a. Phƣơng pháp tách chiết DNA
Từ môi trƣờng thạch nghiêng OGAWA, ta chọn khuẩn lạc riêng lẻ chuyển qua ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng BHI (có bổ sung huyết thanh bê đã đƣợc hấp khử trùng), nuôi lắc ở 26ºC, tốc độ 200 vòng/ phút trong 14 ngày. Sau đó thu sinh khối và tách chiết DNA tổng số vi khuẩn bằng bộ kít
DNeasy® Blood and Tissue Kits (Qiagen, Đức). DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ kiểm tra bằng cách điện di trong đệm TBE 0.5X dƣới nguồn điện 134 V để đọc kết quả, DNA đƣợc tách chiết thành công sẽ đƣợc bảo quản -20ºC để sử dụng cho các phản ứng PCR sau đó.
Các bƣớc tách chiết DNA với bộ kít DNeasy® Blood and Tissue Kits
(QIAGEN, Đức):
Bƣớc 1: Ly tâm dịch nuôi vi khuẩn ở tốc độ 7500 vòng/ 10 phút, loại bỏ dịch nổi và thu cặn.
Bƣớc 2: Bổ sung 180µl enzymatic lysis buffer (dung dịch phá vỡ tế bào). Ủ ở 37º C, trong 2 giờ.
Bƣớc 3: Thêm 25µl dung dịch proteinase K và 200µl đệm AL (không trộn etanol), trộn đều.
Bƣớc 4: Ủ 56ºC trong 30 phút.
Bƣớc 5: Thêm 200µl etanol ( 96 - 100%) vào mẫu, trộn đều.
Bƣớc 6: Dùng pipet hút hỗn hợp từ bƣớc 5 sang cột DNeasy Mini Spin Colum (cột đặt trên ống thu mẫu 2ml), ly tâm 8000/ 1 phút, loại bỏ dịch.
Bƣớc 7: Chuyển các cột DNeasy Mini Spin Colum sang ống thu mẫu 2ml mới, thêm 500µl đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
Bƣớc 8: Chuyển các cột sang ống thu 2ml mới, thêm 500 µl đệm AW2, ly tâm 14000 vòng/ 3 phút, loại bỏ dịch.
Bƣớc 9: Đặt cột sang ống eppendorf 1,5ml hoặc 2ml sạch, thêm 200µl Buffer AE, để yên 1 phút ở nhiệt độ phòng, rồi ly tâm 8000 vòng/ 1 phút. Loại bỏ cột DNeasy Mini Spin thu đƣợc dung dịch DNA.
DNA đƣợc bảo quản -20ºC cho đến khi sử dụng.
b. Phƣơng pháp PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của Nocardia sp.
Cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR này là N5F1 và N5R1 dùng để khuếch đại đoạn gen đặc trƣng cho loài vi khuẩn Nocardia dài 1069 bp. Trình tự của 2 mồi nhƣ sau:
Mồi xuôi N5F1: 5' -TGA GCC TGA ACT GCA TGG TTC-3'. (21nu)
Mồi ngƣợc N5R1: 5'-ACG GTA TCG CAG CCC TCT GTA-3'. (21 nu) ( Labrie và cs, 2008)Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl). Master Mix 12,5 Mồi N5F1 1 Mồi N5R1 1 H2O 9,5 DNA 1 Tổng thể tích cho một mẫu phản ứng PCR: 25 Chu trình nhiệt:
Giai đoạn 1: 95ºC trong 2 phút
Giai đoạn 2: 95ºC trong 30 giây 58ºC trong 1 phút
72ºC trong 1 phút Giai đoạn 3: 72ºC trong 5 phút
Giai đoạn 4: giữ ở 4ºC
c. Kỹ thuật điện di gel Agarose.
Nguyên tắc chung:
Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử tích điện âm khác nhau về kích thƣớc, điện tích, mức cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua
hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dƣơng (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trƣờng điện di dƣới tác dụng của điện trƣờng. Các phân đoạn DNA có kích thƣớc càng nhỏ thì tốc độ di chuyển trên điện trƣờng nhanh hơn và ngƣợc lại vì vậy có thể phân tách đƣợc từng đoạn DNA hoặc gen riêng rẽ.
Các nucleic acid trong gel agarose sẽ đƣợc phát hiện dƣới tia tử ngoại UV nhờ ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dƣới tác dụng của ti tử ngoại (λ = 300 nm) sẽ phát huỳnh quang và quan sát thấy các vạch đỏ màu cam. Mỗi một băng điện di phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thƣớc.
Các bƣớc tiến hành:
- Cân 0,4 g agarose và thêm vào 40ml đệm TBE 0,5X ( gel agarose 1%) vào trong bình schott duran 250 ml, rồi cho vào lò vi sóng đun đến lúc gel tan hoàn toàn.
- Sau đó để nguội khoảng 500C – 600C, thêm 1,6µl ethidium bromide vào gel,
lắc đều, đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lƣợc.
- Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lƣợc ra.
- Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm TBE 0,5X cho đến khi ngập bản gel. - Trộn 9µl mẫu DNA (sau khi khuếch đại bằng PCR) với loadingdye 6X. Tra mẫu lần lƣợt các giếng.
- Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 134 V, thời gian 30 phút. Đọc kết quả trên máy chụp và phân tích hinh ảnh gel.
