Ba mƣơi lăm chủng nấm A. oryzae do Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn chủng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất.
2.1.2. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Bể ổn nhiệt Trung Quốc
Box cấy LB-1234 Việt Nam
Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ) Việt Nam
Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ)
Cân phân tích BL 150S Sartorius (Đức)
Hệ thống chụp ảnh gel-doc Pharmacia (Thụy Điển)
Hệ thống điện di ngang Mupid α (Nhật Bản)
Hệ thống điện di SDS-PAGE Biometra (Đức)
Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc)
Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức)
Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)
Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức)
Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ)
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh 4°C, -20°C, -80°C Toshiba, Sanyo (Nhật bản)
2.1.3. Hóa chất
Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Hóa chất Hãng sản xuất (nƣớc)
Cao nấm men Difco (Mỹ)
CMC Sigma (Mỹ)
Kit tinh sạch plasmide QIA prep Spin Miniprep Qiagen (Mỹ)
Peptone Merck (Mỹ)
Sephadex G100 Pharmacia
Sodium dodecylsulfate Sigma (Mỹ)
Triton X-100 Merck (Đức)
Tween-20 BioBasic Inc (Mỹ)
2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
Dung dịch Amp gốc 100 mg/ml ampicillin
Dung dịch APS 10% ammonium persulfate
Dung dịch arsenomolypdate 5% (w/v) ammonium molybdate; 5% (v/v) H2SO4 đặc;
0,6% (w/v) Na2HAsO4.7H2O
Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml 88% phosphoric acid
Dung dịch Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric
acid; 30 ml dung dịch Bradford gốc
Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide
Dung dịch D 10% SDS; 25mM EDTA
Dung dịch muối A 20% (w/v) Na2SO4; 2,5% (w/v) Na2CO3; 2,5% (w/v) muối
Seignett; 2% (w/v) NaHCO3
Dung dịch muối B 15% CuSO4.5H2O; thêm vài giọt H2SO4 đặc
methanol; 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide
Dung dịch phá tế bào 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0
Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K
Dung dịch RNase 10 μg/ml Rnase
Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic
Dung dịch Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8,0
Dung dịch Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS
Dung dịch Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic
Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4
Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH
8,0
Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0
Đệm tra mẫu
protein 5X (biến tính)
0,05% Brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10%
SDS; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M
Tris-HCl, pH 6,8
Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol
Hỗn hợp muối AB Dung dịch muối A: dung dịch muối B = 25:1
2.1.5. Môi trƣờng
Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi cấy trong 3 ml môi trƣờng khoáng (MTK): 0,1% (w/v) peptone; 0,2% (w/v) KH2PO4; 0,03% (w/v) CaCl2.2H2O; 0,14% (w/v) (NH4)2SO4; 0,03% MgSO4.7H2O; 0,1% (w/v) cao nấm men; 1 ml dung dịch muối (18 mM FeSO4; 6,6 mM MnSO4; 4,8 mM ZnSO4.7H2O; 15 mM CoCl2); pH 6,5 khử trùng (Hong et al., 2001).
Cazpek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4; 0,05% (w/v) KCl; 2% sucrose; pH 6,5 khử trùng. Môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar.
Chủng E. coli DH5α đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 6,5 khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid tái tổ hợp, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 μg/ml ampicillin.
2.2. PHƢƠNG PHÁP