3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu
Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ xúc tác thủy phân cơ chất của enzyme. Mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch và cơ chất CMC đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-80°C, trong 5 phút. Hoạt tính tăng dần trong khoảng từ 19-100% ở dải nhiệt độ từ 30-55°C và đạt tối đa 67,69 U/mg ở 55°C. Khi nhiệt độ tiếp tục tăng thì hoạt tính enzyme giảm dần, chỉ đạt 63% ở 80°C (Hình 3.12 và Bảng 4.12).
120 80 40 0 20 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Theo những nghiên cứu trƣớc đây, endo-β-1,4-glucanase từ chủng
A. oryzae KBN616 là Cel A và Cel B có nhiệt độ tối ƣu lần lƣợt ở 55°C và 45°C (Kitamoto et al., 1996); trong khi endo-β-1,4-glucanase gồm Cel-1 và
Cel-3 của A. oryzae là 50°C và 60°C (Fukuda et al., 2002); endo-β-1,4-
glucanase (eng1) từ chủng A. niger IFO31125 hoạt động tốt nhất ở 70°C (Hong et al., 2001); còn CMCase của chủng A. niger Z10 là 40°C (Coral et
al., 2002).
3.5.2. pH phản ứng tối ƣu
pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính xúc tác của enzyme, vì nó ảnh hƣởng tới mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hƣởng tới độ bền protein enzyme. Để khảo sát pH tối ƣu của endo-β-1,4-glucanase, phản ứng giữa enzyme với cơ chất CMC (CMC đƣợc pha trong các đệm có pH khác nhau từ 3,5-7,5) ở 55°C và sau 5 phút ủ. Hoạt tính đạt cực đại 95,88 U/mg ở pH 5,5 và tƣơng đối cao ở dải pH từ 5,5-6,5 (48,03-95,88 U/mg) (Hình 3.13 và Bảng 4.13). H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 ,
120 80 40 0 3 4 5 6 7 8 pH phản ứng
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính
endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045
Theo nghiên cứu trƣớc đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng Trametes hirsuta hoạt động mạnh nhất là 5,0; endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al.,
2002). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae KBN616 gồm CelA và CelB lần lƣợt là 5,0 và 4,0; CMCase của chủng A. niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH là 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002).
3.5.3. Độ bền nhiệt
Dƣới tác động của nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và bị ảnh hƣởng tới hoạt tính. Một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc và trung tâm hoạt động của enzyme bị đứt gãy bởi nhiệt độ. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào thời gian và nhiệt độ ủ enzyme. Dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau 30, 45, 50, 55 và 60°C. Kết quả cho thấy, từ 0-4 giờ ở các nhiệt độ 30, 45, 55 và 60°C hoạt tính vẫn đạt từ
H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 ,
47,61-68,81 U/mg. Đặc biệt ở 4 giờ đối với 30°C và 55°C hoạt tính đạt 65,74- 68,81U/mg, tăng 21-27%
so với đối chứng. Từ 6-8 giờ ủ ở 45°C và 30°C hoạt tính enzyme vẫn duy trì đƣợc từ 68-85%. Ở nhiệt độ còn lại giảm khá mạnh, chỉ đạt 38% ở 50°C (Hình 3.14 và Bảng 4.14). Nhƣ vậy, endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 bền ở dải nhiệt độ 30-45°C. 150 150 100 100 50 50 0 0 2 4 Thời gian ủ 6 iờ) 8 10
0 Bảng 3.14. Ả3n0 h hƣ45ởng 5c0ủa n5h5iệt đ6ộ0 lên độ bền
0 endo-β-12,4-glucanase củ4a c T hủ h n ờ g i g A i . a o n ry ủ z6a (g e iờ V ) TCC-F- 0458 10 30 45 50 55 60
Kitamoto và cs (2006) khi nghiên trên chủng A. oryzae KBN616 cho rằng CelA bền ở nhiệt độ dƣới 55°C sau 20 giờ ủ, nhiệt độ trên 60°C CelA không có hoạt tính; trong khi đó CelB thì bền ở nhiệt độ dƣới 50°C và mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 55°C. Cũng ở chủng A. oryzae sau khi ủ enzyme (Cel-1 và Cel-3) ở dải nhiệt độ khác nhau (10-80°C) trong 30 phút, Yamane và cs (2002) nhận thấy Cel-1 bền ở dải nhiệt độ dƣới 50°C và Cel-3 bền ở dải nhiệt độ dƣới 60°C. Ở chủng A. niger endo-β-1,4-glucanase sau khi
ủ ở 80°C hoạt tính còn lại 56% (Hong et al., 2001). Endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. terreus M11 vẫn còn duy trì đƣợc 60% hoạt tính sau khi ủ ở 70°C trong 1 giờ (Gao et al., 2008).
H o ạ t tí n h e n d o - β - H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 , (
3.5.4. Độ bền pH
pH ảnh hƣởng tới độ bền enzyme, nên việc lựa chọn pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Tùy loại protein enzyme mà có độ bền trong một môi trƣờng pH nhất định. Ở đây, độ bền của endo-β-1,4-glucanase đƣợc khảo sát trong các đệm khác nhau với dải pH 4,5-7,5. Kết quả cho thấy sau 1 giờ ủ, chỉ có ở pH 6,0 hoạt tính tƣơng đối của enzyme vẫn giữ đƣợc 88%, trong khi ở các pH còn lại giảm khá mạnh, giảm mạnh nhất ở pH 6,5 hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 60%. Ở các thời gian ủ 2, 4 và 6 giờ hoạt tính còn lại của enzyme ở các pH khảo sát giảm khá mạnh, giảm mạnh nhất ở pH 6,5 hoạt tính chỉ đạt 53% và giảm ít nhất ở pH 6,0 hoạt tính đạt
64%. Nhƣ vậy, endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 bền ở pH 6,0 sau 1 giờ ủ (Hình 3.15 và Bảng 4.15). 120 80 120 40 80 0 40 0 2 4 6 8
Thời gian ủ (giờ)
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền
endo0-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F- 045
0 2 Thời gian ủ (giờ)4 6 8 pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 6,0 pH 7.5
Những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, endo-β-1,4-glucanase gồm CelA H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 , 4 H -
và CelB của chủng A. oryzae KBN616 bền ở dải pH từ 3,0-7,0 sau 20 giờ ủ ở 30°C, tuy nhiên CelB không bền ở pH 3,0 và 7,0 giống CelA (Kitamoto et al.,
1996); Trong khi enzyme từ chủng A. niger bền ở dải pH từ 3,0-10,0 sau 1 giờ
ủ (Hong et al., 2001). CMCase gồm C-I và C-II của chủng Cephalosporium
sp RYM-202 bền ở dải pH rộng và hoạt tính vẫn còn duy trì trên 80% ở pH 11 sau 24 giờ ủ (Kang and Rhee, 1995). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. terreus M11 bền ở dải pH từ 2,0-5,0 (Gao et al., 2008).
3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ
Trong dung dịch enzyme, dung môi hữu cơ làm giảm hằng số điện môi và tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ, dịch enzyme đƣợc ủ cùng với các dung môi khác nhau ở nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy, cả 5 dung môi khảo sát làm giảm hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase. Trong đó, n-butanol ảnh hƣởng mạnh nhất làm giảm hoạt tính tƣơng đối của enzyme chỉ còn 43%. Acetone và ethanol làm hoạt tính tƣơng đối của enzyme còn 56% và 76%. Isopropanol và methanol làm giảm hoạt tính ít hơn so với đối chứng (80- 81%) (Hình 3.16 và Bảng 4.16). Nhƣ vậy, các dung môi hữu cơ khảo sát ít ảnh hƣởng tới hoạt tính của endo-β-
1,4-glucanase trừ n- butanol. 120 80 40 0
ĐC MetOH EtOH IsOH Act n-BtOH
Dung môi hữu cơ
H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 ,
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4- glucanase
3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa
Các chất tẩy rửa có hoạt động bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS ảnh hƣởng tới hoạt tính enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với các chất tẩy rửa có nồng độ khác nhau là 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 và 2,0% ở nhiệt độ phòng, sau 4 giờ ủ hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55°C.
Kết quả cho thấy, nồng độ các chất tẩy rửa càng cao thì hoạt tính của enzyme giảm càng mạnh. Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS ở 5 nồng độ đều làm giảm hoạt tính tƣơng đối của enzyme so với đối chứng. Hoạt tính tƣơng đối của enzyme khi ủ với Tween 20 ở nồng độ 0,4-0,8% vẫn còn duy trì đƣợc 63-77% so với đối chứng; trong khi ở nồng độ 1,2- 2,0% làm hoạt tính enzyme giảm khá mạnh, hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 31% ở nồng độ 2,0%. Tween 80, Triton X-100 và SDS làm hoạt tính tƣơng đối của enzyme giảm mạnh. Đối với SDS hoạt tính enzyme bị ức chế rõ rệt. SDS ở nồng độ 0,4% hoạt tính chỉ đạt 15%, còn ở nồng độ 2,0% hoạt tính chỉ còn 4% so với đối chứng (Hình 3.17 và Bảng 4.17). 100 75 50 25 0 T20 T80 TX-100 SDS Chất tẩy rửa 0
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền
T20 T80 TX-100 SDS endo-β-1,4-glucanase củ C a hấ c t h t ủ ẩy ng rử A a . oryzae VTCC-F-045 0.4% 0,8% 1.2% 1,6% 2.0% H o ạ t t í n h e n d o - β - 1
3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại
Để nghiên cứu ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với các ion kim loại ở các nồng độ khác nhau là 4; 8 và 12 mM ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định ở 55°C. Kết quả cho thấy, ở nồng độ
4 mM các ion kim loại và EDTA ảnh hƣởng rất ít tới hoạt tính enzyme. Trong
đó, ion K+ làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme so với đối chứng (tăng 3%). Các ion kim loại khác và EDTA làm hoạt tính enzyme giảm nhẹ. Trong đó, ion Ag+ làm hoạt tính enzyme giảm hơn cả (giảm 16%). Ở nồng độ 8-12% hoạt tính enzyme vẫn đƣợc duy trì từ 70-99% khi ủ với các ion kim loại. Trừ Fe2+ và Zn2+ làm giảm mạnh hoạt tính enzyme Zn2+ 57%, Fe2+ 58%) (Bảng 3.4 và Bảng 4.18).
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase sau 4 giờ ủ (%)
Ion kim loại (mM) 12 Ag + 73 Ca2+ 73 Co2+ 92 Cu2+ 87 EDTA 71 Fe2+ 58 K + 83 Mn2+ 77 Ni2+ 70 4 8 84 99 90 81 92 93 96 92 96 89 87 64
Gao và cs (2008) khi nghiên cứu endo-β-1,4-glucanase từ chủng
A. terreus M11 cho thấy, hoạt tính endo-β-1,4-glucanase giảm mạnh khi ủ với
các ion kim loại Hg2+, Cu2+; Pb2+ và EDTA ở nồng độ 2,0 mM. Hoạt tính chỉ đạt 77% đối với ion Hg2+ và 59% với ion Cu2+. Trong khi Sr2+, Zn2+ và Mn2+ lại làm tăng hoạt tính của enzyme. Chinedu và cs (2008) nghiên cứu trên chủng P. chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và Fe2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% và 162%). Trong khi Mn2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+ và EDTA ức chế mạnh hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và 43% với Hg2+).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao nhất trong số 35 chủng đã đƣợc tuyển chọn. Trình tự đoạn gene
28S rRNA của chủng này (đăng ký trong Genebank: QG 3 8227 6 ) tƣơng đồng 99,7% với chủng thuộc chi Aspergillus trong cây phân loại.
2. Điều kiện để chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-
glucanase tối ƣu là: Thời gian 120 giờ; nhiệt độ 28°C; pH ban đầu 5,5; môi trƣờng khoáng MTK với 1% CMC; 0,4% lactose (nguồn carbon) và 1% bột đậu tƣơng (nguồn nitrogen)
3. Qua hai bƣớc tinh sạch bằng tủa ammonium sulfate 65% và cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, endo-β-1,4-glucanase tinh sạch đƣợc có độ sạch so với enzyme thô ban đầu là 2,6 lần và có khối lƣợng phân tử khoảng 36 kDa.
4. Endo-β-1,4-glucanase hoạt động tốt nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 55°C, bền ở 30-45°C và có hoạt tính cao trong pH 6,0. Các dung môi hữu cơ ít ảnh tới endo-β-1,4-glucanase trừ n-butanol. Các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS), các ion kim loại và EDTA (nồng độ 4-12 mM hầu nhƣ đều làm giảm hoạt tính endo-β-1,4-glucanase.
KIẾN NGHỊ
1. Thử nghiệm lên men lƣợng lớn với nguồn dinh dƣỡng là bột đậu tƣơng, lõi ngô, CMC và thành phần khoáng.
2. Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợng lớn endo-β-1,4-glucanase từ môi trƣờng nuôi cấy.
3. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc, nâng
4. Nghiên cứu cấu trúc gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase, tạo endo- β-
1,4-glucanase tái tổ hợp nhằm cải thiện năng suất và có những tính năng phù hợp mong muốn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999) Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenluloza cao để nâng cao chất lƣợng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp,
Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551.
2. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999) Nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797.
3. Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Khảo sát quá trình cảm ứng enzyme chitinaza và celluloza của Trichoderma harzianum ảnh hƣởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsic, Báo cáo khoa
học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 321-324.
4. Vũ Duy Giảng (2009) Sử dụng enzyme để tăng hiệu quả sử dụng năng lƣợng và giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học
Công nghệ chăn nuôi-Viện chăn nuôi quốc gia: 16.
5. Đặng Minh Hằng (1999) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339.
6. Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003) Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, xenluloza hoặc dầu ô lƣu trong quá trình
phân hủy chất thải hữu cơ, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh
học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291.
7. Nguyễn Lan Hƣơng, Lê Văn Nhƣơng, Hoàng Đình Hoà (1999) Phân lập và hoạt hóa vi sinh vật ƣa nhiệt độ có hoạt tính xenlulaza cao để bổ sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 531-536.
8. Trịnh Đình Khá (2006) Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase,
Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
9. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003) Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL- 363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307.
10.Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn