Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hƣởng rất mạnh tới hoạt tính của enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa là khác nhau. Trịnh Đình Khá (2006) khi nghiên cứu trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy các chất tẩy rửa Tween 20, Tween
80, Trixton X-100, SDS đều làm giảm hoạt tính của cellulase và SDS làm
giảm mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%. Các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, isopropanol và aceton) đều ức chế hoạt tính cellulase, riêng n-butanol ức chế mạnh mẽ hoạt tính cellulase chỉ còn 33- 63%. Đỗ Thị Tuyên và cs (2008) các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol không ảnh hƣởng mạnh tới hoạt tính xylanase từ chủng
A. ozyzae DSM1863, riêng n-butanol làm tăng và aceton làm giảm nhẹ hoạt tính xylanase. Tween
20 và Triton X-100 không ảnh hƣởng mạnh ở nồng độ thấp (0,2-1%) nhƣng làm giảm hoạt tính xylanase ở nồng độ cao 2%, trong khi đó SDS làm giảm hoạt tính enzyme mạnh ở tất cả các nồng độ.
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Chủng giống
Ba mƣơi lăm chủng nấm A. oryzae do Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn chủng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất.
2.1.2. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Bể ổn nhiệt Trung Quốc
Box cấy LB-1234 Việt Nam
Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ) Việt Nam
Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ)
Cân phân tích BL 150S Sartorius (Đức)
Hệ thống chụp ảnh gel-doc Pharmacia (Thụy Điển)
Hệ thống điện di ngang Mupid α (Nhật Bản)
Hệ thống điện di SDS-PAGE Biometra (Đức)
Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc)
Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức)
Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)
Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức)
Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ)
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh 4°C, -20°C, -80°C Toshiba, Sanyo (Nhật bản)
2.1.3. Hóa chất
Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Hóa chất Hãng sản xuất (nƣớc)
Cao nấm men Difco (Mỹ)
CMC Sigma (Mỹ)
Kit tinh sạch plasmide QIA prep Spin Miniprep Qiagen (Mỹ)
Peptone Merck (Mỹ)
Sephadex G100 Pharmacia
Sodium dodecylsulfate Sigma (Mỹ)
Triton X-100 Merck (Đức)
Tween-20 BioBasic Inc (Mỹ)
2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
Dung dịch Amp gốc 100 mg/ml ampicillin
Dung dịch APS 10% ammonium persulfate
Dung dịch arsenomolypdate 5% (w/v) ammonium molybdate; 5% (v/v) H2SO4 đặc;
0,6% (w/v) Na2HAsO4.7H2O
Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml 88% phosphoric acid
Dung dịch Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric
acid; 30 ml dung dịch Bradford gốc
Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide
Dung dịch D 10% SDS; 25mM EDTA
Dung dịch muối A 20% (w/v) Na2SO4; 2,5% (w/v) Na2CO3; 2,5% (w/v) muối
Seignett; 2% (w/v) NaHCO3
Dung dịch muối B 15% CuSO4.5H2O; thêm vài giọt H2SO4 đặc
methanol; 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide
Dung dịch phá tế bào 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0
Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K
Dung dịch RNase 10 μg/ml Rnase
Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic
Dung dịch Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8,0
Dung dịch Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS
Dung dịch Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic
Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4
Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH
8,0
Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0
Đệm tra mẫu
protein 5X (biến tính)
0,05% Brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10%
SDS; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M
Tris-HCl, pH 6,8
Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol
Hỗn hợp muối AB Dung dịch muối A: dung dịch muối B = 25:1
2.1.5. Môi trƣờng
Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi cấy trong 3 ml môi trƣờng khoáng (MTK): 0,1% (w/v) peptone; 0,2% (w/v) KH2PO4; 0,03% (w/v) CaCl2.2H2O; 0,14% (w/v) (NH4)2SO4; 0,03% MgSO4.7H2O; 0,1% (w/v) cao nấm men; 1 ml dung dịch muối (18 mM FeSO4; 6,6 mM MnSO4; 4,8 mM ZnSO4.7H2O; 15 mM CoCl2); pH 6,5 khử trùng (Hong et al., 2001).
Cazpek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4; 0,05% (w/v) KCl; 2% sucrose; pH 6,5 khử trùng. Môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar.
Chủng E. coli DH5α đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 6,5 khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid tái tổ hợp, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 μg/ml ampicillin.
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme
Chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng khoáng MTK chứa 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng ở nhiệt độ 30°C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ.
2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase
Hoạt tính enzyme đƣợc định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong nƣớc cất dày khoảng 0,5 cm, đƣợc đục lỗ đƣờng kính 0,5 cm. Năm mƣơi μl dịch enzyme đƣợc cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong 4°C cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch đƣợc ủ 4- 6 giờ ở 37°C lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tƣơng đối của enzyme.
2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase glucanase
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử của Nelson/Samogi (Nelson N, 1944). Đơn vị hoạt độ là lƣợng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đƣờng khử tƣơng đƣơng 1 µl glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
Xây dựng đường chuẩn: Glucose đƣợc pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100 µg/ml. Một ml
dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo ở bƣớc sóng 660 nm. Độ hấp phụ và nồng độ
glucose đƣợc vẽ theo chƣơng trình Excel. Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 20-90 µg/ml. Đƣờng chuẩn có phƣơng trình y = 0,0064x - 0,0024. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bƣớc sóng 660 nm, x là nồng độ glucose (µg/ml) (Hình 2.1). 0.6 y = 0.0064x - 0.0024 R 2 = 0.9943 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 Nồng độ glucose (µg/ml) Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose
Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dịch enzyme. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ 5 phút ở 50°C sau đó bổ sung ngay các hóa chất định lƣợng đƣờng khử tạo thành.
Ống kiểm tra: Hút 0,5 ml cơ chất CMC, thêm các hóa chất định lƣợng đƣờng khử, sau đó bổ sung 0,5 ml dịch enzyme và tiến hành định lƣợng đƣờng khử ngay.
Một ml dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml hỗn hợp muối AB. Hỗn hợp đƣợc đun sôi cách thủy đúng 20 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 1 ml dung dịch asenomolybdate
O D ( 6
lắc đều đến khi hết bọt khí. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa
cơ chất còn dƣ và so màu ở bƣớc sóng 660 nm. Mẫu đối chứng thay dung
dịch cần định lƣợng đƣờng khử bằng nƣớc cất. Đối chiếu với đồ thị chuẩn suy ra hàm lƣợng đƣờng khử.
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
2.2.4.1. Khảo sát thời gian sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30°C, có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme đƣợc thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24-56 giờ (cách nhau 12 giờ) để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase.
2.2.4.2. Tối ƣu nồng độ cơ chất cảm ứng
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30°C và bổ sung cơ chất CMC ở các nồng độ khác nhau 0,5; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 2,7. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính.
2.2.4.3. Tối ƣu nguồn carbon
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30°C và bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó, nguồn cao nấm men đƣợc thay bằng các nguồn carbon khác là lactose, glucose, lõi ngô, bã mía, vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cám, CMC, vỏ quýt ở cùng nồng độ ban đầu (0,1%). Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt
tính.
Sau khi xác định đƣợc nguồn carbon tốt nhất, để tối ƣu nồng độ carbon, chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK
pH 6,5 ở 30°C có nồng độ carbon khác nhau: 0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau 0,2%). Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme đƣợc xác định.
2.2.4.4. Tối ƣu nguồn nitrogen
Trong môi trƣờng MTK nuôi cấy chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 ban đầu, nguồn nitrogen sử dụng là peptone nhƣng không phù hợp để sản xuất chế phẩm enzyme do giá thành chi phí sản xuất rất cao. Với mục tiêu là sử dụng nguyên liệu sẵn có, peptone đƣợc thay thế bằng các nguồn nitrogen khác nhƣ NaNO3, (NH4)2SO4, bột cá, bột đậu tƣơng, urea với cùng nồng độ ban đầu (0,1%), bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng và nguồn carbon đã đƣợc tối ƣu ở 30°C, pH 6,5. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính.
Sau khi xác định đƣợc nguồn nitrogen tốt nhất, để tối ƣu nồng độ nitrogen
chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng có nồng độ nitrogen khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 1,5; 1,8 và 2%. Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme đƣợc xác định.
2.2.4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng cùng nguồn carbon và nitrogen đã đƣợc tối ƣu, nuôi lắc 200 vòng/phút ở pH 6,5 và các nhiệt độ khác nhau: 28, 30 và 37°C. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt
tính.
2.2.4.6. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng
Chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy 120 giờ trong môi trƣờng MTK có pH thay đổi từ 3,5-8,5 ở 28°C, lắc 200 vòng/phút để xác định pH môi trƣờng tối ƣu.
2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanaseDịch enzyme thô Dịch enzyme thô ↓ Ly tâm 10 phút ở12500 vòng/phút ↓ Dịch trong ↓
Tủa muối ammonium sulfate 65% ↓ Thẩm tích loại muối ↓ Qua cột Sephadex G100 ↓ Enzyme tinh sạch
Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045
Bốn mƣơi ml dịch enzyme sau khi ly tâm 10 phút ở 12500 vòng/phút đƣợc tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và để ở 4°C qua đêm. Sau khi ly tâm thu tủa ở 12500 vòng/phút, tủa đƣợc hòa vào đệm 100 mM acetate pH 5,5 và thẩm tích loại muối (Hong et al., 2001). Để thấm tích loại muối,
15 ml mẫu đƣợc hút vào trong túi thẩm tích đã hoạt hóa và kẹp chặt hai đầu. Cho túi vào cốc chứa 200 ml nƣớc cất có khuấy từ liên tục và đặt cốc vào trong đá. Sau 3 giờ mẫu đƣợc thay nƣớc một lần để loại muối. Dịch tủa sau khi loại muối đƣa qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100. Cột có kích thƣớc
chảy là 25 ml/h. Thể tích mỗi phân đoạn đƣợc thu 2 ml (thu 20 phân đoạn). Hàm lƣợng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc xác định trong mỗi phân đoạn.
2.2.6. Điện di SDS-PAGE
Khối lƣợng tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch của enzyme đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide theo Laemmli (1970). Thành phần Gel tách (µl) Gel co (µl) H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015
Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 18-20 mA cho gel co và 25-30 mA cho gel tách.
2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase2.2.7.1. Xác định nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu 2.2.7.1. Xác định nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu
Để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với cơ chất 0,5% CMC trong đệm 0,1 M natri acetate pH 5,0 ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-80°C trong 5 phút.
Để tìm pH tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% CMC trong đệm ở các pH khác nhau từ 3,5-7,5 ở nhiệt độ tối ƣu là 55°C trong 5 phút.
2.2.7.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH
Để xác định độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae
VTCC-F-045, dịch enzyme đã tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-60°C trong các khoảng thời gian là 1; 2; 4; 6 và 8 giờ. Dịch enzyme sau khi ủ đƣợc xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase với thời gian phản ứng là 5 phút và nhiệt độ tối ƣu là 55°C.
Để xác định độ bền pH, dịch enzyme đƣợc ủ ở các đệm có nồng độ 0,1 M ở các pH khác nhau từ 4,5-7,5 (đệm natri acetate pH từ 4,5-5,5; đệm phosphate pH từ 6,0-7,5). Sau khi ủ 1; 2; 4 và 6 giờ ở nhiệt độ phòng, hoạt tính enzyme còn lại đƣợc xác định trong thời gian phản ứng là 5 phút.
2.2.7.3. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ
Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính của endo- β-
1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol, acetone và n-butanol nồng độ 80% ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55°C trong thời gian phản ứng là 5 phút.
2.2.7.4. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa
Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính của endo-β-1,4- glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với các chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS với các nồng độ 0,4-2,0% ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55°C trong thời gian 5 phút để đánh giá ảnh hƣởng của chúng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase.
Để đánh giá mức độ ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mgml protein) đƣợc ủ
với các ion kim loại Ag+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+, Ni+, Mn2+, K+ và EDTA với các nồng độ 4 mM, 8 mM và 12 mM ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại đƣợc xác định sau 4 giờ ủ, thời gian phản ứng 5 phút ở nhiệt độ phản ứng là 55°C.
2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số
Tế bào nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Czapek ở 30°C, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ dịch nuôi đƣợc ly tâm 10 phút với 10000 vòng/phút. Tủa tế bào đƣợc nghiền nhẹ trong nitơ lỏng, sau đó bổ sung 600 µl đệm phá tế bào lắc nhẹ và 65 µl lysozyme, ủ 45 phút ở 37°C. Sau đó hỗn hợp đƣợc bổ sung 5 µl protease K ủ 2-3 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi phía trên đƣợc thu sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol tỷ lệ 1:1 để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa sau khi ly tâm 15 phút ở 4°C với 12000 vòng/phút đƣợc làm khô dƣới ánh sáng đèn và bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm