Nghiên cứu xác định loài vi khuẩn ncardia sp gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng (tranchinotus blochii lacepéde, 1801) tại khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG LÊ THỊ THẢO NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LOÀI VI KHUẨN NCARDIA sp. GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG (Tranchinotus blochii Lacepéde, 1801) TẠI KHÁNH HÒA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Công nghệ sinh học Nha Trang – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG LÊ THỊ THẢO NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LOÀI VI KHUẨN NOCARDIA sp. GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG (Tranchinotus blochii Lacepéde, 1801) TẠI KHÁNH HÒA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Công nghệ sinh học CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: 1. TS. NGUYỄN VĂN DUY 2. TS. VŨ KHẮC HÙNG Nha Trang - 2014 i LỜI CẢM ƠN Thời gian làm báo cáo gói gọn trong 3 tháng nhƣng vô cùng quý báu và hữu ích đối với bản thân em. Em có cơ hội vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn và hoàn thiện những lỗ hổng kiến thức, đồng thời giúp em có cơ hội tiếp xúc với môi trƣờng công việc cũng nhƣ rèn luyện các kỹ năng làm việc, kỹ năng giao tiếp trong cuộc sống. Trƣớc tiên, với tấm lòng tôn sƣ trọng đạo, em xin gửi lời cảm ơn tới quý Thầy Cô tại Trƣờng Đại học Nha Trang, quý Thầy Cô khoa công nghệ sinh học đã dạy bảo em trong suốt thời gian 4 năm đại học vừa qua. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy, TS.Vũ Khắc Hùng, ThS. Dƣơng Văn Quý Bình, đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức vô cùng quý báu để em hoàn thành bài đồ án tốt nghiệp này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh, chị đang làm việc tại phòng công nghệ sinh học – Phân viện thú y miền Trung, Nha Trang, Khánh Hòa, đã tạo điều kiện thuận lợi và tốt nhất cho em trong quá trình thực tập. Cuối cùng xin kính chúc tất cả quý Thầy Cô, cùng TS. Nguyễn Văn Duy, TS.Vũ Khắc Hùng, ThS. Dƣơng Văn Quý Bình và anh chị lời chúc sức khỏe và thành công. Nha Trang, tháng 6 năm 2014. ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 1.1. Tổng quan về chi vi khuẩn Nocardia ...............................................................3 1.1.1. Đặc điểm phân loại học của Nocardia .......................................................3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của chi Nocardia .........................................................4 1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của các loài vikhuẩn thuộc chi Nocardia ....................7 1.2. Tổng quan về cá chim vây vàng .......................................................................8 1.2.1. Đặc diểm phân loại của cá chim vây vàng .................................................8 1.2.2. Đặc điểm hình thái của cá chim vây vàng ..................................................8 1.2.3. Đặc điểm phân bố của cá chim vây vàng .................................................10 1.2.4. Tình hình sản xuất giống và ƣơng nuôi cá chim vây vàng trên thế giới và ở Việt Nam .........................................................................................................10 1.2.5. Các bệnh thƣờng gặp trên cá chim vây vàng ...........................................12 1.3. Những nghiên cứu về chi Nocardia gây bệnh cá ...........................................12 1.3.1. Nocadiosis - bệnh đốm trắng nội tạng ở cá ..............................................12 3.2 Những nghiên cứu về định danh loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia trên cá ....15 3.2.1 Các loài cá nƣớc ngọt và nƣớc mặn ở Châu Á ..........................................15 1.4. Các phƣơng pháp định danh vi khuẩn ............................................................18 1.4.1. Tổng quan về các phƣơng pháp định danh vi khuẩn ................................18 4.1.3. Phƣơng pháp hiện đại ...............................................................................21 Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................................................29 2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................29 2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu .........................................................................29 2.2.1. Hóa chất và môi trƣờng, thuốc thử ...........................................................29 2.2.2. Thiết bị chuyên dụng ................................................................................31 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..............................................................................32 2.3.1. Thu mẫu cá bệnh ......................................................................................32 iii 2.3.2. Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh....................................................................32 2.3.4. Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn. ...............................................................33 2.3.5. Nhuộm vi khuẩn và nhuộm các tiêu bản phết từ mô của nội tạng cá bệnh ............................................................................................................................33 2.3.6. Định danh vi khuẩn bằng thử nghiệm test hóa sinh .................................35 2.3.7. Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử ..............................................37 2.4. Sơ đồ khối mô tả các bƣớc thực hiện khi nghiên cứu định danh vi khuẩn từ cá bệnh ........................................................................................................................40 3.1. Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng tại Khánh Hòa .............................................................................................................41 3.2. Kết quả nhuộm mô cá bệnh trên các tiêu bản phết .........................................45 3.3. Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh ..........................................................................47 3.4. Kết quả định danh vi khuẩn bằng test hóa sinh truyền thống .........................52 3.5. Bƣớc đầu định danh dựa trên sinh học phân tử. .............................................55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................57 Kết luận .....................................................................................................................57 Kiến nghị ...................................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................58 Tài liệu tiếng anh .......................................................................................................58 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số phản ứng thủy phân để phân biệt các loài Nocardia ........................8 Bảng 2.1. Bảng đọc kết quả của O/F test ....................................................................36 Bảng 3.1. Bảng tổng hợp mẫu cá bị bệnh thu đƣợc sau 5 lần thu mẫu .......................41 Bảng 3.2. Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng trong nội tạng ............................44 Bảng 3.3. Kết quả phân lập vi khuẩn Norcadia từ cá bệnh.........................................48 Bảng 3.4. Kết quả các phản ứng hóa sinh của 20 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ cá bệnh..............................................................................................................53 Bảng 3.5. Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá vây vàng ở Nha Trang và so sánh với các tác giả khác ....................................................................54 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Edmond Nocard (1850 – 1903) - Ngƣời đầu tiên phát hiện và phân lập vi khuẩn Nocardia ...............................................................................................3 Hình 1.2. Hình ảnh vi khuẩn Nocardia .......................................................................4 Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của Nocardia ............................................................5 Hình 1.5. Khuẩn lạc của Nocardia asteroides phân lập trên cùng một môi trƣờng và nhiệt độ nhƣng đa dạng về kích thƣớc, màu sắc, hình dạng ...........................7 Hình 1.6. Hình ảnh cá chim vây vàng .........................................................................9 Hình 1.7. Cá hồng đỏ (Lutianus erythopterus) bị bệnh nhiễm trùng hệ thống do vi khuẩn Nocardia spp. .....................................................................................14 Hình 1.8. Mang bết dính, hạt trắng xuất hiện ở mang và lách của một loài cá đuôi vàng (Seriola) (Sheppard 2010) ....................................................................14 Hình 1.9. a.Vi khuẩn N.seriolae bắt màu Gram (+) dạng sợi, phân nhánh khi nhuộm Gram; .............................................................................................................16 Hình 1.10. Loài cá Larimichthy crocea với các dấu hiệu bệnh do vi khuẩn Nocadia gây ra ở gan, lách, thận (Wang, 2005) ..........................................................17 Hình 1.11. Cá lóc (Ophiocephalusargus cantor) bị nhiễm vi khuẩn Nocardia (Wang, 2007)..............................................................................................................18 1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài: Từ ngàn xƣa ông cha ta đã có câu: “chim, thu, nhụ, đé” và cho đến ngày nay cá chim vây vàng (Tranchinotus blochii) vẫn đƣợc xếp đứng đầu trong hàng tứ quý về cá biển, vì thịt cá thơm ngon, hấp dẫn, hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, đƣợc ƣa chuộng rộng rãi trên thị trƣờng. Trên thế giới cá chim vây vàng là đối tƣợng nuôi quan trọng và đem lại lợi nhuận lớn ở Hồng Kông, Singapore, Đài Loan, Trung Quốc, Malaysia… Ở Việt Nam cá chim vây vàng là đối tƣợng nuôi mới, lần đầu tiên đƣợc nuôi trong lồng với nguồn giống do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I nhập từ Đài Loan. Năm 2006, Viện cho sinh sản thành công đối tƣợng này. Năm 2009, cá chim vây vàng đã đƣợc thử nghiệm nuôi và cho đẻ tại trƣờng đại học Nha Trang. Sau bƣớc chủ động đƣợc nguồn giống, ở một số đại phƣơng trên cá nƣớc đã xuất hiện mô hình nuôi cá chim vây vàng trong ao đất cho năng suất sau 10 tháng đạt 1 – 1,5 tấn/ha. Hiện nay cá chim vây vàng đã đƣợc nuôi rộng rãi trong cả nƣớc bởi hiệu quả kinh tế của nó mang lại so với các loài cá khác cao hơn và thị trƣờng xuất khẩu rộng lớn. Đồng thời với việc chủ động đƣợc công nghệ sản xuất giống, ngƣời nuôi đã nắm đƣợc quy trình kỹ thuật từ thành công của các mô hình nuôi thí nghiệm, trong tƣơng lai không xa đây là đối tƣợng nuôi rất có triển vọng. Khánh Hòa là tỉnh đƣợc sự ƣu ái tự nhiên với khí hậu tốt, đƣờng biển dài, nguồn giống sẵn có vì vậy nghề cá nuôi cá chim vây vàng phát triển rất nhanh và đem lại lợi nhuận lớn cho ngƣời nuôi. Tuy nhiên cùng với sự phát triển mạnh mẽ, nhanh chóng của nghề nuôi cá chim vây vàng ở Việt Nam cũng nhƣ ở Khánh Hòa thì vấn đề bệnh tật ở đối tƣợng này ngày càng ra tăng gây thiệt hại về kinh tế cho ngƣời nuôi, đáng chú ý đó là bệnh đốm trắng nội tạng ở loài cá này theo nghiên của Nguyễn Thị Thùy Giang và cs (2011) có thể gây chết lên tới 50% sau 15 ngày phát bệnh. Đây là bệnh nguy hiểm, có khả năng xâm nhiễm và phá hủy hệ thống. Hầu hết những nghiên cứu trƣớc đây phần lớn là nghiên cứu về giống và thức ăn ở cá chim vây vàng, nghiên cứu về bệnh 2 tật rất hạn chế. Chính vì lẽ đó chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định loài vi khuẩn Nocardia sp. gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng Trachinotus blochii (Lacepéde, 1801) tại Khánh Hòa.” Mục tiêu của đề tài: Xác định loài vi khuẩn Nocardia sp. gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng Trachinotus blochii (Lacepéde, 1801) tại Khánh Hòa. Nội dung của đề tài: Nội dung 1: Xác định các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng ở nội tạng cá chim vây vàng. Nội dung 2: Phát hiện vi khuẩn trên các tiêu bản phết. Nội dung 3: Kết quả phân lập vi khuẩn từ cá bệnh. Nội dung 4: Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp sinh học phân tử hoặc bằng các phản ứng hóa sinh truyền thống. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: Ý nghĩa khoa học: Cung cấp tƣ liệu về bệnh cá vây vàng, về vi khuẩn Nocardia gây bệnh trên cá chim vây vàng tại Khánh Hòa nói riêng và Việt Nam nói chung. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả đề tài làm cơ sở khoa học để phòng trị bệnh đốm trắng nội tạng của cá chim vây vàng tại Khánh Hòa. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về chi vi khuẩn Nocardia 1.1.1. Đặc điểm phân loại học của Nocardia Vi khuẩn Nocardia đƣợc nhà khoa học ngƣời Pháp và cũng là bác sĩ thú y Edmond Nocard (1850 – 1903) phát hiện và phân lập đầu tiên ở bò vào năm 1888. Sau đó năm 1890, Eppinger phát hiện bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra ở ngƣời. Hình 1.1. Edmond Nocard (1850 – 1903) - Ngƣời đầu tiên phát hiện và phân lập vi khuẩn Nocardia Theo phân loại học, Nocardia đƣợc xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Actinobacteria Lớp: Actinomycetales Bộ: Corynebacterineae Họ: Nocardiaceae Chi: Nocardia Loài: Nocardia aerocolonigenes Nocardia africana … Chi Nocardia có tổng cộng khoảng 85 loài đã đƣợc phát hiện, định danh bằng phƣơng pháp truyền thống và sinh học phân tử. Một số loài không gây bệnh 4 trong khi một số loài gây bệnh ở ngƣời và động vật. Nghiên cứu cho thấy có 13 loài gây bệnh cho ngƣời đó là: Nocardia abscessus, Nocardia africana, Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia brevicatena, Nocardia cyriacigeorgica, Nocardia farcinica, Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum, Nocardia paucivarans, Nocardia pseudobrasiliensis, Nocardia transvalensis, Nocardia veteran [22,24,25]. Ngoài ra, vi khuẩn Nocardia còn gây bệnh trên loài động vật nhƣ: chó, trâu, bò, ngựa, dê, cừu. Hiện vẫn chƣa có tài liệu nào cho thấy Nocardia gây bệnh ở lợn. Bốn loài gây bệnh trên cá đã đƣợc phát hiện là: Nocardia seriola (trƣớc đây là Nocardia kampachi), Nocardia asteroids, Nocardia salmonicida và Nocardia crassostreae [15,28]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của chi Nocardia 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái và sinh trƣởng Chi Nocardia là vi khuẩn hiếu khí, Gram (+), sinh bào tử, các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tƣơng tự bó sợi của nấm (ở Actinosynnema, Actinomadura...) thƣờng có tỷ lệ G - C trong ADN là 64% - 72%, hình que, dạng sợi, nhánh. Chúng không di chuyển và thuộc vi sinh vật hoại sinh. Nocardia đƣợc tìm thấy khắp nơi trên thế giới, rộng rãi trong tự nhiên nhƣ: đất (nhất là đất đồi núi), cây, cỏ và gỗ mục, vật liệu hữu cơ chết hoặc đang phân hủy. Mô tế bào động vật và con ngƣời là môi trƣờng lý tƣởng để chúng phát triển và gây bệnh [1, 26]. Hình 1.2. Hình ảnh vi khuẩn Nocardia (http://www.gefor.4t.com/bacteriologia/nocardia.htm) 5 Nocardia thƣờng đƣợc phân lập và nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ: thạch Sabouraud có glucose, thạch máu, thạch Lowenstein - Jensen , BHI, ogawa… Tuy nhiên chúng phát triển khá chậm trong các môi trƣờng nuôi cấy không chọn lọc [13]. Vi khuẩn Nocardia có thể sinh trƣởng trong phạm vi nhiệt độ rộng từ 15 37ºC. Tùy theo từng loài mà nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng của chúng khác nhau, ví dụ nhƣ Nocardia asteroid; Nocardia brasiliensis; Nocardia farcinica; Nocardia caviae gây bệnh trên ngƣời sinh trƣởng tốt ở 37ºC [27, 28]. 1.1.2.2. Cấu trúc Cấu trúc tế bào của vi khuẩn Nocardia gồm: màng nhầy, thành tế bào, màng nguyên sinh, tế bào chất, thể nhân, các thể ẩn nhập trong nguyên sinh chất. Đặc biệt trong thành tế bào của Nocardia chứa acid mycolic với 3 liên kết đôi và chuỗi mạch thẳng 40 – 60 carbon, meso-Acid diamino pimelic (meso-A2pm), arabinogalactan - là hợp chất đƣợc tổng hợp từ arabinose và galactose (hình 1.3). Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của Nocardia ( http://quizlet.com/6129959/introduction-to-bacteria5-flash-cards) 6 Thành phần phospholipid đặc trƣng của vi khuẩn là phosphatidylethanolamine. Nocardia chứa menaquinone, không chứa ubiquinone. Loại menaquinone chiếm ƣu thế trong các loài Nocardia là MK-8(H2) (menaquinone chứa một trong số tám đơn vị isoprene bị hydroxyl hóa) [1,12]. 1.1.2.3. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Nocardia Chi Nocardia thƣờng có khuẩn lạc khô, chắc, xù xì, nhăn nheo hoặc nhẵn bóng, đa số có dạng vôi, dạng da hoặc dạng màng dẻo. Khuẩn lạc của Nocardia có màu sắc rất đa dạng nhƣ đỏ, vàng, trắng … tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc Nocardia có kích thƣớc không đều nhau, có thể thay đổi tùy từng loài và điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, độ ẩm…). Đƣờng kính mỗi khuẩn lạc khoảng 0,5 – 2 mm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới đƣờng kính 1 cm hoặc lớn hơn [1,12]. Hình 1.4. Khuẩn lạc N. asteroides (bên trái) N. brasiliensis (bên phải) trên môi trƣờng thạch đƣờng Sabouraud (A Concise Manual of Pathogenic Microbiology - Saroj K. Mishra, Dipti Agrawal) 7 Hình 1.5. Khuẩn lạc của Nocardia asteroides phân lập trên cùng một môi trƣờng và nhiệt độ nhƣng đa dạng về kích thƣớc, màu sắc, hình dạng (http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Nocardia_farcinica) 1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của các loài vikhuẩn thuộc chi Nocardia 1.1.3.1. Nhuộm Acid-fast Ziehl-Neelsen Vi khuẩn thuộc chi Nocardia có cấu tạo vách tế bào không bình thƣờng, và có chứa phân tử acid mycolic. Chất nhuộm carbon fuchsin dƣới tác động của nhiệt độ sẽ gắn hữu cơ với acid mycolic và không bị mất màu, sau khi tẩy màu rồi nhuộm với xanh methylene trực khuẩn bắt màu hồng đỏ đặc trƣng cho vi khuẩn thuộc chi Nocardia [29]. 1.1.3.2. Nhuộm Gram Nhuộm Gram là phản ứng dùng để phân biệt vi khuẩn Gram (+), hoặc Gram (-). Các loài thuộc chi Nocardia đều là vi khuẩn Gram (+) nên khi quan sát dƣới kính hiển vi chúng sẽ bắt màu tím của thuốc nhuộm. 1.1.3.3. Phản ứng catalase Các loài thuộc chi Nocardia đều là vi sinh vật hiếu khí, có chứa chuỗi truyền điện tử cytochrome, đều có enzyme catalase, có khả năng biến dƣỡng năng lƣợng theo phƣơng thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có tính độc cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 đƣợc ghi nhận qua hiện tƣợng sủi bọt khí . Trên đây là một số phản ứng hóa sinh chung của vi khuẩn thuộc chi Nocardia. Ngoài ra, tùy từng loài Nocardia mà còn có phản ứng thủy phân khác 8 nhau để phân loại và định danh chúng, ví dụ nhƣ: Các phản ứng Casein, L-tyrosine và Xanthine thủy phân để phân biệt chủng Nocardia (Bảng1.1). Bảng 1.1. Một số phản ứng thủy phân để phân biệt các loài Nocardia Casein thủy phân N. asteroides, N. farcinica L-tyrosine thủy Xanthine thủy phân phân - - - N. brasiliensis + + - N. otididis - + - N. caviae - - + + + + N. nova Streptomyces, Nocardiopsis (http://path.upmc.edu/cases/case226/dx.html) 1.2. Tổng quan về cá chim vây vàng 1.2.1. Đặc diểm phân loại của cá chim vây vàng Cá chim vây vàng là loài có giá trị dinh dƣỡng cao, giá trị kinh tế lớn và tiềm năng thị trƣờng rộng rãi. Hiện nay, cá chim vây vàng là đối tƣợng nuôi quan trọng ở vùng biển miền Nam Trung Quốc, đƣợc tiêu thụ mạnh ở Nhật Bản Đài Loan, Hồng Kông, Trung Quốc, Mĩ, Singapore. Theo phân loại học, cá chim vây vàng đƣợc xếp vào: Ngành: Vertebrata Lớp: Osteichthyes Bộ: Perciformes Họ: Carangidea Giống: Trachinotus Loài: Trachinotus blochii (Lacepède, 1801). 1.2.2. Đặc điểm hình thái của cá chim vây vàng Hình dạng: Thân hình thoi cao gần nhƣ tròn, dẹp chính giữa, lƣng hình vòng cung. Đầu to vừa, chiều cao đầu lớn hơn chiều dài. Môi tù về phía trƣớc, hai lỗ mũi 9 nằm gần nhau, lỗ mũi trƣớc hình tròn, lỗ mũi sau to hình bầu dục. Miệng nhỏ xiên, xƣơng hàm trên lồi, hàm trên và hàm dƣới có răng nhỏ dạng lông nhung, răng phía sau dần thoái hóa, rìa phía trƣớc xƣơng nắp mang hình cung tƣơng đối to, rìa sau cong. Phía trƣớc đƣờng bên vảy có hình cung khá lớn, trên đƣờng bên vảy không có gờ. Vây lƣng thứ 1 hƣớng về phía trƣớc, gai bằng và có 5 - 6 gai ngắn. Vây lƣng thứ 2 có 1 gai và 19 - 20 tia vây, phần trƣớc của vây kéo dài hình lƣỡi liềm.Vây hậu môn có 1 gai và 17 - 18 tia vây, phía trƣớc có hai gai ngắn. Vây hậu môn và vây lƣng thứ 2 hình dạng giống nhau. Vây ngực tƣơng đối ngắn, rộng. Đuôi xẻ thùy, vây đuôi hình lƣỡi liềm [9]. Hình 1.6. Hình ảnh cá chim vây vàng (http://www.efishalbum.com/search.asp?Family=&Species= &CommonName=&Page=11) Kích thƣớc: Cá chim vây vàng có kích thƣớc tƣơng đối lớn, chiều dài có thể đạt tới 45 – 60 cm, chiều dài gấp 1,6 - 1,7 lần chiều cao. Màu sắc: Đầu thân và bụng có màu trắng bạc; đỉnh đầu, lƣng màu xanh xám. Ở những con trƣởng thành thỉnh thoảng có màu vàng cam đặc biệt trên cơ thể nhất là vùng miệng và nửa sau của thân. Vây lƣng màu ánh bạc. Vây hậu môn và vây lƣng thứ 2 màu cam sẫm. Vây ngực tƣơng đối ngắn, rộng, màu tối đen. Vây đuôi màu tro [3,10,11]. 10 1.2.3. Đặc điểm phân bố của cá chim vây vàng Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepède, 1801) là loài phân bố tƣơng đối rộng; chúng phân bố tự nhiên trên 69 nƣớc, ở vùng biển nhiệt đới và á nhiệt đới, ở rạn san hô dƣới độ sâu 7m [8]. Trên thế giới, cá chim vây vàng có ở các vùng biển Ấn Độ Dƣơng, từ bờ Biển Đỏ, Nam Phi đến miền Nam Australia, Tây Thái Bình Dƣơng, Nhật Bản, Đài Loan, Indonesia, miền Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, cá phân bố chủ yếu ở vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam [8]. 1.2.4. Tình hình sản xuất giống và ƣơng nuôi cá chim vây vàng trên thế giới và ở Việt Nam Hiện nay cá chim vây vàng đã và đang đƣợc nuôi khá phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới bởi chúng có giá trị kinh tế cao dễ nuôi, việc sản xuất giống tƣơng đối đơn giản.  Trên thế giới Việc nghiên cứu cho sinh sản nhân tạo cá Chim trắng vây vàng lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1970 bởi Trung tâm sinh vật quốc tế (MTI) có trụ sở đóng tại Oak Hill, Florida, USA. Năm 1989, Lâm Liệt Đƣờng đã cho sinh sản nhân tạo cá chim vây vàng thành công và đã phát triển đƣợc đàn cá bố mẹ. Năm 1993, trung tâm chuyển giao công nghệ thuộc Trƣờng Đại học Trung Sơn đã kết hợp với trại nghiên cứu giống thủy sản Quảng Đông – Trung Quốc cho sinh sản nhân tạo thành công cá chim vây vàng ở quy mô nhỏ, ƣơng nuôi cá bột trong các bể xi măng. Năm 1998, trung tâm này đã kết hợp với Công ty trách nhiệm hữu hạn giống thủy sản Thắng Lợi – Hải Nam – Trung Quốc sản xuất giống cá chim vây vàng nhân tạo thành công trên quy mô lớn [3,9,10,11].  Việt Nam Năm 2006, trại nuôi trồng thủy sản thực nghiệm của Trƣờng Cao Đẳng thủy sản Bắc Ninh tại Yên Hƣng – Quảng Ninh đã nhập công nghệ sản xuất giống cá chim vây vàng từ Trung Quốc. Việc di nhập đàn cá bố mẹ và cho đẻ tại Yên Hƣng đã đạt đƣợc những thành công nhất định với: tỷ lệ cá đẻ trung bình giữa các đợt là 11 87,5%, tỷ lệ thụ tinh trung bình là 60%, tỷ lệ phôi nở trung bình là 80%, tỷ lệ sống từ cá bột lên cá hƣơng trung bình đạt 30% và sản xuất đƣợc 65 nghìn con giống cỡ 4 - 6 cm [7]. Từ tháng 10/2009 đến 10/2011, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Lại Văn Hùng ở Khoa Nuôi trồng thủy sản thuộc Trƣờng Đại học Nha Trang đã nghiên cứu tuyển chọn, nuôi thành thục 129 con cá chim vây vàng bố mẹ cho sinh sản. Qua 12 đợt ƣơng thử nghiệm, đề tài đã tạo đƣợc 23,5 triệu trứng cá thụ tinh, ấp nở 12,6 triệu ấu trùng cá. Từ đó, đã ƣơng đƣợc hơn 400.000 cá giống dài 4 - 5cm, vƣợt gần 300% so với chỉ tiêu đặt ra. Phần lớn số cá giống này đƣợc thả nuôi trong bể xi măng và gần 20.000 con đƣợc thả nuôi trong lồng bè. Đầu năm 2011, trung tâm giống hải sản Nam Định đã nuôi thử nghiệm giống cá chim vây vàng vào trong ao đất và cho hiệu quả cao. Đầu năm 2012, nhóm nghiên cứu do PGS. TS. Lại Văn Hùng đứng đầu đã tiếp tục triển khai phần 2 của đề tài nhằm hoàn thiện quy trình kỹ thuật sản xuất giống cá chim vây vàng để chuyển giao cho ngƣời nuôi. Đến nay, giống cá chim vây vàng đã đƣợc nhân rộng nuôi thƣơng phẩm cung ứng sản phẩm ra thị trƣờng nhiều tỉnh thành nhƣ Khánh Hòa, Ninh Thuận, Phú Yên, Bình Thuận, Bạc Liêu, Cà Mau, Nghệ An, Nam Định, Quảng Ninh,… Từ giữa năm 2012, nhiều hộ nuôi ở các tỉnh ven biển ĐBSCL đã thực hiện thí điểm mô hình nuôi cá chim vây vàng theo hình thức công nghiệp và bƣớc đầu đƣợc đánh giá là một mô hình hay nên nhân rộng [7, 8]. Hiện nay, mô hình nuôi cá chim vây vàng đã đƣợc triển khai ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc và có thể xuất khẩu. Mặc dù đã có những nghiên cứu thành công về sinh sản nhân tạo cá chim vây vàng cũng nhƣ việc phát triển nghề nuôi cá chim vây vàng tại Việt Nam. Nhƣng những nghiên cứu mới chỉ tập trung vào sinh sản nhận tạo và kỹ thuật nuôi cá chim vây vàng trong khi đó việc nghiên cứu về vấn đề thức ăn và dịch bệnh vẫn còn rất hạn chế. 12 1.2.5. Các bệnh thƣờng gặp trên cá chim vây vàng Các tác nhân gây bệnh thƣờng gặp trên động vật thủy sản có thể là virus, vi khuẩn, ký sinh trùng… Ở cá chim vây vàng các nhà khoa học đã phát hiện ra loài giáp xác ký sinh là Caligus spp trên cá chim vây vàng (Trachinotus blochii). Năm 2010, Lee và cs đã có báo cáo về tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣợc phân lập từ cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) và nghiên cứu khả năng chống chịu với hàm lƣợng kim loại nặng trong môi trƣờng nƣớc của loài cá này. Nhiều loại môi trƣờng vi sinh đã đƣợc dùng cho nghiên cứu này: 5% Horse Blood agar (HAB), Tryptic Soy agar (TSA), Mac Conkey, Thiosulphate Citrate Bile Salt (TCBS), Eosin Methylene Blue (EMB), Gutamate Starch Pseudomonas (GSP), Xylose Lysine Deoxycholate (XLD). Các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc xác định dựa trên các phản ứng sinh hóa thông thƣờng và sử dụng bộ kit để định danh vi khuẩn. Đã có một số loài vi khuẩn đƣợc phân lập từ 50 mẫu cá chim vây vàng bị bệnh, nhƣ Streptococcus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas spp., và Vibrio spp. [14]. Ở Việt Nam, năm 2010, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Thùy Giang, Dƣơng Văn Quý Bình và Đỗ Thị Hòa đã bƣớc đầu nghiên cứu về bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng nuôi ở Vũng Ngán, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Kết quả cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng đã bị cảm nhiễm hệ thống trong các cơ quan nội tạng một dạng vi khuẩn hình que, Gram (+), dài từ 2 10 µm, phân nhánh và thƣờng gẫy thành các đoạn ngắn, kháng acid. Chủng vi khuẩn này đƣợc đặt tên là NLB (Nocardia - like Bacteria) do có các đặc điểm hình thái, sinh vật và hóa học tƣơng tự với vi khuẩn Nocardia [4]. 1.3. Những nghiên cứu về chi Nocardia gây bệnh cá 1.3.1. Nocadiosis - bệnh đốm trắng nội tạng ở cá Nocadiosis là bệnh nhiễm trùng hệ thống gây ra bởi loài vi khuẩn Nocardia sp.. Dấu hiệu điển hình bao gồm: nốt sần, u hạt ở mang, hình thành các vùng áp-xe ở biểu bì, đốm trắng ở lách, thận, gan, lở loét trên da [15]. 13 Nocardiosis bắt đầu nhƣ một “căn bệnh thầm lặng” chúng phát triển trong cơ thể cá con mà không bị phát hiện trong nhiều tháng, thời gian nhiễm trùng là một hiện tƣợng lâu dài và mãn tính, vi khuẩn Nocardia nhân lên từ từ trong mô cá cho tới khi có những biểu hiện dấu hiệu ra ngoài mà ta có thể quan sát đƣợc trƣớc khi cá hôn mê và chết. Tiếp xúc ban đầu của cá và vi khuẩn Nocardia là qua nguồn thức ăn có chứa mầm bệnh vi khuẩn hoặc lây lan từ cá đã nhiễm bệnh. Cá cam sọc (Yellowtail kingfish, yellowtail amberjack) ăn thức ăn tƣơi sống hoặc thức ăn viên không hợp vệ sinh có khả năng nhiễm bệnh rất cao vì vậy nên sử dụng nguồn thức ăn an toàn và hợp vệ sinh khi nuôi cá. Thử nghiệm chỉ ra rằng các loài cá không bị bệnh khi đƣợc nuôi chung với cá đã lây nhiễm Nocardia trong cùng một bể nuôi, sau 3 tháng cá không nhiễm bệnh có biểu hiện đốm trắng ở lách dù chƣa biểu hiện dấu hiệu bên ngoài [30]. Trong nuôi trồng thủy sản cụ thể nuôi cá biển, nhiễm trùng Nocardia xuất hiện và phát triển nhanh trong những tháng mùa hè khi nhiệt độ nƣớc đạt 24ºC trở lên, nhƣng tỷ lệ tử vong do nhiễm vi khuẩn Nocardia thƣờng tăng vào mùa thu và đầu mùa đông. Điều này có thể do sau một thời gian vi khẩn xâm nhập vào tế bào chủ, chúng âm thầm nhân lên và làm hệ thống miễn dịch vật chủ bị suy yếu [30]. Kudo và cs (1988) cho rằng bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra là một trong những bệnh quan trọng nhất đã ảnh hƣởng đến nghề nuôi cá đuôi vàng (Seriola quinqueradiata) ở Nhật Bản. Tác nhân gây bệnh này là loài vi khuẩn Nocardia seriolae, là một trực khuẩn Gram (+), kháng acid và không di động [16]. Nhóm nghiên cứu của Labrie và cs (2008), đã nhận xét rằng cá vây vàng là loài mẫn cảm với bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra. Vi khuẩn này đƣợc phân lập từ não, mang, gan, lách và thận của cá vây vàng bị bệnh từ nhiều quốc gia khác nhau: 10 mẫu cá ở Malaysia, 14 mẫu cá ở Trung Quốc và Singapore. Bệnh do Nocardia ở cá vây vàng và một số loài cá khác đã đƣợc mô tả với dấu hiệu chính nhƣ sau: một số nốt thƣơng tổn xuất hiện ở da, mang; một số nội tạng nhƣ gan lách và thận xuất hiện nhiều hạt trắng làm bụng cá trƣớng to (hình 1.8) [15]. 14 Hình 1.7. Cá hồng đỏ (Lutianus erythopterus) bị bệnh nhiễm trùng hệ thống do vi Nocardia spp. quốc gia thuộc khu vực Châu Theo nhóm tác giả này,khuẩn cá CVV nuôi ở nhiều a. Các hạtMalaysia, trắng tồnSingapore tại lách cávà bị Indonesia nhiễm bệnh dorất vi mẫn khuẩn Nocardia; Á nhƣ Trung Quốc, đều cảm với bệnh b. Phồng rộp và xuất huyết ở đuôi cá bị nhiễm Nocardia. (Labrie, 2008) Theo kết quả nghiên cứu Sheppard và cs (2010), bệnh do tác nhân là vi khuẩn Nocardia gây ra trên cá thƣờng có dấu hiệu bệnh nhƣ: xuất hiện các nốt phồng rộp lở loét trên thân, và các u xƣơng dọc theo xƣơng sống. Một số cá xuất hiện các đốm trắng nhỏ trong nội tạng nhƣ: gan, thận, lách và đƣờng kính của hạt trắng dao động trong khoảng 1 - 2 mm. Các hạt trắng này đôi khi còn bắt gặp trên màng treo ruột và bóng hơi [17]. Hình 1.8. Mang bết dính, hạt trắng xuất hiện ở mang và lách của một loài cá đuôi vàng (Seriola) (Sheppard 2010) Tuy nhiên, việc kiểm soát bệnh do vi khuẩn Nocardia ở cá nuôi vẫn có khả năng thực hiện đƣợc nếu có một loại vaccine hiệu quả để chống lại vi khuẩn gây bệnh này. Kusuda và Nakagawa (1978) đã thử ngiệm một loại vaccine chống lại sự lây nhiễm của Nocardia seriolae. Các tác giả này đã xem xét mức độ hình thành kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh của cá đã đƣợc tiêm ngừa với các tế bào vi 15 khuẩn Nocardia seriolae đƣợc bất hoạt bởi formalin hoặc đƣợc bất hoạt bởi nhiệt. Kết quả cho thấy mức độ gây ngƣng kết của huyết thanh ở cá đƣợc chủng ngừa tăng hơn 1000 lần so với cá không chủng ngừa [23]. Mới đây, Salonius và cs (2005) đã xem xét tính hiệu quả của nhiều dòng Nocardia khác nhau nhƣ là vaccine sống để chống lại bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra ở cá đuôi vàng. Thêm vào đó, tác giả cũng tìm hiểu khả năng sống sót của cá đƣợc tiêm vaccine sống sau đó bị cảm nhiễm bởi vi khuẩn Nocardia seriolae [24]. Năm 2006, Itano và cs đã nghiên cứu hiệu quả của vaccine sống từ các chủng vi khuẩn Nocardia soli, Nocardia fluminea, Nocardia uniformis khi tiêm vào cá đuôi vàng (Seriola quinqueradiata) để chống lại bệnh do Nocardia seriolae gây ra ở cá đuôi vàng. Kết quả cho thấy loại vaccine này có hiệu quả sinh ra kháng thể chống lại bệnh do vi khuẩn Nocardia seriolae gây ra [21]. 3.2 Những nghiên cứu về định danh loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia trên cá 3.2.1 Các loài cá nƣớc ngọt và nƣớc mặn ở Châu Á Nocardia sp. gây bệnh trên cá đƣợc mô tả đầu tiên bởi Rucker (1949) giống nhƣ Streptomyces salmonicida lây nhiễm ở loài cá hồi (Oncorhynchus nerka). Sau đó vi khuẩn này đƣợc xếp vào chi Nocardia dựa trên sự có mặt của acid mesodiaminopimelic (meso-DAP), arabinose và galactose trong thành tế bào vi khuẩn và phân tích tự gene 16S rDNA. Sau đó, bốn loài thuộc chi Nocardia là: Nocardia asteroides, Nocardia seriolae (trƣớc đây gọi là Nocardia kampachi), Nocardia salmonicidaand, và Nocardia crassostreae đã đƣợc phân lập từ động vật thủy sản. Cho đến nay Nocardia seriolae thƣờng xuyên phân lập đƣợc và gây bệnh trên cá đuôi vàng (Seriolae quinqueridiata) và cá cam (Seriola dumerili) từ 300 đến 1000 g gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản ở Nhật Bản. Ngoài ra còn gây bệnh trên cá vƣợc Nhật Bản (Lateolabrax japonicus) và cá đù vàng (Larimichthyscrocea) tại Đài Loan và Trung Quốc gây tử vong hơn 15% mỗi loài [15]. Từ năm 2002 đến năm 2006 nhóm nghiên cứu bao gồm L. Labrie và cs đã điều tra nguyên nhân tử vong của nhiều loài cá ở Châu Á và đã phân lập đƣợc chủng vi khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ: Ogawa, TSA, thạch máu… ở 16 điều kiện 260C. Sau đó, DNA đƣợc tách chiết bằng bộ kit: QIAamp DNA mini và đƣợc dùng làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (N5F1 và N5R1), chu trình nhiệt sau: 95ºC 2 phút 95ºC 30 giây 58ºC 1 phút 720C 1 phút 720C 5 phút Lặp lại 30 chu kỳ Sản phẩm khuếch đại đƣợc phân tích trên gel agarose 1,2% (w/v) trong đệm TBE dự kiến có kích thƣớc 1069 bp. Đồng thời, với các tiêu bản phết kính từ các mẫu bệnh phẩm ở mang và nhiều nội tạng khác nhau nhƣ: gan, lách, thận của cá bệnh, một loài vi khuẩn dài, phân nhánh, gram dƣơng, kháng acid đã đƣợc phát hiện [15]. Hình 1.9. a.Vi khuẩn N.seriolae bắt màu Gram (+) dạng sợi, phân nhánh khi nhuộm Gram; b.Vi khuẩn N.seriolae bắt màu hồng khi nhuộm Ziehl-Neelsen (1000X) (Labrie, 2008) Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống kết hợp với thực hiện các phản ứng sinh hóa, và phƣơng pháp sinh học phân tử hiện đại các tác giả đã xác định đƣợc tác nhân gây ra loại bệnh này ở nhiều loài cá nhƣ cá vây vàng ( Trachinotus 17 blochii), cá hồng đỏ (Lutjanus erythopterus), cá mú là 2 loài vi khuẩn Nocardia seriolae và Nocardia asteriodes [15]. a. Cá Larimichthy crocea Hình 1.10. Loài cá Larimichthy crocea với các dấu hiệu bệnh do vi khuẩn Nocadia gây ra ở gan, lách, thận (Wang, 2005) Năm 2003, Wang và cs đã nghiên cứu bệnh do loài vi khuẩn Nocardia sp. gây ra ở Larimichthy crocea tại Trung Quốc, các tác giả đã bắt gặp hiện tƣợng chết ở loài cá này (Larimichthy crocea), cá bệnh có kích thƣớc 25 – 30 cm. Các dấu hiệu bệnh lý trên cá đã đƣợc mô tả là tƣơng tự nhƣ dấu hiệu của bệnh do vi khuẩn Nocardia ở cá vây vàng, đó là xuất hiện các vết lở loét trên da và có các hạt trắng trong nội tạng cá. Các hạt trắng có kích thƣớc từ 0,1 – 0,2 cm nằm ở các cơ quan nhƣ thận, lách và gan. Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA và quan sát trên tiêu bản lame nhuộm Lowenstein – Jensen trên kính hiển vi quang học thấy vi khuẩn ở dạng sợi mảnh và phân nhánh. Khi tiến hành cảm nhiễm với chủng vi khuẩn đã phân lập đƣợc, các tác giả nhận thấy tỷ lệ chết tích lũy là 100%, sau đó khi phân lập lại các tác giả đã xác định đó chính là tác nhân gây bệnh ở loài cá này. Khi tiến hành giải trình tự DNA và thực hiện các phản ứng sinh hóa thông thƣờng, nhóm nghiên cứu đã tìm thấy vi khuẩn gây bệnh có trình tự DNA giống vi khuẩn Nocardia seriolae đến 99,9%. Và đây cũng là báo cáo đầu tiên nghiên cứu định danh loài vi khuẩn nocardia sp. trên Larimichthys crocea [19, 20]. 18 b. Cá lóc (Ophiocephalusargus Cantor) Hình 1.11. Cá lóc (Ophiocephalusargus cantor) bị nhiễm vi khuẩn Nocardia (Wang, 2007) Theo Wang và cs (2007), một loại bệnh đã xảy ra ở cá lóc (Ophiocephalusargus cantor) nuôi trong ao tại Trung Quốc. Tác nhân gây bệnh đƣợc xác định là do vi khuẩn Nocardia sp. gây ra. Bênh này đã gây ra tỷ lệ chết tích lũy trong 30 ngày là 35% (180.000 trong tổng số 500.000 con) ở đàn cá đã có kích cỡ lớn (30 - 35cm) và đã nuôi đƣợc 18 tháng. Nhiều u hạt trắng có đƣờng kính từ 0,1 – 0,5 cm đã đƣợc tìm thấy trong nội quan cá bệnh nhƣ: thận, lách và gan. Bệnh phẩm đã đƣợc phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng Ogawa (môi trƣờng trứng gà) và môi trƣờng TSA ở nhiệt độ 260C sau 5 - 7 ngày khuẩn lạc của loại vi khuẩn này dạng sợi, nhỏ dài, phân nhánh, Gram (+) đã đƣợc phát hiện. Khi dùng chủng vi khuẩn này cảm nhiễm ngƣợc lại trên cá lóc khỏe kết quả sau một tuần cá chết. Bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự, các tác giả đã công bố rằng chủng vi khuẩn gây bệnh ở đàn cá lóc này có cấu trúc gen tƣơng tự 99,9% nhƣ loài vi khuẩn Nocardia seriolae [20]. 1.4. Các phƣơng pháp định danh vi khuẩn 1.4.1. Tổng quan về các phƣơng pháp định danh vi khuẩn 1.4.1.1. Định nghĩa 19 Định danh là công việc xếp loại vi sinh vật phân lập đƣợc theo hệ thống phân loại sinh vật với danh pháp thứ tự: giới (kingdom), ngành (phylum), lớp (class), bộ (order), họ (family), chi (genus), loài (species), dƣới loài (sub species). Có 2 phƣơng pháp để định danh vi sinh vật: Phƣơng pháp truyền thống: khảo sát các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật. Phƣơng pháp hiện đại: sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự đoạn gen đặc trƣng của sinh vật cho kết quả nhanh chóng và chính xác. 1.4.1.2. Phƣơng pháp truyền thống Việc phân loại vi khuẩn đƣợc thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào. Mặc dù phƣơng pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy có khi không hiệu quả trong phân loại, nhƣng hình thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong việc định danh các chủng mới. Phƣơng pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thƣờng dựa vào các chỉ tiêu phân loại nhƣ: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dƣỡng năng lƣợng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất [5] a. Sử dụng khóa phân loại Thông thƣờng để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phƣơng pháp truyền thống, ngƣời ta dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, đƣợc sử dụng rộng rãi là khóa phân loại Bergey (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology). Khi phiếu định danh đã có dữ liệu đầy đủ thu đƣợc từ: nghiên cứu hình thái, đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm lý hóa của chủng vi khuẩn chƣa biết chúng ta đã sẵn sàng định danh đƣợc giống và loài. Việc định danh đến chi tƣơng đối dễ dàng, còn phân biệt đến loài thì khó hơn. b. Định danh bằng phƣơng pháp Bacteriophage Dựa trên cơ sở khoa học là mỗi loại vi khuẩn là vật chủ của một loại vius gọi là Bacteriophage, mỗi phage có thể nhân lên đặc hiệu ở mỗi loài vi khuẩn nhất định 20 và gây bệnh cho vi khuẩn đó. Bằng phƣơng pháp dùng phage đã biết trƣớc cho tiếp xúc với vi khuẩn đang cần xác định nếu đặc hiệu thì tế bào vi khuẩn sẽ bị phage gây bệnh và phá hủy. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng bộc lộ một số nhƣợc điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ. c. Định danh vi khuẩn theo kiểu huyết thanh Đây là phƣơng pháp đƣợc dùng khá lâu nhƣng rất hiệu quả và hiện vẫn đang đƣợc sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bacillus thuringiensis). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên màng tế bào vi sinh vật. Ƣu thế của phƣơng pháp này là các kháng huyết thanh đƣợc dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trƣờng hợp đặc trƣng cho loài. Đây là phƣơng pháp khá ổn định nhƣng hạn chế chủ yếu của phƣơng pháp này: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại [35]. d. APIE KIT Nguyên tắc: dựa vào nhiều phản ứng khác nhau ví dụ API 20E gần 20 phản ứng. Hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhƣng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trƣờng hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣ tuổi tế bào, lƣợng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả. Kit API 20E là bộ kit do hãng BioMerieux sản xuất, nó đƣợc dùng cho việc định danh các loài vi khuẩn Gram (-), hình que. Mặc dù API là phƣơng pháp đƣợc ứng dụng cho việc định danh các loài vi khuẩn trên động vật nhƣng ngày nay cũng sử dụng rộng rãi trong thủy sản do các thao tác nhanh đơn giản không mất nhiều thời gian, cho kết quả sớm. Cùng với phƣơng pháp sinh hóa truyền thống API đƣợc 21 ứng dụng vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu các giống loài vi khuẩn. Cụ thể, năm 2002, Crumlish và cs đã sử dụng API để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa loài E. ictaluri trên cá tra ở 2 tỉnh An Giang và Cần Thơ. Một nghiên cứu gần đây của Buller (2004) dùng kit API 20E không chỉ cho chủng E. ictaluri mà còn cho các loài khác. Hàng loạt các đề tài nghiên cứu của Lƣơng Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đƣơng (2007) cũng đã sử dụng kit API 20E để kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của E. ictaluri. e. Sử dụng phƣơng pháp số học Ngoài ra, dựa vào những thông tin và đặc điểm của vi sinh vật, ngƣời ta còn có thể tính hệ số tƣơng đồng để đánh giá mức độ tƣơng đồng giữa các chủng vi sinh vật. Trong đó hệ số Jaccard đƣợc sử dụng để so sánh mức độ tƣơng đồng giữa hai chủng khi muốn bỏ qua các đặc điểm mà cả hai chủng đều thiếu. f. Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Nhƣ vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã đƣợc phân loại dựa vào kiểu bacteriocin. Ví dụ, ở các loài vi khuẩn Proteus. 4.1.3. Phƣơng pháp hiện đại Ngày nay, sự phát triển của của kỹ thuật sinh học hiện đại đã đƣa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bƣớc phát triển mới. Phƣơng pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên, phƣơng pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền. Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thƣớc đo tiến hóa”. Một số phƣơng pháp phân lọai dựa vào vật liệu di truyền đang đƣợc sử dụng hiện nay: 22 a) Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Một đoạn gene mong muốn trƣớc khi giải trình tự cần phải đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR. PCR là một phƣơng pháp in vitro đƣợc dùng để khuếch đại nhân số lƣợng DNA từ mạch khuôn là một trình tự DNA đích ban đầu, thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis và cs (Mỹ) phát minh năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gene, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này đƣợc nối dài để hình thành mạch mới. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ đƣợc khuếch đại thành một số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Kỹ thuật PCR đƣợc coi là nền tảng của nhiều kỹ thuật phân tích DNA. Phản ứng nhân gene đƣợc thực hiện với enzyme DNA chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bƣớc: Bƣớc 1: biến tính DNA, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bƣớc 2: bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bƣớc 3: kéo dài chuỗi theo mồi theo chiều 5’- 3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng PCR đƣợc quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Nhƣ vậy, kết quả sẽ tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ. 23 Mồi cho phản ứng là các đoạn DNA có kích thƣớc 20 - 30 nucleotide đƣợc thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ nhƣ vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuếch đại đƣợc đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao nhƣ rDNA thì khi cặp mồi đƣợc thiết kế, chúng có thể nhân đƣợc gene từ nhiều đối tƣợng. Ngƣợc lại, trong nhiều trƣờng hợp dùng mồi không đặc hiệu chúng có thể nhân các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều đƣợc dùng cho định type vi sinh vật. Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzyme DNA polymerase I từ E. coli. Tuy nhiên, enzyme này bị biến tính ở 94oC cần phải bổ sung enzyme mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này đã đƣợc cải thiện do dùng enzyme Taq DNA polymerase chịu nhiệt (Taq = Thermus aquaticus ). Enzyme này đƣợc tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nƣớc nóng. Tốc độ xúc tác cho phản ứng của enzyme này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại 75oC. Hoạt tính enzyme giảm một nửa khi bị xử lý tại 92,5oC trong 23 phút hoặc 40 phút tại 95oC. Nhƣ vậy khi dùng enzyme này thì không cần bổ sung enzyme mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Các thông số kỹ thuật: Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách DNA làm sợi khuôn. Nhƣ vậy, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩm nhƣng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị DNA theo phƣơng pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) hoặc đệm phosphate vì kết quả sẽ làm giảm Mg2+ (do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có thể nhân đƣợc đoạn gene dài 10 Kb nhƣng trong thực tế thƣờng dùng để nhân các đoạn có kích thƣớc ngắn hơn ([...]... 50 mẫu cá chim vây vàng bị bệnh, nhƣ Streptococcus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas spp., và Vibrio spp [14] Ở Vi t Nam, năm 2010, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Thùy Giang, Dƣơng Văn Quý Bình và Đỗ Thị Hòa đã bƣớc đầu nghiên cứu về bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng nuôi ở Vũng Ngán, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Kết quả cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng đã... đã nghiên cứu bệnh do loài vi khuẩn Nocardia sp gây ra ở Larimichthy crocea tại Trung Quốc, các tác giả đã bắt gặp hiện tƣợng chết ở loài cá này (Larimichthy crocea), cá bệnh có kích thƣớc 25 – 30 cm Các dấu hiệu bệnh lý trên cá đã đƣợc mô tả là tƣơng tự nhƣ dấu hiệu của bệnh do vi khuẩn Nocardia ở cá vây vàng, đó là xuất hiện các vết lở loét trên da và có các hạt trắng trong nội tạng cá Các hạt trắng. .. dù đã có những nghiên cứu thành công về sinh sản nhân tạo cá chim vây vàng cũng nhƣ vi c phát triển nghề nuôi cá chim vây vàng tại Vi t Nam Nhƣng những nghiên cứu mới chỉ tập trung vào sinh sản nhận tạo và kỹ thuật nuôi cá chim vây vàng trong khi đó vi c nghiên cứu về vấn đề thức ăn và dịch bệnh vẫn còn rất hạn chế 12 1.2.5 Các bệnh thƣờng gặp trên cá chim vây vàng Các tác nhân gây bệnh thƣờng gặp... sản có thể là virus, vi khuẩn, ký sinh trùng… Ở cá chim vây vàng các nhà khoa học đã phát hiện ra loài giáp xác ký sinh là Caligus spp trên cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) Năm 2010, Lee và cs đã có báo cáo về tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣợc phân lập từ cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) và nghiên cứu khả năng chống chịu với hàm lƣợng kim loại nặng trong môi trƣờng nƣớc của loài cá này Nhiều... hiện các phản ứng sinh hóa, và phƣơng pháp sinh học phân tử hiện đại các tác giả đã xác định đƣợc tác nhân gây ra loại bệnh này ở nhiều loài cá nhƣ cá vây vàng ( Trachinotus 17 blochii) , cá hồng đỏ (Lutjanus erythopterus), cá mú là 2 loài vi khuẩn Nocardia seriolae và Nocardia asteriodes [15] a Cá Larimichthy crocea Hình 1.10 Loài cá Larimichthy crocea với các dấu hiệu bệnh do vi khuẩn Nocadia gây ra ở. .. hai loài khác nhau.Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kết hợp cả quan sát hình thái, nhuộm Gram, test hóa sinh và sinh học phân tử để định danh loài vi khuẩn Nocardia sp 29 Chƣơng 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu a Đối tƣợng nghiên cứu: loài vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim. .. này là loài vi khuẩn Nocardia seriolae, là một trực khuẩn Gram (+), kháng acid và không di động [16] Nhóm nghiên cứu của Labrie và cs (2008), đã nhận xét rằng cá vây vàng là loài mẫn cảm với bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra Vi khuẩn này đƣợc phân lập từ não, mang, gan, lách và thận của cá vây vàng bị bệnh từ nhiều quốc gia khác nhau: 10 mẫu cá ở Malaysia, 14 mẫu cá ở Trung Quốc và Singapore Bệnh do... Quốc Ở Vi t Nam, cá phân bố chủ yếu ở vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam [8] 1.2.4 Tình hình sản xuất giống và ƣơng nuôi cá chim vây vàng trên thế giới và ở Vi t Nam Hiện nay cá chim vây vàng đã và đang đƣợc nuôi khá phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới bởi chúng có giá trị kinh tế cao dễ nuôi, vi c sản xuất giống tƣơng đối đơn giản  Trên thế giới Vi c nghiên cứu cho sinh sản nhân tạo cá Chim trắng vây vàng. .. trong các cơ quan nội tạng một dạng vi khuẩn hình que, Gram (+), dài từ 2 10 µm, phân nhánh và thƣờng gẫy thành các đoạn ngắn, kháng acid Chủng vi khuẩn này đƣợc đặt tên là NLB (Nocardia - like Bacteria) do có các đặc điểm hình thái, sinh vật và hóa học tƣơng tự với vi khuẩn Nocardia [4] 1.3 Những nghiên cứu về chi Nocardia gây bệnh cá 1.3.1 Nocadiosis - bệnh đốm trắng nội tạng ở cá Nocadiosis là bệnh. .. các chủng vi khuẩn Nocardia soli, Nocardia fluminea, Nocardia uniformis khi tiêm vào cá đuôi vàng (Seriola quinqueradiata) để chống lại bệnh do Nocardia seriolae gây ra ở cá đuôi vàng Kết quả cho thấy loại vaccine này có hiệu quả sinh ra kháng thể chống lại bệnh do vi khuẩn Nocardia seriolae gây ra [21] 3.2 Những nghiên cứu về định danh loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia trên cá 3.2.1 Các loài cá nƣớc ... tạng cá chim vây vàng Trachinotus blochii (Lacepéde, 1801) Khánh Hòa. ” Mục tiêu đề tài: Xác định loài vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng Trachinotus blochii (Lacepéde,. .. TRANG VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG LÊ THỊ THẢO NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LOÀI VI KHUẨN NOCARDIA sp GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG (Tranchinotus blochii Lacepéde, 1801) TẠI KHÁNH... hết nghiên cứu trƣớc phần lớn nghiên cứu giống thức ăn cá chim vây vàng, nghiên cứu bệnh tật hạn chế Chính lẽ chọn đề tài: Nghiên cứu xác định loài vi khuẩn Nocardia sp gây bệnh đốm trắng nội tạng