Nghiên cứu xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergillus oryzae sinh tổng hợp protease theo phương pháp nuôi cấy chìm

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN VĂN HỒNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HP PROTEASE THEO PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHÌM Chuyên ngành: KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã số ngành : 2.11.00 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 09 năm 2004 CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN VIỆT MẪN Người chấm nhận xét 1: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯNG Người chấm nhận xét 2: TS LẠI MAI HƯƠNG Luận văn thạc só bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm 2004 Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC -oOo - NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Văn Hồng Phái: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 22-10-1979 Nơi sinh: Cao lãnh - Đồng Tháp Chuyên ngành: Khoa học Công nghệ thực phẩm Mã số: 2.11.00 I-TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HP PROTEASE THEO PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHÌM II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Chọn tối ưu hóa thành phần môi trường lỏng nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme protease - Xác định điều kiện thích hợp cho phương pháp nuôi cấy bề sâu với qui mô nuôi cấy erlen thể tích 250 ml: khảo sát ảnh hưởng pH đầu, lượng giống cấy độ thoáng khí đến khả sinh tổng hợp enzyme - Xác định khoảng pH nhiệt độ tối ưu chế phẩm protease thô thu - Khảo sát khả thủy phân protein chế phẩm protease thu nhận III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS LÊ VĂN VIỆT MẪN VI- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 1: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯNG VII- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 2: TS LẠI MAI HƯƠNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CÁN BỘ NHẬN XÉT CÁN BỘ NHẬN XÉT TS LÊ VĂN VIỆT MẪN PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯNG TS LẠI MAI HƯƠNG Nội dung đề cương luận văn thạc só Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua TRƯỞNG PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Ngày tháng năm 2004 CHỦ NHIỆM NGÀNH PGS TS PHẠM VĂN BÔN L Ơ ØICẢMƠ N ☯ Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Lê Văn Việt Mẫn nhiệt tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh hết lòng truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nâng cao kiến thức thời gian qua Em thành thật cám ơn thầy, cô cán phòng thí nghiệm giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành thí nghiệm Cuối xin cảm ơn Lãnh đạo Phân viện Khí tượng Thủy văn Môi trường phía Nam anh chị đồng nghiệp, tất bạn bè thảo luận, ủng hộ, giúp đỡ động viên thời gian thực luận vaên ABSTRACT This study, focuses on the optimization of liquid fermentation medium for protease biosynthesis by Aspergillus oryzae A solution is prepared by dissolving 2.5 grams of dextrin, 5.0 grams of soybean flour, 3.0 grams of shaccharose , 0.9 grams of sodium carbonate, 0.3 grams of sodium hydrogen carbonate, 0.3 grams trisodium polyphosphate, 0.1 grams of yeast extract and 100 ml water in 250ml Erlenmeyer flask The solution is sterilized at 1210C for 20 minutes The initial pH of the medium is approximately 10.5 Then the submerged fermentation conditions are optimized The inoculating rate is 222.5 mg dry spores/ l, agitation rate 350 rpm and fermentation time 52 hours The pH and the temperature optimum of the produced protease are determined (pHopt = 6.5, topt = 550C) This research has shown that the produced protease can be applied in different proteolysis of food processing MỤC LỤC Nội Dung Trang Danh mục bảng Danh mục hình LỜI MỞ ĐẦU TOÅNG QUAN 2.1 PROTEASE 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Phân loại protease 2.1.2.1 Theo pH xúc tác 2.1.2.2 Theo trung tâm hoạt động 2.1.2.3 Theo chế xúc tác 2.1.3 Tính chaát 2.1.3.1 Serine peptidase 2.1.3.2 Cystein peptidase 2.1.3.3 Metalo peptidase 2.1.3.4 Aspartic peptidase 2.2 SINH TỔNG HP PROTEASE 2.2.1 Nguồn thu nhận enzyme 2.2.2.1 Naám moác Aspergillus oryzae 10 2.2.2.2 Sinh tổng hợp protease từ vi sinh vaät 10 a Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 10 b Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme 12 Cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 13 Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp enzyme 15 2.2.3 Môi trường sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 17 2.2.3.1 Phân loại môi trường 17 2.2.3.2 Các phương pháp thiết lập môi trường 18 2.2.4 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme protease 19 2.2.4.1 Thành phần môi trường 19 a Nguoàn carbon 19 b Nguồn nitơ 20 c Chất cảm ứng 20 d Các chất dinh dưỡng khác 21 2.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 21 a Nhiệt độ 21 b pH môi trường 22 c Độ ẩm môi trường 22 d Độ thoáng khí 23 e Thời gian nuôi caáy 23 2.2.4.3 Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 23 a Phương pháp nuôi cấy bề mặt 23 b Phương pháp nuôi cấy chìm 25 c Ưu nhược điểm phương pháp 26 2.2.5 Tách tinh chế enzyme protease 26 2.2.5.1 Một số nguyên tắc tách tinh enzyme 26 2.2.5.2 Phương pháp thu nhận chế phẩm thô protease ngoại bào 27 2.2.6 Ứng dụng protease 28 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Nguyên liệu 31 3.1.1 Vi sinh vaät 31 3.1.2 Môi trường giữ giống 31 3.1.3 Môi trường nuôi cấy 32 3.2 Các hóa chất dùng thí nghiệm 32 3.3 Duïng cụ thiết bị dùng thí nghiệm 34 3.4 Phạm vi nghiên cứu 35 3.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 36 3.4.2 Thuyết minh sơ đồ 37 3.5 Các phương pháp phân tích dùng nghiên cứu 42 3.5.1 Xác định hoạt tính enzyme protease phương pháp Anson cải tiến 42 3.5.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 45 3.5.3 Xác định hàm lượng nitơ amin phương pháp so màu, sử dụng Ninhydrin 47 3.5.4 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố theo phương án trực giao bậc hai 48 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52 4.1 Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme protease 52 4.1.1 Khảo sát chọn môi trường 52 4.1.2 Xác định hàm lượng chất cảm ứng môi trường nuôi 55 4.1.3 Xác định hàm lượng hợp chất vi lượng môi trường nuôi 57 4.1.4 Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy phương pháp qui hoạch thực nghiệm 60 4.2 Xác định điều kiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme protease theo phương pháp nuôi cấy chìm 65 4.2.1 Xác định pH ban đầu môi trường nuôi cấy 65 4.2.2 Xác định tỉ lệ giống cấy 66 4.2.3 Xác định độ thoáng khí 67 4.2.4 Khảo sát động học trình sinh tổng hợp enzyme protease 69 4.3 Xác định nhiệt độ pH tối ưu cho chế phẩm protease thô từ canh trường bề sâu Aspergillus oryzae 70 4.3.1 Xác định nhiệt độ tối ưu 70 4.3.2 Xác định pH tối ưu 71 4.4 Khảo sát khả thủy phân protein chế phẩm protease thu nhận 73 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 5.1 Kết luận 76 5.2 Đề nghị hướng nghiên cứu 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 DANH MUÏC CÁC HÌNH Nội Dung Trang Hình 2.1: Enzyme protease xúc tác thủy phân liên kết peptid Hình 2.2: Sơ đồ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 14 Hình 2.3: Sơ đồ chế kìm hãm sinh tổng hợp enzyme 16 Hình 3.1: Sơ đồ trình làm môi trường giữ giống 31 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu 37 Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến 44 Hình 3.4: Sơ đồ xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 46 Hình 4.1: Sự thay đổi hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy môi trường M1, M2, M3 M4 53 Hình 4.2: Sự thay đổi hoạt độ protease theo thời gian môi trường có hàm lượng bột đậu nành có hàm lượng khác 57 Hình 4.3: Động học hoạt độ protease môi trường nuôi cấy thay đổi hàm lượng chất chiết nấm men 59 Hình 4.4: Hoạt tính protease thí nghiệm tối ưu 63 Hình 4.5: Động học trình sinh tổng hợp enzyme protease Aspergillus oryzae theo phương pháp nuôi cấy bề sâu 70 Hình 4.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease 71 Hình 4.7: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme 72 Hình 4.8: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin theo thời gian thủy phân 74 - 71 - Baûng 4.16: Aûnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease Nhiệt độ(oC) Hoạt độ protease H (đvhđ/ml) 30 55 50 60 65 70 0.7279 0.7877 0.8432 0.9840 0.9264 0.7535 0.5336 % so với giá trị cực đại Hoạt độ tương đối (% so với giá trị cực đại) 45 74 80 100 85.7 94.1 76.5 54.2 120 100 100 80 74 80 85.7 94.1 76.57 54.22 60 40 20 30 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ(oC) Hình 4.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease Nếu nhiệt độ thấp trình xúc tác thủy phân protein bị chậm lại Ngược lại, nhiệt độ cao làm cho enzyme protease bất hoạt Theo kết thu được, chế phẩm protease thô từ canh trường bề sâu Aspergillus oryzae có nhiệt độ xúc tác tối ưu 55oC Nếu ta tăng nhiệt độ phản ứng lên 700C, hoạt tính enzyme phân nửa so với nhiệt độ tối ưu 4.3.2 Xác định pH tối ưu Chúng khảo sát ảnh hưởng khoảng pH = ÷9 đến hoạt tính chế phẩm enzyme thô protease - 72 - Bảng 4.17: nh hưởng pH đến hoạt tính enzyme protease pH Hoạt độ protease H (đvhđ/ml) Hoạt độ tương đối(% so với giá trị cực đại) % so với giá trị cực đại 6.5 7.5 0.6162 0.9746 1.0111 0.9632 0.8787 0.8764 0.6847 61 96.4 100 95.26 86.9 86.67 67.71 120 96.4 100 100 95.26 86.9 86.67 80 67.75 61 60 40 20 6.5 7.5 pH Hình 4.7: nh hưởng pH đến hoạt tính enzyme Kết thực nghiệm cho thấy khoảng pH hoạt động enzyme rộng Ở pH = (acid) pH = (kiềm), hoạt tính enzyme tồn trì mức cao, 61% 67% so với giá trị cực đại Khoảng pH thích hợp để enzyme xúc tác ÷ 7, giá trị pH tối ưu 6.5 Khi đối chiếu với kết thí nghiệm phần tối ưu hóa thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy ta thấy môi trường thích hợp trước cấy giống phải nằm vùng kiềm (7.5 ÷10.5) Tuy nhiên, enzyme protease thu thể hoạt - 73 - tính xúc tác vùng acid lẫn vùng kiềm, hoạt tính cao thuộc vùng acid yếu-trung tính Do khoảng pH hoạt động rộng, nghó canh trường enzyme protease thô thu nhận có chứa số loại protease khác Để kiểm tra lại điều này, cần tiếp tục tinh enzyme phương pháp sắc ký kết hợp với phương pháp điện di 4.4 Khảo sát khả thủy phân protein chế phẩm protease thu nhận Pepton hỗn hợp peptid mạch ngắn acid amin tự Vì pepton xem loại thực phẩm dinh dưỡng đặc biệt dùng cho người bị bệnh giai đoạn hồi phục Pepton bổ sung vào loại thực phẩm cho trẻ em suy dinh dưỡng Ngoài ra, pepton nguyên liệu thiếu việc pha chế môi trường nuôi vi sinh vật nghiên cứu sản xuất Hiện có nhiều loại pepton, chúng sản xuất từ nhiều nguồn protein khác từ nhiều loại enzyme khác Trong nghiên cứu thử ứng dụng chế phẩm enzyme protease thô thu từ canh trường nuôi cấy Aspergillus oryzae để sản xuất pepton Chúng chọn chất cá cơm Nguyên liệu cá cơm xay nhỏ máy xay sinh tố (hiệu Philip) dùng chế biến ẩm thực gia đình, sau cho nước vào với tỷ lệ cá : nước : Chúng chuẩn bị mẫu song song với thể tích mẫu khoảng chừng 100ml Mẫu (mẫu A) bổ sung enzyme Neutrase hãng Novo Mẫu hai (mẫu B) bổ sung chế phẩm enzyme thô thu từ trình nuôi cấy bề sâu nấm mốc Aspergillus oryzae Hàm lượng enzyme bổ sung vào hai mẫu tương đương nhau: 3.6 đơn vị hoạt độ/ 100ml mẫu Hoạt lực protease hai chế phẩm enzyme xác định theo phương pháp Anson cải tiến Sau bổ - 74 - sung enzyme vào hỗn hợp chất, ta tiến hành khuấy trộn cho giữ bể điều nhiệt nhiệt độ 55oC Trong trình thủy phân, lấy mẫu xác định hàm lượng nitơ amin hỗn hợp thủy phân theo phương pháp so màu, sử dụng Ninhydrin Mỗi tiến hành lấy mẫu lần Từ kết thu xây dựng đường cong thay đổi hàm lượng nitơ amin mẫu theo thời gian thủy phân Bảng 4.18: Hàm lượng Nitơ amin trình thủy phân cá cơm Thời gian (giờ) Mẫu A (mg/l) 70.209 379.017 487.666 631.879 741.935 793.169 829.222 Maãu B (mg/l) 70.209 235.294 265.655 296.015 347.721 445.920 567.723 Nitô amin (mg/l) 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 A B Thời gian (giờ) Hình 4.8: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin theo thời gian thủy phân - 75 - Kết thí nghiệm cho thấy, hàm lượng nitơ tăng dần theo thời gian thủy phân Đó nhờ xúc tác enzyme protease mẫu Khả xúc tác chế phẩm Neutrase (hãng Novo) cao so với chế phẩm thô protease mà thu nhận Theo tài liệu tham khảo Neutrase chế phẩm protease trung tính hãng Novo sản xuất từ chủng vi khuẩn đột biến thuộc loài Bacillus amyloliquefactiens Chế phẩm có độ tinh cao khuyến cáo dùng chế biến thực phẩm Hàm lượng nitơ amin sau thủy phân mẫu B không cao mẫu A tăng lần so với ban đầu Chúng cho tiếp tục tinh chế phẩm từ canh trường nuôi cấy bề sâu Aspergillus oryzae kết hợp bổ sung thêm chất ổn định vào chế phẩm hoạt tính cải thiện khả xúc tác cao - 76 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu thực nghiệm đưa số kết luận đây: ¾ Xác định thành phần môi trường tối ưu nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp protease theo phương pháp bề sâu với tỉ lệ sau: Dextrin: 2.5g; bột đậu nành: 5g; saccharose: 3g; Na2CO3: 0.9g; NaHCO3: 0.3g; Na3PO4: 0.3g; chất chiết nấm men: 0.1g nước cất: 100ml ¾ Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp (qui mô nuôi cấy erlen 250ml máy lắc phòng thí nghiệm): Hàm lượng giống cấy: 22.25 mg chất khô bào tử nấm mốc/ 100ml môi trường Nhiệt độ môi trường: Nhiệt độ phòng Tốc độ lắc: 350 vòng/ phút Thời gian nuôi: 54 Môi trường nuôi cấy có pH tự nhiên 10.52, không cần hiệu chỉnh pH môi trường ¾ Xác định nhiệt độ pH tối thích chế phẩm protease thô thu Topt = 55oC PHopt = 6.5 Chế phẩm protease thu có nhiều triển vọng ứng dụng việc thủy phân protein công nghệ sản xuất thực phẩm nói chung sản xuất nước chấm nói riêng - 77 - 5.2 Đề nghị hướng nghiên cứu tiếp theo: • Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzyme protease Aspergillus oryzae theo phương pháp nuôi cấy bề sâu • Lựa chọn phương pháp tối ưu để tinh enzyme protease • Xác định thêm số đặc tính chế phẩm protease thu nhận từ canh trường nuôi cấy bề sâu: phân tử lượng enzyme, tác nhân hoạt hóa kìm hãm hoạt tính… • Khảo sát xác định điều kiện bảo quản chế phẩm protease • Nghiên cứu ứng dụng enzym protease công nghệ thực phẩm sản xuất nước chấm đặc biệt nước mắm ngắn ngày, làm mềm loại thịt đóng hộp, sản xuất pepton… - 78 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Cảnh - Qui hoạch thực nghiệm - Trường Đại học Bách khoa TPHCM, 1997 Nguyễn Trọng Cẩn - Công nghệ enzyme - NXB Nông nghiệp TPHCM, 1998 Lâm Thị Kim Châu cộng - Thực tập lớn sinh hóa - Tủ sách Đại học khoa học tự nhiên TP Hồ chí Minh, 1998 Phạm Thị Trân Châu cộng - Hóa sinh học - NXB Giáo dục,1997 Nguyễn Hữu Chấn - Enzyme xúc tác sinh học - NXB Y học, Hà Nội, 1996 Nguyễn Hữu Chấn - Hóa sinh - NXB Y học, 2001 Lê Minh Dũng - Nghiên cứu trình nuôi cấy bề mặt thu nhận chế phẩm thô protease nấm mốc Aspergillus oryzae - Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh, 2003 Nguyễn Lân Dũng - Một số sản phẩm vi nấm - NXB Khoa học Kỹ thuật, 1982 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ- Vi sinh vật học NXB Giáo dục, 2000 10 Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đông, Lê Lương Đình - Vi nấm - NXB Khoa học Kỹ thuật, 1982 11 Nguyễn Lân Dũng tác giả - Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 3, sản phẩm vi nấm - NXB Khoa học Kỹ thuật, 1972 - 79 - 12 Lê Thụy Minh Hải - Bước đầu tinh chế phẩm protease từ canh trường nấm mốc Aspergillus oryzae phương pháp nuôi cấy bề mặt - Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh, 2004 13 Trang Thành Lễ - Nghiên cứu ảnh hưởng tác nhân kết tủa lên trình thu nhận pepsin khảo sát số đặc tính chế phẩm thu Luận án tốt nghiệp cao học, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh, 2002 14 Nguyễn Đức Lượng - Công nghệ sinh học - Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM, 1998 15 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phúc - Công nghệ vi sinh vật, tập Vi sinh vật học công nghiệp - Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM, 1996 16 Nguyễn Đức Lượng - Công nghệ vi sinh vật, tập 3, Thực phẩm lên men truyền thống - Trường đại học Bách Khoa Tp HCM, 1996 17 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn - Thực tập vi sinh vật học hực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Tp HCM, 1996 18 Nguyễn Văn Mùi - Thực hành hóa sinh học - NXB Khoa học kỹ thuật, 2001 19 Lê Văn Nhương - Thu nhận ứng dụng chất hoạt động sinh học từ vi sinh vật - NXB khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 1978 20 Lương Đức Phẩm - Công nghệ vi sinh vật - NXB Nông nghiệp, 1998 21 Lương Đức Phẩm, Hồ sưởng - Vi sinh tổng hợp - NXB Khoa học Kỹ thuật, 1978 22 Nguyễn Vân Ngọc Phượng - Nghiên cứu tinh pectinase từ canh trường Aspergillus fucuum khảo sát số đặc tính chế phẩm thu được, Luận án tốt nghiệp thạc só, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh, 2002 - 80 - 23 Trần Minh Tâm - Công nghệ vi sinh vật ứng dụng - NXB nông nghiệp, 2000 24 Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên - Giáo trình sinh hóa đại Nhà xuất giáo dục, 1998 25 Lê Duy Thắng - Thực tập lớn vi sinh - Tủ sách Đại học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh, 1998 26 Đồng Thị Thanh Thu - Giáo trình sinh hóa - Tủ sách Đại học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh, 1999 27 Đồng Thị Thanh Thu - Giáo trình sinh hóa ứng dụng - Tủ sách Đại học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh, 1999 28 Lê Ngọc Tú - Hóa sinh công nghiệp - NXB khoa học kỹ thuật, 2000 29 Lê Ngọc Tú cộng - Enzyme vi sinh vật - Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 1982 30 Nguyễn Văn Uyển cộng - Công nghệ sinh học số ứng dụng Việt Nam, Tập - NXB Nông nghiệp, 1994 31 Trương Thị Bạch Yến - Nghiên cứu môi trường sinh tổng hợp protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae theo phương pháp nuôi cấy bề mặt - Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh, 2002 32 Belitz H D & Grosch W - Food chemistry , 2nd edition, Springer, 1999 33 Boy R F - Modern experimental biochemistry - 2nd edition, Benjamin publishing company, California, 2000 34 Egorov N.X, Nguyễn Lân Dũng dịch- Thực tập vi sinh vật học - NXB đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1983 35 Fogarty - Microbial enzymes and biotechnology - Applied science publishers, Lon don and New York, 1983 - 81 - 36 Fox P.F - Food enzymology - volumes, Elservier applied science, Lon don & New york,1991 37 Jackson A.T - Process engineering in biotechnology, Prentice hall - Inc , New Jersey, 1991 38 Meister A – Advances in enzymology – Wiley -Interscience, New York,1995 39 Prave P, Faust U, Sillig W, Sukatsch D.A - Fundamentals of biotechnology - VCH, Weinheim, 1987 40 Rehm H.J, reed G - Biotechnology A multi-volume comprehensive treatise 12 volumes, 2nd edition, VCH, Weinheim,1996 41 Lurie Ju – Hand book of analysical chemistry - Moscow, 1987 42 Thomas E.Barman - Enzyme handbook - volumes, Spinger-Verlag, Berlin Heidelberg, New York, 1969 PHỤ LỤC Các công thức tính toán cho phương án trực giao bậc hai: Số thí nghiệm N phương án cấp hai k yếu tố: k < 5: N = 2k + 2k + no k > 5: N = 2k-1 + 2k + no Số thí nghiệm tâm phương án: no =1 ⇒ cánh tay đoàn α =1 Trong phương án trực giao bậc hai, để đảm bảo tính trực giao hóa người ta thay X j biến ' X j tính theo công thức: N X ' = j X − j ∑X ji i =1 N = X j − (j = 1÷k) Các hệ số phương trình hoài qui: N bj = ∑X Y i =1 N ji ∑X i =1 ∑ (X X ) Y N i b jl = ji j i =1 N l i i =1 l i s ∑ (Y th = i =1 ) oi −Y o n −1 n: số thí nghiệm tâm Y oi Y o : giá trị thí nghiệm tâm : giá trị trung bình thí nghiệm taâm n Y0= ∑Y i =1 n 0i jj = i =1 N ' ji ∑ (X i =1 Phương sai tái hiện: n i b ∑ (X X ) j N ∑X Y ) ' ji i Phương sai hệ số hồi qui: s sb = ∑X 2 s sb = ∑ (X X th N j i =1 th N jl ji j i =1 ) l i s sb = ∑ (X th jj N i =1 ) ' ji Kiểm định ý nghóa hệ số hồi qui theo tiêu chuẩn student: t j = b sb j t j jl = b sb jl t jl jj = b sb jj jj Choïn mức ý nghóa p = 0.05 Bậc tự tái f2 = n-1 Tp (f2): tra bảng trang 152 tài liệu tham khảo [1] Kiểm định tương thích phương trình hồi qui với thực nghiệm: F=s s dư th Trong đó: ∑ (Y − Y ) N Phương sai dư: Y i s = dö i =1 i i N −1 : giá trị tìm theo phương trình hồi qui F1-p (f1, f2): tra bảng trang 154 tài liệu tham khảo [1] (f1 = N - l với l số hệ số có ý nghóa phương trình hồi qui, f2=n-1) Cách pha dung dịch đệm có pH thay đổi từ ÷ Dung dịch đệm có pH thay đổi từ ÷ 8: Chuẩn bị dung dịch A (NaH2PO4 1/15M) dung dịch B (KH2PO4)như sau: Dng dịch A (NaH2PO4 1/15M): cân 11,866g NaH2PO4.2H2O pha lít nước cất Dng dịch B (KH2PO4 1/15M): cân 9.073g KH2PO4 pha lít nước cất Tiến hành pha dung dịch đệm phosphat có pH thay đổi sau: Bảng 27: Cách pha dung dịch đệm phosphat pH 5.0 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Dung dòch A (ml) 0.8 11.1 29.6 58.7 83.7 96.8 Dung dòch B (ml) 99.2 88.9 70.4 41.3 16.3 3.7 Cách pha dung dịch đệm với pH 9: Dung dịch A: dung dịch Borax 0.05 mol/l (H3BO3: 12.37g/l vaø 100ml NaOH 1mol/l) Dung dịch B: HCl 0.1 mol/l Pha dung dịch A dung dịch B theo tỷ lệ thể tích 81.6 : 18.4 Tóm tắt Lý lịch trích ngang: Họ tên: NGUYỄN VĂN HỒNG Ngày, tháng, năm sinh: 22-10-1979 Nơi sinh: Cao Lãnh – Đồng Tháp Địa liên lạc: 500/4 Ấp 4, xã Mỹ Trà, Thị xã Cao Lãnh, Tỉnh Đồng Tháp Điện thoại: 0913 613 206 QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO: Từ năm 1997 – 2002 học Đại học Trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Từ năm 2002- 2004 học Cao học Trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Khoa học Công nghệ Thực phẩm QUÁ TRÌNH CÔNG TÁC: Từ tháng 04-2004 công tác Phân viện Khí tượng Thủy văn Môi trường Phía Nam Địa chỉ: 19 Nguyễn Thị Minh Khai, Q1, Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 08 8290057 CƠ QUAN XÁC NHẬN Ngày .tháng năm 2004 (ký tên đóng dấu) NGƯỜI KHAI Phân viện trưởng BẢO THẠNH NGUYỄN VĂN HỒNG ... nghiệm Phần 2: Xác định điều kiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme protease theo phương pháp bề sâu Giai đoạn 1: Xác định pH ban đầu môi trường nuôi cấy Giai đoạn 2: Xác định. .. MỐC ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HP PROTEASE THEO PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHÌM II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Chọn tối ưu hóa thành phần môi trường lỏng nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp. .. cấy phương pháp qui hoạch thực nghiệm 60 4.2 Xác định điều kiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme protease theo phương pháp nuôi cấy chìm 65 4.2.1 Xác định