trong môi trƣờng khoáng MTK chứa 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng ở nhiệt độ 30°C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ.
2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase
Hoạt tính enzyme đƣợc định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong nƣớc cất dày khoảng 0,5 cm, đƣợc đục lỗ đƣờng kính 0,5 cm. Năm mƣơi μl dịch enzyme đƣợc cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong 4°C cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch đƣợc ủ 4- 6 giờ ở 37°C lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tƣơng đối của enzyme.
2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase glucanase
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử của Nelson/Samogi (Nelson N, 1944). Đơn vị hoạt độ là lƣợng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đƣờng khử tƣơng đƣơng 1 µl glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
Xây dựng đường chuẩn: Glucose đƣợc pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100 µg/ml. Một ml
dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo ở bƣớc sóng 660 nm. Độ hấp phụ và nồng độ
glucose đƣợc vẽ theo chƣơng trình Excel. Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 20-90 µg/ml. Đƣờng chuẩn có phƣơng trình y = 0,0064x - 0,0024. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bƣớc sóng 660 nm, x là nồng độ glucose (µg/ml) (Hình 2.1). 0.6 y = 0.0064x - 0.0024 R 2 = 0.9943 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 Nồng độ glucose (µg/ml) Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose
Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dịch enzyme. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ 5 phút ở 50°C sau đó bổ sung ngay các hóa chất định lƣợng đƣờng khử tạo thành.
Ống kiểm tra: Hút 0,5 ml cơ chất CMC, thêm các hóa chất định lƣợng đƣờng khử, sau đó bổ sung 0,5 ml dịch enzyme và tiến hành định lƣợng đƣờng khử ngay.
Một ml dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml hỗn hợp muối AB. Hỗn hợp đƣợc đun sôi cách thủy đúng 20 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 1 ml dung dịch asenomolybdate
O D ( 6
lắc đều đến khi hết bọt khí. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa
cơ chất còn dƣ và so màu ở bƣớc sóng 660 nm. Mẫu đối chứng thay dung
dịch cần định lƣợng đƣờng khử bằng nƣớc cất. Đối chiếu với đồ thị chuẩn suy ra hàm lƣợng đƣờng khử.