt độ

cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở nhiệt độ thấp dưới 0C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp [4]

Cellulase từ A niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất ở 50C [11];

trong khi đó cellulase từ A niger Z10 là 40C [25], còn hoạt tính xúc tác của

endoglucanase III từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55C [46] Theo

kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A

oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55C [43]

Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc

vào pH môi trường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ

A niger NRRL-363 là 5,5 [11]; của cellulase từ A niger Z10 là 4,5 và 7,5

[25]; của endoglucanase III từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0 [46]; của endoglucanase từ A oryzae KBN616 là 4,0 và 5,0 [43] Khi nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt tính endoglucanase từ chủng nấm ưa acid A terreus M11, Gao và cs (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt động trong dải

pH 2-5, trong đó pH 2 là tốt nhất [29]

Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc

hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme Sharma và cs (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp

D04 lên 40% so với đối chứng; còn Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối chứng) [56] Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase

từ A terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ (2 mM), 59% khi ủ với Cu2+ (2 mM) [29]

Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động

của enzyme là khác nhau Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng

Penicillium sp DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ methanol, ethanol,

isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% [10]

2.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM

Cho đến nay, ở Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng Các nghiên cứu được tiến hành trên nhiều phương diện khác nhau liên quan đến loại enzyme này

Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu Ở Việt Nam, lượng rác thải ra ngoài môi trường ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm môi trường ở nhiều nơi là rất cao Việc sử dụng biện pháp vi sinh học trong xử lý rác thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý rác thải, thời gian thường kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường, tốn nhiều diện tích và công sức Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, chịu được nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hướng nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm

Năm 1999, Tăng Thị Chính và cs đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

cellulase của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải, nhằm tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng dụng vào việc xử lý rác thải chứa nhiều cellulose Kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng chịu được nhiệt độ 80C, nhiệt độ lên men tối ưu từ 45C đến 55C, pH môi trường ban đầu thích hợp nhất là 8 Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48 giờ lên men [5]

Nguyễn Đức Lượng và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng

sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus Qua nghiên cứu tác giả thấy rằng khả năng sinh tổng hợp cellulase của A griseus là cao và

khả năng này đạt tối ưu ở 58C, pH ban đầu là 6,7, độ ẩm ban đầu là 55% với thời gian nuôi cấy là 72 giờ Qua nghiên cứu tác giả cũng thấy rằng nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cưa [13] Cũng trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cs đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh nhất [12]

Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tượng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng phân hủy cellulose cao và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của chúng đang là vấn đề được nhiều tác giả quan tâm Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng nấm sợi có khả năng phân

giải cellulose cao Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm ra được một số điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng nấm này [8]

Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cs đã nghiên cứu khả năng sinh tổng

hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A niger NRRL-363 Qua nghiên cứu,

tác giả đã tìm ra được một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và một số chất thải

công nghiệp như mật rỉ đường [11]

Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao, Lý Kim Bảng và cs (1999) đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải Nghiên cứu cho thấy, khi chế phẩm này được bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, một nửa thời gian lên men so với bể đối chứng bổ sung chế phẩm VSV-xen Lượng mùn tạo thành của bể ủ bổ sung chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng [1]

3 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

3.1.1 Chủng nấm

Hai mươi sáu chủng A awamori do Viện Vi sinh vật và Công nghệ

Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp được sử dụng để tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất Từ đó thu enzyme làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Thiết bị thí nghiệm

Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm

3.1.3 Hóa chất

Bảng 2.2 Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm

3.1.4 Môi trường

Môi trường Czapek: 0,2% (w/v) NaNO3, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4, 0,05% KCl, 2% Saccharose, pH 6,5 Môi trường đặc bổ sung 2% agar.

Môi trường MT1 theo Mandles (g/l): urea 0,3; (NH4)2SO4 1,4; KH2PO4 2; CaCl2 0,3; MgSO4.7H2O 0,3; peptone 1; cao nấm men 10; tween 80 1; CMC 10; các yếu tố vi lượng 0,1% (v/v) bao gồm các muối: FeSO4 18 mM; MnSO4 6,6 mM; ZnSO4 4,8 mM, CoCl2 15 mM pH 7,0 [36], [60]

Môi trường LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0, khử trùng, với môi trường đặc bổ sung

2% (w/v) agar Đối với việc chọn chủng mang plasmid, môi trường được bổ sung 100 g/ml ampicillin

phosphoric acid; 30 ml dung dịch bradford gốc Đệm điện di protein (biến

tính)

25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4

Đệm tra mẫu protein (biến tính) 5x

10% SDS; 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8

DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol

Dung dịch RNase 10 g/ml RNase

Dung dịch nhuộm gel agarose

xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol

pH 8,0

3.2 PHƯƠNG PHÁP 3.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật

Nuôi cấy hoạt hóa nấm sợi

Các chủng A awamori lấy từ các ống giống được nuôi cấy trên

môi trường Czapek lỏng ở điều kiện 30C , pH 6, 5, lắc 200 vòng/phút trong 72 giờ

Nuôi cấy nấm thu sinh khối enzyme

Các chủng A awamori sau khi hoạt hóa được nuôi cấy chìm trong

môi trường MT1 với 0,5% CMC làm cơ chất, ở 30°C, lắc 200 vòng/phút Sau 96 giờ nuôi cấy, dịch canh trường được ly tâm loại sinh khối tế bào, thu dịch enzyme thô

3.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase

Định tính hoạt tính endoglucanase

Hoạt tính endoglucanase được xác định tương đối theo phương pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong đệm 100 mM potassium phosphate pH 6,5, dày khoảng 0,5 cm được đục lỗ

đường kính 0,5 cm 50 µl dịch enzyme vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4C cho enzyme khuếch tán đều xung quanh Sau đó ủ tiếp 8 giờ ở 37C, lấy ra nhuộm bằng dung dich 1% lugol và đo đường kính vòng phân giải cơ chất Hoạt tính tương đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thước đường kính vòng phân giải cơ chất: Dhalo = D - d (với D là đường kính vòng ngoài và d là đường kính lỗ) [7]

Xác định hoạt độ endoglucanase

Hoạt độ endoglucanase được xác định chính xác dựa vào lượng đường khử tạo thành sau phản ứng bằng phương pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [47]

Tiến hành

Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzyme được hút vào ống

nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC trong đệm 100 mM potassium phosphate, pH 6,5 Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó bổ sung ngay 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS và đun sôi cách thủy 5 phút

Ống đối chứng: 0,1 ml dịch enzyme được hút vào ống nghiệm, thêm

1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó lấy ra và đun sôi cách thủy 5 phút

Hỗn hợp sau phản ứng được đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 540 nm Kết quả đo độ hấp thụ quang phổ được đối chiếu với đồ thị chuẩn nồng độ glucose để suy ra lượng đường khử tương đương được giải phóng ra

Dựng đường chuẩn: Glucose được pha trong nước cất với nồng độ

chuẩn khác nhau từ 0,04-0,18 mg/ml 2 ml dung dịch glucose chuẩn được đo độ hấp phụ ở bước sóng 540 nm như trên Sau đó, mối tương quan giữa độ hấp phụ và nồng độ glucose được xây dựng bằng phần mềm Microsoft Excel

Kết quả cho thấy, đường nồng độ chuẩn glucose tuyến tính trong dải nồng độ 0,04-0,18 mg/ml (Hình 2.1)

Đường chuẩn có phương trình: y = 2,6411x - 0,0799 Trong đó: y - độ hấp phụ ở bước sóng 540 nm (OD540 nm); x - nồng độ glucose (mg/ml)

Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) được định nghĩa là

lượng enzyme làm thủy phân cơ chất (CMC) thành đường khử tương đương 1 mol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghệm

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase

3.2.3.1 Thời gian nuôi cấy

Chủng A awamori VTCC-F-099 được nuôi cấy trong môi trường MT1

cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, dịch canh trường được thu sau những khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau: từ 24-240 giờ và xác định hoạt tính endoglucanase

R² = 0.997

00.10.20.30.40.5