TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

Header Page of 166 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI-2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Quyền Đình Thi Thực tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Quyền Đình Thi trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, CN Đào Thị Tuyết tập thể cán Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn tạo điều kiện tốt giúp học tập rèn luyện suốt trình thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh trƣờng ĐHSP - Đại học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiện chu đáo cho suốt trình học tập hoàn thành khóa luận Bên cạnh đó, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên giúp đỡ suốt trình học tập để có đƣợc kết nhƣ ngày hôm Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quí báu ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009 Học Viên Nguyễn Hữu Quân Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐỊNH NGHĨA 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Phân loại enzyme 1.3 CẤU TRÚC 1.3.1 Cấu trúc bậc 1.3.2 Cấu trúc không gian 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC 1.5 Khái quát Aspergillus oryzae 10 1.6 Ứng dụng 11 1.6.1 Trong công nghiệp sản xuất giấy bột giấy 11 1.6.2 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 12 1.6.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 13 1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu 14 1.6.5 Trong công nghệ sử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 14 1.7 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 16 1.7.1 Nguồn carbon 16 1.7.2 Nguồn nitrogen 17 1.7.3 Nhiệt độ nuôi cấy 18 1.7.4 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng 18 1.8 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME 19 1.8.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 19 1.8.2 Ảnh hƣởng pH 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 1.8.3 Ảnh hƣởng ion kim loại 20 1.8.4 Ảnh hƣởng dung môi hữu chất tẩy rửa 21 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22 2.1.1 Chủng giống 22 2.1.2 Thiết bị 22 2.1.3 Hóa chất 22 2.1.4 Dung dịch đệm phá tế bào 23 2.1.5 Môi trƣờng 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP 25 2.2.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme 25 2.2.2 Định tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.3 Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng lên khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 27 2.2.5 Tinh sơ endo-β-1,4-glucanase 29 2.2.6 Điện di SDS-PAGE 30 2.2.7 Xác định tính chất lý hóa endo-β-1,4-glucanase 30 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Sàng lọc chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase cao 36 3.2 Phân loại chủng nấm sợi A oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA 37 3.3 Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 39 3.3.1 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 39 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 3.3.3 Ảnh hƣởng nguồn carbon 41 3.3.4 Ảnh hƣởng nồng độ carbon 43 3.3.5 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen 44 3.3.6 Ảnh hƣởng nồng độ nitrogen 45 3.3.7 Nhiệt độ nuôi cấy 46 3.3.8 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy 47 3.4 Tinh sơ endo-β-1,4-glucanase 48 3.5 Tính chất lý hóa endo-β-1,4-glucanase 50 3.5.1 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 50 3.5.2 pH phản ứng tối ƣu 51 3.5.3 Độ bền nhiệt 52 3.5.4 Độ bền pH 54 3.5.5 Ảnh hƣởng dung môi hữu 55 3.5.6 Ảnh hƣởng số chất tẩy rửa 56 3.5.7 Ảnh hƣởng ion kim loại 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 TIẾNG VIỆT 61 TIẾNG ANH 64 PHỤ LỤC 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thiết bị đƣợc sử dụng thí nghiệm 22 Bảng 2.2 Các hóa chất đƣợc sử dụng thí nghiệm 23 Bảng 2.3 Danh sách dung dịch đệm đƣợc sử dụng thí nghiệm 23 Bảng 3.1 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 35 chủng A oryzae 37 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 42 Bảng 3.2 Tóm tắt trình tinh endo-β-1,4-glucanase từ chủng A oryzae VTCC-F-045 49 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 57 Bảng 4.1 Đƣờng chuẩn glucose 69 Bảng 4.2 Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA từ chủng A oryzae VTCC-F-045 69 Bảng 4.3 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 70 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ CMC tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 70 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactose tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ bột đậu tƣơng tới khả sinh endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 Bảng 4.10 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.12 Ảnh hƣởng pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 74 Bảng 4.13 Độ bền nhiệt endo-β-1,4-glucanase 75 Bảng 4.14 Độ bền pH endo-β-1,4-glucanase 76 Bảng 4.15 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu tới hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.17 Ảnh hƣởng ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 78 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc không gian từ xuống (A) từ bên sang (B) Cel12A từ H grisea Hình 1.2 Cấu trúc vùng liên kết enzyme - chất Cel12A từ H grisea Hình 1.3 Cơ chế thủy phân cellulose (A) phức hệ cellulose (B) cellulase Hình 1.4 Sự thủy phân loại enzyme phức hệ cellulase 10 Hình 1.5 Cấu trúc gene A oryzae 11 Hình 2.1 Đƣờng chuẩn glucose 26 Hình 2.2 Quy trình tinh endo-β-1,4-glucanase từ chủng A oryzae VTCC-F-045 29 Hình 3.1 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase số chủng A oryzae 36 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA chủng A oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XhoI XbaI (C) 38 Hình 3.3 Cây phân loại chủng A oryzae VTCC-F-045 39 Hình 3.4 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian chủng A oryzae VTCC-F-045 40 Hình 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 41 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactose đến khả sinh tổng hợp endoβ-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 44 Hình 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 45 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ bột đậu tƣơng đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 10 of 166 Hình 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh tổng hợp enzyme endoβ-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 47 Hình 3.10 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 48 Hình 3.11 Sắc kí đồ cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE chủng A oryzae VTCC-F-045 (B) 49 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 51 Hình 3.13 Ảnh hƣởng pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 52 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 53 Hình 3.15 Ảnh hƣởng pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 54 Hình 3.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 55 Hình 3.17 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 10 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 76 of 166 de la Mata I, Estrada P, Macarron R, Dominguez JM, Castillon MP, Acebal C (1992) Chemical mechanism of beta glucosidase from Trichoderma reesei QM 9414 pH-defrendence of kinetic parameters, Biochem, 283: 679-682 10 Fukuda H, Mikami S, Kizaki Y, Wakabayashi S (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci and Bioeng, 95(5): 479-484 11 Galagan JE, Calvo SE, Cuomo C, Ma LJ, Wortman, JR, Batzoglou S, Lee SI, Basturkmen M (2005) Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with Aspergillus fumigatus and Aspergillus oryzae, Nature, 438: 1105-1115 12 Gao JN, Weng HB, Xi Y, Zhu DH, Han SY (2008) Purification and characterization of a novel endo-β-glucanase from the thermoacidophilic Aspergillus terreus, Biotechnol Lett, 30: 323-327 13 Gielkens M, Dekkers E, Visser J, Graaff L (1990) Two cellobiohydrolase-encoding gene from Aspergillus niger require Dxylose and the xylanolytic transriptional activator XlnR for thier expression, Appl Envirion Microbiol, 65: 4340-4345 14 Gilkes N, Henrissat B, Kilburn D, Miler R, Warren R (1991) Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence consveration, function, and enzyme families, Microbial Rev, 55: 303-315 15 Hara Y, Hinoki Y, Shimoi H, Ito K (2003) Cloning and sequence analysis of endoglucanase genes from an industrial fungus Aspergillus kawachi, Biosci Biotechnol Biochem, 67: 2010-2013 16 Henning J, Morkeberg A, Krogh K, Olsson L (2005) Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 76 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 Header Page 77 of 166 substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary elechtrophoresis, Enzyme Microb Tech, 36:42-48 17 Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon J (1989) Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis, Gene, 81: 83-95 18 Hong J, Tamoki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumajai H (2001) Cloning of a gene encoding a highly stable endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast, J Biosc and Bioengin, 92: 434-441 19 Kang M, Rhee Y (1995) Caeboxymethyl cellulases active and stable at alkaline pH from alkalophilic cephalosporium sp RYM-202, Biotechnol Lette, 17: 507-512 20 Kawamori M, Takayama K, Takasawa S (1987) Production of cellulase by a thermophilic fungus, Thermoascus aurantiacus A-131, Agric Biol Chem, 51: 647-654 21 Khan M, Ali S, Fakhrul-Razi A, Alam Z (2007) Use of fungi for the bioconversion of rice straw into cellulase enzyme, J Environ Sci Health, 42: 381-386 22 Kitamoto K (2002) Molecular biology of te Koij molds, Adv in Appl Microbiol, 51: 129-153 23 Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K, Tsukagoshi N (1996) Molecular cloning, purification and characterization of two endo-1,4-β-glucanases from Aspergillus oryzae KBN616, Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544 24 Lee R, Weimer P, Vanzyl W, Pretorius I (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnolog, Microbiol Mol Biol Rev, 66: 506-577 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 77 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn 66 Header Page 78 of 166 25 Macarron R, Acebal C, Castillon M, Dominguez M, Kata I, Pettersson G, Tomme P, Claeyssenst M (1993) Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei, Biochem J, 289: 867-873 26 Machida M, Asai K, Sano M, Tanaka T, Kumagai T, Terai G, Kusumoto K, Terai G, Kusumoto K, Arima T (2005) Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae, Nature, 438: 11571161 27 Milala M, Shehu B, Zanna H, Omosioda V (2009) Degradation of Agaro-Waste by Cellulase from Aspergillus candidus, Asian Journal of Biotechnology, 1: 51-56 28 Narasimha G, Sridevi A, Buddolla V, Subhosh CM, Rajsekhar RB (2006) Nutrient effect on production of cellulolytic enzyme by Aspergillus oryzae, Afr J Biotechnol, 5: 472-476 29 Nelson N (1944) A photometric adaptation of the Somogyi mehtod for the determination of glucose, J Biol Chem, 153: 375-380 30 Nozaki K, Seki T, matsui K, Mizuno M, Kanda T, Amano Y (2007) Structure and characteristics of an endo-beta-1,4-glucanase, isolated from Trametes hirsuta, with high degradation to crystalline cellulose, Biosci Biotechnol Biochem, 71(10): 2375-2382 31 Ojumu TV, Solomon BO, Betiku EL, Stephen K, Amigun B (2003) Cellulase production by Aspergillus flavus Linn Isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse and corncob, Afr Biotechnol, 2: 150-152 32 Omojasola P, Jilani O (2008) Cellulase production by Trichoderma longi, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on waste from orange, Pakistan Biol Sci, 11: 2382-2388 33 Sandgren M, Guafetti, PJ, Paech, C, Paech S, Shaw A, Gross L, Saldajeno M, Berglund G, Jones T, Mitchinson C (2003) The Humicola Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 78 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn 67 Header Page 79 of 166 grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the impact of its free cysteine residues on thermal stability, Protein Sci, 12: 2782– 2793 34 Sang J, Young J, Hyen S (1995) Characterization of a bifunctional cellulase and structural gene The cel gene of Bacillus sp D04 has exoendoglucanase activity, J Biol chem, 270: 26012-26019 35 Tang X, He G, Chen Q, Zhang X, Ali M (2004) Medium optimization for the production of thermal stable beta-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 using response surface methodology, Bioresour Technol, 93(2): 175-181 36 Yamane Y, Furita J, Izuwa S, Fukuchi K, Shimizu R, Hiyoshi A (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci Bioeng, 95(5): 479-484 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 79 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 Header Page 80 of 166 PHỤ LỤC Bảng 4.1 Đƣờng chuẩn glucose STT glucose (μl ) Đệm natri acetate pH 5,0 (l) 10 490 Nồng độ (μg/ml) 20 OD (660nm) 0,112 15 485 30 0,188 20 480 40 0,256 25 475 50 0,319 30 470 60 0,401 40 460 80 0,566 Bảng 4.2 Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA từ chủng A oryzae VTCC-F-045 Trình tự nucleotide Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 80 of 166 Vị trí http://www.lrc-tnu.edu.vn 69 Header Page 81 of 166 Bảng 4.3 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian Thời gian (giờ) Lần Lần Trung bình Hoạt tính (U/ml) 24 36 0,42 0,46 0,54 0,50 0,47 0,48 1,96 ± 0,062 1,99 ± 0,022 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 0,45 0,37 0,39 0,40 0,26 0,36 0,66 0,28 0,33 0,22 0,52 0,47 0,54 0,48 0,27 0,36 0,48 0,57 0,67 0,63 0,48 0,42 0,47 0,44 0,26 0,36 0,57 0,42 0,50 0,42 2,00 ± 0,033 1,73 ± 0,053 1,93 ± 0,075 1,81 ± 0,038 1,09 ± 0,002 1,49 ± 0,003 2,35 ± 0,091 1,75 ± 0,145 2,08 ± 0,170 1,76 ± 0,207 OD (660 nm) % 101 103 104 90 100 94 56 77 122 90 107 91 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ CMC tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nồng độ Hoạt tính OD (660 nm) CMC (%) Lần Lần Lần TB (U/ml) 0,5 0,7 1,0 1,5 0,42 0,49 0,51 0,43 0,39 0,48 0,59 0,41 0,44 0,48 0,56 0,43 0,42 0,48 0,55 0,42 8,52 ± 0,014 9,86 ± 0,002 11,27 ± 0,025 8,58 ± 0,008 2,0 2,5 2,7 0,30 0,21 0,18 0,31 0,22 0,16 0,30 0,24 0,20 0,31 0,22 0,18 6,21 ± 0,012 4,53 ± 0,008 3,66 ± 0,012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 81 of 166 % 100 116 132 101 73 53 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 Header Page 82 of 166 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 % Bã mía Lần Trung bình 0,33 0,38 0,35 Hoạt tính (U/ml) 0,82 ± 0,028 35 Cao nấm men CMC Glucose Lactose Lõi ngô 0,87 0,27 0,57 0,40 0,42 1,12 0,26 0,41 0,35 0,50 0,99 0,26 0,49 0,38 0,46 2,32 ± 0,124 2,11 ± 0,005 2,61 ± 0,082 11,81 ± 0,022 2,29 ± 0,040 100 91 112 508 99 Sacarose Vỏ cà phê Vỏ lạc Vỏ quýt Trấu cám 0,61 0,66 0,26 0,65 0,51 0,61 0,68 0,38 0,94 0,62 0,61 0,67 0,32 0,80 0,57 1,93 ± 0,004 1,62 ± 0,009 1,01 ± 0,060 2,10 ± 0,0143 1,09 ± 0,055 83 70 43 90 47 Nguồn cacbon OD (660 nm) Lần Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactose tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nồng độ lactose Hoạt tính OD (660 nm) % 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 Lần 0,11 0,20 0,49 0,22 0,04 Lần 0,10 0,11 0,27 0,16 0,06 Trung bình 0,11 0,15 0,38 0,19 0,05 4,25 ± 0,002 6,24 ± 0,043 15,47 ± 0,111 7,57 ± 0,030 2,08 ± 0,010 100 147 364 178 49 1,0 1,2 1,4 1,6 0,09 0,15 0,19 0,11 0,18 0,20 0,26 0,10 0,14 0,17 0,23 0,11 5,52 ± 0,044 6,92 ± 0,026 9,13 ± 0,033 4,29 ± 0,005 130 163 215 101 1,8 2,0 2,2 0,11 0,07 0,12 0,09 0,14 0,14 0,10 0,10 0,13 4,13 ± 0,009 4,09 ± 0,034 5,13 ± 0,013 97 96 121 (%) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 82 of 166 (U/ml) http://www.lrc-tnu.edu.vn 71 Header Page 83 of 166 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nguồn nitrogen OD (660 nm) Bột cá Hoạt tính (U/ml) % Lần 0,14 Lần 0,20 TB 0,17 3,39 ± 0,033 50 0,63 0,32 0,32 0,31 0,15 0,63 0,36 0,48 0,38 0,13 0,63 0,34 0,40 0,34 0,14 12,92 ± 0,002 6,83 ± 0,020 8,13 ± 0,083 7,01 ± 0,036 2,79 ± 0,012 189 100 119 103 41 Bột đậu tƣơng Pepton Urea (NH4)2SO4 NaNO3 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ bột đậu tƣơng tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nồng độ bột Hoạt tính OD (660 nm) % đậu tƣơng (%) Lần Lần TB (U/ml) 0,1 0,5 1,0 1,5 0,42 0,11 0,57 0,21 0,35 0,22 0,50 0,24 0,39 0,16 0,54 0,22 11,85 ± 0,034 4,99 ± 0,035 16,39 ± 0,02 6,83 ± 0,002 100 42 138 58 1,8 2,0 0,21 0,20 0,21 0,17 0,21 0,19 6,38 ± 0,001 5,67 ± 0,014 54 48 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ Lần Lần Lần TB Hoạt tính (U/ml) o 28 C 30oC 0,39 0,28 0,34 0,28 0,32 0,26 0,35 0,27 14,23 ± 0,023 11,03 ± 0,008 100 78 37oC 0,17 0,14 0,12 0,15 5,86 ± 0,014 41 OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 83 of 166 % http://www.lrc-tnu.edu.vn 72 Header Page 84 of 166 Bảng 4.10 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 pH OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % 3,5 Lần 0,39 Lần 0,42 Lần 0,45 TB 0,42 17,04 ± 0,015 54 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 0,75 0,78 0,70 0,81 0,77 0,84 0,78 0,67 0,89 0,83 0,92 0,70 0,67 0,91 0,82 0,83 0,75 0,68 0,87 0,81 34,12 ± 0,050 30,71 ± 0,026 27,66 ± 0,010 35,70 ± 0,030 32,97 ± 0,019 108 98 88 113 105 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 0,80 0,19 0,31 0,42 0,49 0,69 0,29 0,32 0,42 0,38 0,82 0,29 0,25 0,47 0,38 0,77 0,26 0,29 0,44 0,42 31,48 ± 0,039 10,36 ± 0,035 11,88 ± 0,022 17,84 ± 0,018 17,01 ± 0,036 100 33 38 57 54 Bảng 4.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ (oC) Hoạt tính OD (660 nm) % 30 35 40 45 50 Lần 0,12 0,12 0,52 0,55 0,58 Lần 0,16 0,19 0,40 0,53 0,56 Trung bình 0,14 0,15 0,46 0,54 0,57 12,67 ± 0,021 14,23 ± 0,033 42,53 ± 0,060 49,58 ± 0,007 52,19 ± 0,009 19 21 63 73 77 55 60 65 70 0,75 0,73 0,53 0,45 0,73 0,71 0,55 0,46 0,74 0,72 0,54 0,46 67,69 ± 0,009 66,25 ± 0,007 49,67 ± 0,011 41,98 ± 0,006 100 97 73 62 75 80 0,50 0,49 0,51 0,44 0,51 0,47 46,60 ± 0,005 42,99 ± 0,026 69 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 84 of 166 (U/mg) http://www.lrc-tnu.edu.vn 73 Header Page 85 of 166 Bảng 4.12 Ảnh hƣởng pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 pH 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 OD (660 nm) Lần 0,10 0,10 0,12 0,12 0,19 0,13 0,18 0,14 0,13 Lần 0,11 0,10 0,11 0,13 0,22 0,14 0,19 0,14 0,13 Trung bình 0,103 0,104 0,116 0,126 0,207 0,135 0,187 0,136 0,127 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 85 of 166 Hoạt tính (U/mg) % 48,03± 0,003 48,49± 0,001 54,21± 0,002 58,79± 0,002 95,88± 0,013 62,91± 0,001 86,49± 0,003 63,14± 0,001 59,02± 0,001 50 51 57 61 100 66 90 66 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn 74 Header Page 86 of 166 Bảng 4.13 Độ bền nhiệt endo-β-1,4-glucanase Nhiệt độ (oC) Thời gian ủ (giờ) Lần Lần ĐC 0,58 30 45 50 55 60 % Trung bình Hoạt tính (U/mg) 0,59 0,59 54,20 ± 0,002 100 0,52 0,51 0,51 53,56 ± 0,003 99 0,23 0,21 0,17 0,14 0,23 0,21 0,18 0,15 0,23 0,21 0,18 0,14 56,90 ± 0,001 65,74 ± 0,004 37,17 ± 0,001 36,90 ± 0,004 105 121 69 68 0,58 0,57 0,57 52,78 ± 0,005 97 0,55 0,56 0,54 0,55 0,56 0,54 0,55 0,45 0,56 0,55 0,54 0,50 51,04 ± 0,002 50,54 ± 0,006 49,99 ± 0,004 45,92 ± 0,005 94 93 92 85 0,41 0,48 0,39 0,27 0,23 0,45 0,48 0,38 0,37 0,22 0,43 0,48 0,38 0,32 0,22 59,60 ± 0,016 44,27 ± 0,003 35,20 ± 0,003 29,48 ± 0,046 20,78 ± 0,005 73 82 65 54 38 0,59 0,45 0,52 47,61 ± 0,067 88 0,57 0,70 0,63 0,42 0,63 0,80 0,58 0,35 0,60 0,75 0,60 0,39 55,26 ± 0,028 68,81 ± 0,049 55,30 ± 0,026 35,48 ± 0,034 102 127 102 65 0,58 0,58 0,58 53,24 ± 0,001 98 0,55 0,54 0,32 0,32 0,56 0,52 0,36 0,30 0,56 0,53 0,34 0,31 51,09± 0,005 48,80 ± 0,014 31,45 ± 0,021 28,56 ± 0,006 94 90 58 53 OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 86 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn 75 Header Page 87 of 166 Bảng 4.14 Độ bền pH endo-β-1,4-glucanase pH ĐC 4,5 5,5 6,0 6,5 7,5 Thời gian ủ (giờ) % Trung bình Hoạt tính (U/mg) Lần Lần 0,58 0,59 0,59 112,3 ± 0,002 100 0,52 0,51 0,51 68,64 ± 0,003 61 0,23 0,21 0,17 0,23 0,21 0,18 0,23 0,21 0,18 67,03 ± 0,001 65,66 ± 0,004 59,96 ± 0,001 0,58 0,57 0,57 81,23 ± 0,005 60 58 51 72 0,55 0,56 0,56 80,31 ± 0,002 71 0,56 0,54 0,55 76,65 ± 0,006 68 0,54 0,55 0,54 57,42 ± 0,004 51 0,41 0,45 0,43 99,31 ± 0,016 88 0,48 0,48 0,48 75,50 ± 0,003 67 0,39 0,38 0,38 73,67 ± 0,003 66 0,27 0,37 0,32 72,07 ± 0,046 64 0,59 0,45 0,52 67,03 ± 0,067 60 0,57 0,63 0,60 64,06 ± 0,028 57 0,70 0,80 0,75 59,94 ± 0,049 53 0,63 0,58 0,60 59,25 ± 0,026 53 0,58 0,58 0,58 68,41 ± 0,001 61 0,55 0,56 0,56 67,95 ± 0,005 60 0,54 0,52 0,53 67,49 ± 0,014 60 0,32 0,36 0,34 63,14 ± 0,021 56 OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 87 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn 76 Header Page 88 of 166 Bảng 4.15 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 CTR Nồng độ (%) ĐC Tween 20 Tween 80 Trixton X100 SDS 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 OD (660 nm) Lần Lần TB 0,22 0,16 0,14 0,08 0,07 0,07 0,09 0,08 0,07 0,07 0,06 0,10 0,09 0,08 0,09 0,08 0,03 0,02 0,02 0,01 0,01 0,21 0,16 0,13 0,09 0,07 0,07 0,08 0,08 0,07 0,07 0,06 0,09 0,09 0,09 0,08 0,07 0,03 0,02 0,01 0,01 0,01 0,22 0,16 0,13 0,08 0,07 0,07 0,09 0,08 0,07 0,07 0,06 0,10 0,09 0,08 0,08 0,07 0,03 0,02 0,01 0,01 0,01 Hoạt tính (U/mg) % 99,54 ± 0,001 100 77 63 40 32 31 40 38 33 32 27 45 40 40 39 34 15 12 76,19 ± 0,000 62,68 ± 0,002 39,56 ± 0,002 32,23 ± 0,001 31,32 ± 0,001 40,02 ± 0,003 37,73 ± 0,000 32,92 ± 0,001 31,78 ± 0,002 26,97 ± 0,001 44,60 ± 0,004 40,02 ± 0,000 39,79 ± 0,001 38,87 ± 0,003 34,29 ± 0,003 15,29 ± 0,001 11,63 ± 0,001 7,51 ± 0,001 6,59 ± 0,001 4,30 ± 0,001 Bảng 4.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ (oC) Lần Lần TB Hoạt tính (U/mg) ĐC Metanol Ethanol 0,16 0,13 0,13 0,17 0,14 0,12 0,17 0,13 0,13 76,65 ± 0,004 62,00 ± 0,002 58,33 ± 0,002 100 81 76 Isopropanol Aceton n-Butanol 0,13 0,09 0,07 0,13 0,09 0,07 0,13 0,09 0,07 61,54 ± 0,000 42,99 ± 0,002 33,15 ± 0,001 80 56 43 OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 88 of 166 % http://www.lrc-tnu.edu.vn 77 Header Page 89 of 166 Bảng 4.17 Ảnh hƣởng ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Ion kim loại Nồng độ (mM) Lần Lần TB Hoạt tính (U/mg) ĐC 0,30 0,29 0,29 135,26 ± 0,003 12 0,25 0,29 0,21 0,24 0,29 0,21 0,25 0,29 0,21 113,28 ± 0,001 131,42 ± 0,001 98,17 ± 0,002 Ca 12 0,28 0,24 0,21 0,25 0,23 0,22 0,26 0,24 0,21 121,52 ± 0,017 109,16 ± 0,002 99,08 ± 0,004 Co2+ 12 0,27 0,27 0,27 0,27 0,28 0,27 0,27 0,27 0,27 124,50 ± 0,001 126,10 ± 0,003 124,73 ± 0,000 0,28 0,27 0,28 0,27 0,28 0,27 129,30 ± 0,000 124,27 ± 0,004 12 0,26 0,26 0,26 118,32 ± 0,001 12 0,25 0,25 0,20 0,31 0,27 0,21 0,28 0,26 0,21 129,30 ± 0,030 120,15 ± 0,010 95,42 ± 0,002 0,26 0,26 0,26 118,32 ± 0,000 12 0,19 0,16 0,18 0,17 0,19 0,17 86,26 ± 0,002 78,02 ± 0,002 K 12 0,30 0,25 0,24 0,30 0,26 0,24 0,30 0,25 0,24 138,69 ± 0,001 116,94 ± 0,002 111,90 ± 0,002 Mn2+ 12 0,28 0,24 0,22 0,29 0,24 0,23 0,28 0,24 0,22 130,68 ± 0,003 111,45 ± 0,001 103,66 ± 0,004 0,28 0,28 0,28 127,93 ± 0,001 12 0,27 0,21 0,27 0,21 0,27 0,21 124,45 ± 0,001 94,96 ± 0,000 0,25 0,26 0,26 118,32 ± 0,002 0,17 0,19 0,18 83,25 ± 0,010 12 0,17 0,17 0,17 77,11 ± 0,001 + Ag 2+ 2+ Cu EDTA 2+ Fe + + Ni 2+ Zn OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Footer Page 89 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 90 of 166 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Footer Page 90 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase xác định tính chất lý hóa Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A oryzae sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase... ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30... endo-β1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A oryzae xác định tính chất hóa lý endo-β-1,4glucanase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên