Phân lập tuyển chọn nấm mốc aspergillus oryzae từ các nguồn tự nhiên như gạo, ngô, sắn, đậu tương

PHẦN 1ĐẶT VẤN ĐỀỞ nước ta, điều kiện khí hậu nóng và ẩm, hết sức thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của các loài nấm mốc. Trong số nấm mốc, có nhiều loài có ích được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp nhẹ… ngược lại cũng có nhiều loài gây hại cho các ngành công nông nghiệp, làm hư hỏng nhiều vật tư, hàng hoá.Việc phân loại, định tên nấm mốc có ích hoặc có hại cũng như công tác điều tra cơ bản về hệ nấm mốc ở Việt Nam là những vấn đề rất cần thiết, nhưng cho đến nay chúng ta vẫn chưa làm được bao nhiêu 1. Trong số các loài nấm mốc thì Aspergillus oryzae (A. oryzae) là một trong những loài có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm. A. oryzae là một loại nấm mốc giàu các enzym thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinase…). Hiện nay chúng được sử dụng để sản xuất nhiều loại thực phẩm như sản xuất nước tương, nước mắm, súp miso và rượu sake ở Nhật Bản… A. oryzae được dùng để sản xuất tương, loại thực phẩm phổ biến ở Việt Nam. Tuy nhiên tương sản xuất thủ công lại có độ an toàn không cao, bởi loại mốc tốt và không độc như A. oryzae lại rất dễ lẫn lộn với những loại mốc nguy hiểm có độc tố gây ung thư khác là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticu.Chính vì vậy, việc nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn nấm mốc A. oryzae thuần chuẩn để ứng dụng trong sản xuất là một vấn đề quan trọng không những góp phần tạo ra những sản phẩm có chất lượng mà còn phải đáp ứng an toàn thực phẩm. Đó cũng là mục đích chúng tôi chọn đề tài “ Phân lập, tuyển chọn nấm mốc Aspergillus oryzae từ các nguồn tự nhiên như gạo, ngô, sắn, đậu tương” với mục đích tìm được chủng nấm mốc A. oryzae có khả năng ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm.

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở nước ta, điều kiện khí hậu nóng và ẩm, hết sức thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của các loài nấm mốc Trong số nấm mốc, có nhiều loài có ích được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp nhẹ… ngược lại cũng có nhiều loài gây hại cho các ngành công nông nghiệp, làm hư hỏng nhiều vật tư, hàng hoá

Việc phân loại, định tên nấm mốc có ích hoặc có hại cũng như công tác điều tra cơ bản về hệ nấm mốc ở Việt Nam là những vấn đề rất cần thiết, nhưng cho đến nay chúng ta vẫn chưa làm được bao nhiêu [1]

Trong số các loài nấm mốc thì Aspergillus oryzae (A oryzae) là một trong những

loài có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong ngành công nghiệp

thực phẩm A oryzae là một loại nấm mốc giàu các enzym thủy phân nội bào và ngoại

bào (amylase, protease, pectinase…) Hiện nay chúng được sử dụng để sản xuất nhiều loại thực phẩm như sản xuất nước tương, nước mắm, súp miso và rượu sake ở Nhật

Bản… A oryzae được dùng để sản xuất tương, loại thực phẩm phổ biến ở Việt Nam

Tuy nhiên tương sản xuất thủ công lại có độ an toàn không cao, bởi loại mốc tốt và

không độc như A oryzae lại rất dễ lẫn lộn với những loại mốc nguy hiểm có độc tố gây

ung thư khác là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticu

Chính vì vậy, việc nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn nấm mốc A oryzae thuần

chuẩn để ứng dụng trong sản xuất là một vấn đề quan trọng không những góp phần tạo

ra những sản phẩm có chất lượng mà còn phải đáp ứng an toàn thực phẩm Đó cũng là

mục đích chúng tôi chọn đề tài “ Phân lập, tuyển chọn nấm mốc Aspergillus oryzae

từ các nguồn tự nhiên như gạo, ngô, sắn, đậu tương” với mục đích tìm được chủng

nấm mốc A oryzae có khả năng ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Tổng quan về nấm mốc [1], [2], [3], [27], [28], [29]

Nấm mốc (molds, moulds) là tên chung để chỉ các nhóm nấm không phải là nấm men cũng không phải là các nấm lớn có quả thể Đây là nhóm vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách

tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có xenlulo và một số thành phần khác có hàm lượng thấp Nấm học (Mycology) được khai sinh bởi nhà thực vật học người Ý tên là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794 - 1874)

Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất Nấm mốc là nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng sợi có lông tơ, sợi bông, tạo khuẩn ty ở dạng bột… Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào tử do nó sinh

ra như màu xanh, vàng, trắng, đen… Trong thực phẩm nấm mốc xuất hiện trên bề mặt nước chấm, bánh mì để lâu ngày, trên rau quả và nhiều loại thức ăn khác gây mùi, vị khó chịu, thậm chí có một số loài tiết ra chất độc gây ngộ độc thức ăn Mặc dù vậy nấm mốc lại có thể tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác như là tác nhân quan trọng trong quá trình sản xuất nước tương, chao, đường, axit hữu cơ… Nấm mốc hô hấp hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở một số môi trường mà nấm men, vi khuẩn không thể phát triển được như ở môi trường có áp suất, độ ẩm và độ axit lớn

2.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo

2.1.1.1 Đặc điểm hình thái và kích thước [1], [2], [3], [25], [26]

Nấm mốc đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào) Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài, có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet

Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì như bông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm

Hình 2.1: Nấm mốc 2.1.1.2 Đặc điểm cấu tạo [1], [2], [3], [9], [25]

Cũng như nấm men, nấm mốc có cấu tạo tế bào điển hình như ở sinh vật bậc cao Thành phần hoá học và chức năng của các cấu trúc này cũng tương tự như ở nấm men Điều sai khác cơ bản giữa nấm mốc và nấm men là ở tổ chức tế bào Nấm men chỉ là

những tế bào riêng rẽ hoặc xếp với nhau theo kiểu cây xương rồng Nấm mốc

có tổ chức tế bào phức tạp hơn, trừ một số nấm mốc bậc thấp có cấu tạo đơn bào phân nhánh Ở những nấm mốc bậc thấp này, cơ thể là một hệ sợi nhiều nhân không có vách ngăn

Đa số nấm mốc có cấu tạo đa bào, tạo thành những tổ chức khác nhau như sợi khí sinh, sợi cơ chất Sợi cơ chất của nấm mốc không đơn giản như ở xạ khuẩn mà phức tạp hơn Có những loài có sợi cơ chất giống như rễ chùm ở thực vật gọi là rễ giả, ví dụ

như ở Aspergillus niger Ở những loài nấm mốc ký sinh trên thực vật, sợi cơ chất tạo

thành những cấu trúc đặc biệt gọi là vòi hút

Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch khác được

mô tả và trình bày như ở hình 2.2

Hình 2.2 Cấu tạo tế bào đỉnh sợi nấm Fusarium (theo Howard R J & Heist J R., 1979)

(MT: vi ống, M: ty thể, SC: bộ Golgi, V: bọng (túi) đỉnh, P: màng sinh chất 4 lớp) Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzym chitin synthetase Tế bào chất của tế bào nấm

chứa mạng nội mạc, không bào, ty thể và hạt dự trữ (glycogen và lipit), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật Ngoài ra, tế bào nấm còn có riboxôm và những thể khác chưa rõ chức năng Chúng không có diệp lục

tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân Nhân của chúng có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipit và protein dày 0,02 µm, bên trong màng nhân chứa ARN và ADN

2.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản

2.1.2.1 Đặc điểm sinh trưởng [1], [9]

Nấm mốc là loài có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trên nhiều cơ chất khác nhau Tuy nhiên để chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt thì cũng còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố Một số yếu tố chính có ảnh hưỏng lớn đến sự sinh trưởng của nấm mốc như:

- Ánh sáng: Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng

Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950)

- Nhiệt độ: Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2oC đến 5oC, tốithích từ 22oC đến 27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 45oC, cá biệt

có một số ít loài có thể sống sót ở 0oC và ở 60oC

- pH : Nói chung, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường axit (pH=6) nhưng pH

tối thích là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967)

- Nồng độ oxi: Oxi cần thiết cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhóm hiếu khí

bắt buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi

- Nguồn dinh dưỡng: Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp

dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số loài sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh trên xác

bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định.

Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối ammonium

2.1.2.2 Đặc điểm sinh sản [1] , [2], [27], [28], [29]

Nói chung, nấm mốc sinh sản dưới ba hình thức: sinh sản sinh dưỡng, vô tính và hữu tính Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành hai loại giao tử đực và cái

a Sinh sản sinh dưỡng

- Sinh sản sinh dưỡng bằng khuẩn ti: là hình thức từ một khuẩn ti gãy ra những đoạn

nhỏ, những đoạn nhỏ này phát triển thành một hệ khuẩn ti

- Sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử dày: trên phần giữa của khuẩn ti hoặc phần đầu

khuẩn ti hình thành tế bào có màng dầy bao bọc, bên trong chứa nhiều chất dự trữ Gặp điều kiện thuận lợi bào tử dày sẽ nảy mầm thành một hệ sợi nấm Bào tử dày thường là đơn bào, đôi khi là hai hoặc nhiều tế bào

b Sinh sản vô tính

Sinh sản vô tính ở nấm mốc có hai hình thức:

- Bào tử kín: là bào tử hình thành trong một nang kín Từ một khuẩn ti mọc lên cuống

nang, cuống nang thường có đường kính lớn hơn đường kính khuẩn ti Cuống nang có loại phân nhánh và có loại không phân nhánh Trên cuống nang hình thành nang bào

tử

- Bào tử đính: là hình thức bào tử được hình thành bên ngoài cơ quan sinh bào tử chứ

không nằm trong nang kín Hình thức này có nhiều loại khác nhau Có loại bào tử nằm hoàn toàn bên ngoài cơ quan sinh bào tử Có loại mọc chồi thành bào tử thứ nhất rồi

bào tử thứ nhất lại mọc chồi thành bào tử thứ hai, cứ như thế tạo thành chuỗi Có loại các bào tử được liên tiếp mọc ra từ đỉnh cuống sinh bào tử đẩy dần thành một chuỗi trong đó bào tử ở cuối chuỗi được sinh ra đầu tiên gọi là chuỗi gốc non.

c Sinh sản hữu tính

Nấm mốc có 3 hình thức sinh sản hữu tính - đẳng giao, dị giao và tiếp hợp

- Đẳng giao: Từ sợi khuẩn ti sinh ra các túi giao tử trong có chứa giao tử Các giao tử

sau khi ra khỏi túi kết hợp với nhau thành hợp tử Hợp tử phân chia giảm nhiễm thành các bào tử Mỗi bào tử khi được giải phóng ra từ hợp tử có thể phát sinh thành sợi nấm

- Dị giao: là trường hợp các giao tử và túi giao tử ở cơ thể “đực” và “cái” khác nhau Ở

lớp nấm noãn (Oomycestes) cơ quan sinh sản cái gọi là noãn khí ở trong chứa noãn cầu Cơ quan sinh sản đực gọi là hùng khí có hình ống cong

- Tiếp hợp: Hình thức sinh sản thường có ở nấm tiếp hợp Từ 2 khuẩn ti khác nhau gọi

là sợi âm và sợi dương mọc ra 2 mấu lồi gọi là nguyên phối nang Các nguyên phối nang mọc hướng vào nhau dần dần hình thành màng ngăn với khuẩn ti sinh ra nó tạo thành tế bào đa nhân Hai tế bào đa nhân tiếp hợp với nhau tạo thành hợp tử đa nhân gọi là bào tử tiếp hợp có màng dầy Hợp tử sau một thời gian nảy mầm mọc thành một ống mầm Đầu ống mầm sau phát triển thành một nang vô tính chứa những bào tử Ống mầm trở thành cuống nang giống như trường hợp hình thành bào tử kín Sau một thời gian nang vỡ giải phóng bào tử ra ngoài Mỗi bào tử phát triển thành một sợi nấm

2.1.3 Phân loại nấm mốc [9]

Nấm mốc được chia làm năm lớp gồm: Lớp Cổ khuẩn, lớp Tảo khuẩn, lớp Nang khuẩn, lớp phụ Tiếp hợp khuẩn, lớp nang khuẩn Ascomycetes, lớp Đảm khuẩn, lớp nấm Bất toàn

Trong giới nấm, một số loại thường gặp và ảnh hưởng lớn tới cuộc sống của con

người là Mucor, Rhizopus (lớp phụ Tiếp hợp khuẩn), Aspergillus, Penicillium (lớp

nang khuẩn Ascomycetes) Chúng được phân biệt dựa trên những đặc điểm được mô tả

Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái và sinh sản của một số loài nấm mốc thường gặp

- Sợi nấm có dạng lông tơ, có màu xanh

-Sợi nấm đơn bào

Bào tử được tạo thành trong các túi được gọi là

- Một số loài có khả năng lên men rượu và oxy hoá Chúng được dùng trong sản xuất axit hữu cơ, rượu và enzym

Rhizopus

- Khuẩn ty hình thành những nút và

từ đây sẽ mọc rễ cắm sâu vào cơ chất và mọc những cuống sinh bào tử nang

- Bào tử nang lúc đầu trắng, sau chín thì hoàn toàn đen

- Sản xuất enzym, axit thực phẩm, chuyển hoá thuốc

- Làm tương chua và nhão

Aspergillus

-Khuẩn ty có vách ngăn Trên đầu tế bào hình chai mọc các cuống sinh bào

tử đính Các bào tử đính xòe ra như những bông hoa cúc

- Màu sắc: A niger màu đen; A oryzae

màu vàng hoa cau;

A awamori màu đen;

A flavus màu vàng xanh; A usami màu

đen nâu

-Sợi nấm đa bào Đầu sợi nấm sinh sản phình to

ra tạo thành các tế bào hình chai và các chuỗi đính bào tử

vì thế gọi là bào tử hở ha bào tử ngoại sinh

-Sản xuất axit citric, các enzym ứng dụng trong sản xuất tương, chao, rượu…

Penicillium

- Khuẩn ty có vách ngăn và phân nhánh

Toàn bộ nhánh sinh đính bào tử có hình dáng giống cái chổi

- Sợi nấm có màu xanh

- Sản xuất chất kháng sinh Penicillium và nhiều loài được dùng để làm chín phomat

2.1.4 Vị trí và vai trò của nấm mốc [9], [27], [29]

Nấm mốc là một nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong thiên nhiên Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá vật chất, khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Khả năng chuyển hoá vật chất của chúng được ứng dụng trong nhiều ngành, đặc biệt là chế biến thực phẩm (làm rượu, làm tương, nước chấm v.v )

Từ lâu, nhân dân ta đã biết sử dụng các quá trình lên men nhờ nấm mốc để chế biến tương, đậu phụ… Trong những năm gần đây, nấm mốc đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men ở hầu hết các nước trên thế giới Nhiều loài nấm mốc được dùng trong công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym (amylase, protease, lipase, pectinase…) hoặc dùng để chế biến các loại thực phẩm (đường hoá tinh bột, chế tạo nước chấm, chế biến thức ăn gia súc…) Trong đó nổi bật nhất là các loại pho mát như Roquerfort, Danish Blue, Camembert và Brie có được hương vị đặc biệt là nhờ vào nấm mốc

Nấm mốc cũng giúp tổng hợp những loại axit hữu cơ (axit oxalic, citric, gluconic ), vitamin (nhóm B, riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzim và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược

đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới

Ngoài ra, nấm mốc đã góp phần lớn lao vào việc khám phá ra chất kháng

sinh Chất Penicillin, do Sir Alexander Fleming tìm ra vào năm 1928, đã cứu sống

nhiều mạng người hơn cả các phát minh khác hợp lại Penicillin là một sản phẩm của

nấm mốc Penicillium chrysogenum và hiện vẫn còn là một trong những chất kháng

sinh an toàn và sử dụng rộng rãi nhất

Tuy nhiên, phần lớn các loài nấm mốc gây hại đối với chúng ta Một trong những tác hại lớn nhất của nấm mốc là làm hư các hạt giống và ngũ cốc tồn kho Một vài loại

nấm mốc như Aspergillus, Penicillium và Eurotium có khả năng phát triển nhanh trong

những điều kiện đặc biệt và tấn công các hạt giống và ngũ cốc Vì vậy các loại thực phẩm này phải được sấy khô xuống tới một mức ẩm độ thích hợp.

Nấm mốc không những làm hư hại thực phẩm mà lại còn có thể tiết ra độc tố gây bệnh hay làm chết người Một trong những độc tố trên là aflatoxin do nấm mốc

Aspergillus flavus tiết ra Loại nấm mốc này thường hay thấy trong các loại hạt có dầu

nhất là trong lạc Khi phát triển nấm làm lạc bị mốc xanh hay mốc vàng Aflatoxin là một độc tố rất độc, bền với nhiệt Khi đem rang lạc mốc thì mặc dù nhiệt độ nóng rất cao các bào tử của mốc bị tiêu diệt nhưng độc tố của chúng vẫn không bị phá hủy hoàn toàn Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính, độc tố aflatoxin còn là tác nhân gây ung thư gan

Hai độc tố cũng nguy hiểm là islanditoxin do nấm mốc Penicillium islandicium tiết ra và citrinin tiết ra bởi nấm mốc Penicillium citrinum Cả hai loại nấm mốc trên

đều phát triển trên gạo làm cho gạo có màu đen hay vàng Thí nghiệm cho thấy những người ăn nhiều gạo mốc thường bị tổn thương về gan, xơ gan và ung thư

2.2 Tổng quan về nấm mốc Aspergillus oryzae [1], [2], [5],[17], [18], [19]

A oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002) Bào tử của A oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin.

Cơ thể sinh trưởng của nấm mốc A oryzae

là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều

ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách

ngăn, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa

bào) Từ những sợi nằm ngang này hình thành

những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử,

ở đó có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính

bào tử của A oryzae thường dài 1-2 mm nên có

Hình 2.4 Nấm mốc A oryzae

thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính

bào tử Đính bào tử của A oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau.

Đặc điểm của giống A oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào

(amylase, protease, pectinase,…) Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Các bào tử này dễ bị gió cuốn bay xa khi gặp điều kiện thuận lợi

oliu Còn nấm mốc A oryzae khi mới phát triển, hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển

dần sang màu vàng lục và khi già chuyển hẳn sang màu vàng

Hình 2.5 Bào tử nấm mốc A oryzae Hình 2.6 Bào tử nấm mốc A flavus

Bảng 2.2 Thành phần hoá học ở bào tử trần của A oryzae

(tính theo % trọng lượng chất khô, Becker (1963)).

2.2.1 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae [1], [9]

Nấm mốc A oryzae là một trong những loại nấm mốc có khả năng sinh trưởng và

phát triển dễ dàng trên nhiều cơ chất khác nhau Tuy nhiên để đảm bảo cho chúng sinh trưởng tốt và khả năng sinh enzym nhiều nhất thì chúng ta cần đáp ứng tối thiểu một số điều kiện sau:

- Độ ẩm môi trường: Độ ẩm tốt nhất cho sự hình thành enzym của nấm mốc A oryzae

là 55-60% Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển

- Độ ẩm tương đối của không khí: Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hoà

tức là độ ẩm 100% đều thích hợp cho nấm mốc phát triển Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hoà để tránh cho môi trường khỏi bị khô

-Ảnh hưởng của oxi: A oryzae là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình

thường khi đầy đủ oxy Theo thực nghiệm, để thoả mãn cho sự hô hấp của nấm mốc A oryzae trong toàn bộ chu kỳ phát triển cứ cách một giờ, môi trường cần khoảng 1,7m3

không khí A oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong không khí đạt 8%.

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự

sinh trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzym amylase Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzym là 28-32oC Nhiệt độ do nấm mốc tỏa

ra môi trường có thể bị nóng lên 40oC hoặc lớn hơn

- Ảnh hưởng của pH: pH thích hợp cho A oryzae là môi trường axit yếu khoảng

5,5-6,5 Các môi trường tự nhiên từ cám, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này

- Ảnh hưởng của các nguyên tố đa lượng và vi lượng

+ Mg2+ có ảnh hưởng tới độ biến nhiệt của enzym Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp amylase bởi nấm sợi Khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp α-amylase là 0,05%

+ Photpho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic photpholipit axit) và nhiều coenzym, đồng thời để photphoril hóa gluxit trong quá trình oxy hóa sinh học Photpho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzym Các muối photphat thường được dùng với nồng độ cao tới 0,15M Hoạt độ của α-amylase tăng cao khi có 0,1% KH2PO4.

+ Canxi (Ca) cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzym này Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease (Hsiuet amiloza, 1964) Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng canxi trong môi trường là 0,01-0,05%

+ Lưu huỳnh (S) kích thích sự tạo amylase (S có trong thành phần của các amino axit quan trọng: methionine, cystein, cystine) Lưu huỳnh với hàm lượng 0,04g/ml môi

trường là thích hợp nhất cho A oryzae tạo amylase.

Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vi lượng như: coban, kẽm…và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzym amylase như: đồng, thủy ngân…

2.2.2 Vai trò của nấm mốc Aspergillus oryzae trong công nghệ thực phẩm [4], [5],

[15], [16], [17], [18]

A oryzae có khả năng tiết ra môi trường các enzym thủy phân như xenlulase,

pectinase, xylanase và hemixenlulase khi sống trên môi trường có nguồn cơ chất tương

ứng Trong thực tế A oryzae đã được ứng dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất,

chế biến thực phẩm như nước mắm, bia, bánh kẹo… và trong công nghiệp sản xuất các enzym (amylase, protease, lipase, hemixenlulase, xenlulase, oxidoreductase…)

Ở Nhật Bản A oryzae được sử dụng trong quá trình sản xuất thức ăn như xì dầu,

rượu sakê, các sản phẩm lên men truyền thống như tương miso, koji, tempeh… Ở Việt

Nam A oryzae được sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tương Tác dụng hữu ích của

chúng là tiết ra enzym amylase và glucoamylase để thủy phân tinh bột tạo ra các sản phẩm như glucose, dextrin….

Amylase là một trong những loại enzym được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp thực phẩm Trong nhóm enzym amylase thì hai loại enzym α-amylase và β-amylase có vai trò quan trọng hơn hết Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-amylase thì hiệu suất thuỷ phân đạt tới 95%

• α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucozit nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp

• β-amylase là một enzym ngoại bào (exoenzym) Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-amylase phân cắt các liên kết α- 1,4 - glucozit nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucozit đứng kế cận liên kết α-1,6- glucozit thì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccarit còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucozit và được gọi là β-dextrin

Tinh bột → maltose (54-58%)+ β-dextrin(42-46%)

• Glucoamylase hay γ-amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật Đặc biệt là

từ các loại nấm mốc Aspergillus, Penicillium và Rhizopus

Glucoamylase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thủy phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần) Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thủy phân, cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân Nhất là với các α-glucan mạch dài (amylose và amylopectin) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia cuả các loại enzym khác Glucoamylase thủy phân các polysaccarit có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ Các polysaccarit có nhánh như amylopectin, glucogen, β- dextrin

bị glucoamylase thủy phân khá nhanh

2.3 Tình hình nghiên cứu nấm mốc Aspergillus oryzae ở Việt Nam và trên thế giới

Người nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine Ông sinh ngày 03/10/1854 tại Takaoka, Nhật Bản Năm 1894 ông lấy được bằng sáng chế về quá trình sản xuất men đường hóa (US Patent số 252.823)

trình bày phương pháp nuôi nấm sợi Aspergillus trên cám và dùng cồn để chiết xuất ra

enzym amylase (enzym đường hóa tinh bột) Sau đó Takamine đã chứng minh được men này có thể ứng dụng trong y học và ông nhận được bằng sở hữu trí tuệ

Mặc dầu nghề làm tương ở Việt Nam và nghề làm sakê ở Nhật Bản đã có từ lâu đời, nhưng việc chiết rút ra enzym và sản xuất chế phẩm enzym thì Takamine là người

đi tiên phong

Bộ gen di truyền của A oryzae hiện đã được phân tích và biết rất kỹ vào năm

2001 Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base

Hiện nay thì loại nấm mốc A oryzae đã được nghiên cứu rộng rãi và đã sản xuất

được trên quy mô công nghiệp [11], [16]

Ở Việt Nam thì việc nghiên cứu loại nấm mốc này ngày càng được chú trọng Việc nghiên cứu chủ yếu được thực hiện ở các viện nghiên cứu sinh học, các trường đại học, học viện Nhiều nghiên cứu đã đạt được thành công và được ứng dụng trong thực tiễn sản xuất như đề tài nghiên cứu của tác giả Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thị Ánh Tuyết cùng đồng nghiệp (2006) đã khảo sát một số tính chất của chế phẩm protease từ

canh truờng nuôi cấy bề mặt của nấm mốc A oryzae và ứng dụng enzyme trong sản xuất nước mắm Nhóm nghiên cứu đã chứng minh được nấm mốc A oryzae có thể sản

sinh ra được loại enzyme protease có khả năng chịu được nồng độ muối cao Chính nhờ vậy mà việc ứng dụng chế phẩm protease này trong sản xuất nước mắm có thể rút ngắn được thời gian thuỷ phân protein [20]

Một số nghiên cứu về loại nấm mốc này đã được ứng dụng để tạo ra các loại sản phẩm mới an toàn chất lượng hơn như Võ Thị Hạnh cùng cộng sự (2008) ở phòng Vi

sinh, viện Sinh học nhiệt đới đã nghiên cứu ứng dụng nấm mốc A oryzae để sản xuất

ra loại nước tương an toàn theo TCVN [4] Nguyễn Hữu Huân (2009) ở trường đại học

Thái Nguyên đã nghiên cứu, tuyển chọn nấm mốc A oryzae để sinh tổng hợp

endo-β-1,4-glucanase [5] và Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2008) đã nghiên cứu đánh giá một số

tính chất lí hoá của xylanase từ chủng nấm mốc A oryzae DSM1863 [13]

Trên thế giới thì việc nghiên cứu nấm mốc này đã bắt đầu từ nhiều thế kỉ nay Một

số tác giả như Jin Fujita và cộng sự (2003) [18], Morten Carlsen (1995, 2003) [21] Ruohang Wang và cộng sự (2003) [22] đã nghiên cứu để sản xuất các chế phẩm

enzyme protease, amylase, phytase… từ nấm mốc A oryzae để ứng dụng trong công

nghiệp sản xuất các chế phẩm lên men

A oryzae được sử dụng trong công nghiệp sản xuất α- amylase và được ứng dụng

trong các quá trình lên men thực phẩm đã được nghiên cứu từ nhiều thế kỉ nay (Sooriyamoorthy và cộng sự 2004 ; Geiser và cộng sự 1998) Đây là một trong những loại nấm mốc có khả năng sản sinh ra enzym α- amylase có hiệu quả nhất trong giới nấm và loại enzym này đã được dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất các loại bánh mì, các sản phẩm lên men như nước tương, miso, sakê…[15] Tarek

Elbashiti và cộng sự, (2010) đã nghiên cứu phân lập và nhận diện nấm mốc A oryzae

từ các nguồn gạo đậu tương để sản xuất nước tương có hương vị mới [23]

Ngoài ra, cũng có nhiều nghiên cứu về nấm mốc A oryzae để tạo ra các loại axit

như axit kojic, axit protease để chế biến các sản phẩm truyền thống koji tiêu biểu như Shitova và cộng sự [25], Hisao Ming Wan và cộng sự (2004) [16] Hay như Hai Yan

Sun cùng cộng sự (2008) đã nghiên cứu cải thiện khả năng thuỷ phân tinh bột sống nhờ

vào chủng nấm mốc này [16] Và KyungWoo Lee và cộng sự (2006) đã nghiên cứu A oryzae để sản xuất ra loại enzym có lợi trong việc chăn nuôi gia cầm [19]

Một số nghiên cứu đã đánh giá so sánh về hoạt lực enzym của loại nấm mốc này so với các loại enzym khác Cụ thể như đề tài của tác giả Guowan Su và cộng sự (2010) [15] đã nghiên cứu khả năng thuỷ phân protein đậu tương của enzym protease chiết

xuất từ nấm mốc A oryzae so với enzym protein thương mại Nhóm nghiên cứu đã chỉ

ra rằng enzym protease được chiết xuất từ nấm mốc A oryzae có hoạt tính cao hơn và

an toàn hơn trong sản xuất thực phẩm

Đa số các nghiên cứu về nấm mốc A oryzae trong nước và trên thế giới đều cho

thấy đây là một loại nấm mốc có lợi và được ứng dụng nhiều trong công nghệ sản xuất các loại thực phẩm như làm bia, nước tương , rượu, bánh… Nó đã và đang được nhiều ứng dụng nhiều không chỉ trong sản xuất thực phẩm mà còn ở một số lĩnh vực khác

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng

Các sản phẩm ngũ cốc bị hư hỏng, lên men bởi nấm mốc Ở đây chúng tôi tiến

hành phân lập nấm mốc A oryzae từ bốn nguồn tự nhiên đó là đậu tương, gạo, ngô và

sắn để lên mốc tự nhiên

3.1.2 Hoá chất sử dụng

- Môi trường Czapeck (phụ lục 1)

- Thuốc thử Lactophenol Amann (phụ lục 1)

3.1.3 Thiết bị dùng nghiên cứu

đã khử trùng Dùng que trang phân phối đều dung dịch lên mặt thạch Tiến hành nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 24h ở 350C, sau đó chọn khuẩn lạc rời cấy sang đĩa thạch đến khi thu được khuẩn lạc thuần.

3.3.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống [7]

Chủng nấm mốc trước khi sử dụng được hoạt hoá và làm sạch lại Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm chứa dung dịch Czapeck Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 35oC Sau 24 giờ, lấy que cấy nhúng vào dịch rồi cấy vạch lên đĩa thạch chứa môi trường Czapeck Nuôi trong tủ ấm cho khuẩn lạc phát triển Chọn khuẩn lạc cấy vào ống thạch nghiêng Giống được bảo quản trong ống thạch nghiêng ở 3 – 4oC trong vòng 2 tháng

3.3.3 Quan sát đặc điểm hình thái [1], [7]

Gieo cấy nấm mốc thuần khiết lên môi trường đặc và chọn lọc trong hộp peptri, có thể cấy thành đường hoặc thành 1-3 chấm trong mỗi hộp để quan sát khuẩn lạc Nuôi ở

35oC sau 3-5 ngày đem quan sát

3.3.4 Nhuộm, soi tế bào nấm mốc

3.3.4.1 Nhuộm màu tế bào [7]

* Nguyên tắc: Vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm là một quá trình hấp phụ Trong đa

số các trường hợp thuốc nhuộm kết hợp với vi sinh vật rất bền vững khó bị phá huỷ hoặc bị nước làm phai đi

* Cách tiến hành: Cho vài giọt canh trường nấm mốc và một giọt thuốc nhuộm lên

phiến kính, trộn đều, đậy lá kính lại để yên 2-3 phút rồi đem đi quan sát

3.3.4.2 Nhuộm bào tử nấm [22]

* Mục đích: Quan sát vi thể nấm mốc một cách rõ ràng hơn để từ đó bước đầu phân

biệt được một số loại nấm mốc dựa vào đặc điểm bào tử nấm

* Cách tiến hành: Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô Nhỏ một giọt