1.4.1.1. Định nghĩa
Hình 1.11. Cá lóc (Ophiocephalusargus cantor) bị
nhiễm vi khuẩn Nocardia (Wang, 2007)
Định danh là công việc xếp loại vi sinh vật phân lập đƣợc theo hệ thống phân loại sinh vật với danh pháp thứ tự: giới (kingdom), ngành (phylum), lớp (class), bộ (order), họ (family), chi (genus), loài (species), dƣới loài (sub species).
Có 2 phƣơng pháp để định danh vi sinh vật:
Phƣơng pháp truyền thống: khảo sát các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật.
Phƣơng pháp hiện đại: sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự đoạn gen đặc trƣng của sinh vật cho kết quả nhanh chóng và chính xác.
1.4.1.2.Phƣơng pháp truyền thống
Việc phân loại vi khuẩn đƣợc thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào. Mặc dù phƣơng pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy có khi không hiệu quả trong phân loại, nhƣng hình thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong việc định danh các chủng mới.
Phƣơng pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thƣờng dựa vào các chỉ tiêu phân loại nhƣ: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dƣỡng năng lƣợng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất [5]
a. Sử dụng khóa phân loại
Thông thƣờng để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phƣơng pháp truyền thống, ngƣời ta dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, đƣợc sử dụng rộng rãi là khóa phân loại Bergey (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology). Khi phiếu định danh đã có dữ liệu đầy đủ thu đƣợc từ: nghiên cứu hình thái, đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm lý hóa của chủng vi khuẩn chƣa biết chúng ta đã sẵn sàng định danh đƣợc giống và loài. Việc định danh đến chi tƣơng đối dễ dàng, còn phân biệt đến loài thì khó hơn.
b. Định danh bằng phƣơng pháp Bacteriophage
Dựa trên cơ sở khoa học là mỗi loại vi khuẩn là vật chủ của một loại vius gọi là Bacteriophage, mỗi phage có thể nhân lên đặc hiệu ở mỗi loài vi khuẩn nhất định
và gây bệnh cho vi khuẩn đó. Bằng phƣơng pháp dùng phage đã biết trƣớc cho tiếp xúc với vi khuẩn đang cần xác định nếu đặc hiệu thì tế bào vi khuẩn sẽ bị phage gây bệnh và phá hủy.
Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng bộc lộ một số nhƣợc điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.
c. Định danh vi khuẩn theo kiểu huyết thanh
Đây là phƣơng pháp đƣợc dùng khá lâu nhƣng rất hiệu quả và hiện vẫn đang đƣợc sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bacillus thuringiensis). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên màng tế bào vi sinh vật. Ƣu thế của phƣơng pháp này là các kháng huyết thanh đƣợc dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trƣờng hợp đặc trƣng cho loài. Đây là phƣơng pháp khá ổn định nhƣng hạn chế chủ yếu của phƣơng pháp này: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại [35].
d. APIE KIT
Nguyên tắc: dựa vào nhiều phản ứng khác nhau ví dụ API 20E gần 20 phản ứng. Hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhƣng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trƣờng hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣ tuổi tế bào, lƣợng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả.
Kit API 20E là bộ kit do hãng BioMerieux sản xuất, nó đƣợc dùng cho việc định danh các loài vi khuẩn Gram (-), hình que. Mặc dù API là phƣơng pháp đƣợc ứng dụng cho việc định danh các loài vi khuẩn trên động vật nhƣng ngày nay cũng sử dụng rộng rãi trong thủy sản do các thao tác nhanh đơn giản không mất nhiều thời gian, cho kết quả sớm. Cùng với phƣơng pháp sinh hóa truyền thống API đƣợc
ứng dụng vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu các giống loài vi khuẩn. Cụ thể, năm 2002, Crumlish và cs đã sử dụng API để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa loài E. ictaluri trên cá tra ở 2 tỉnh An Giang và Cần Thơ. Một nghiên cứu gần đây của Buller (2004) dùng kit API 20E không chỉ cho chủng E. ictaluri mà còn cho các loài khác. Hàng loạt các đề tài nghiên cứu của Lƣơng Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đƣơng (2007) cũng đã sử dụng kit API 20E để kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của E. ictaluri.
e. Sử dụng phƣơng pháp số học
Ngoài ra, dựa vào những thông tin và đặc điểm của vi sinh vật, ngƣời ta còn có thể tính hệ số tƣơng đồng để đánh giá mức độ tƣơng đồng giữa các chủng vi sinh vật. Trong đó hệ số Jaccard đƣợc sử dụng để so sánh mức độ tƣơng đồng giữa hai chủng khi muốn bỏ qua các đặc điểm mà cả hai chủng đều thiếu.
f. Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin)
Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Nhƣ vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã đƣợc phân loại dựa vào kiểu bacteriocin. Ví dụ, ở các loài vi khuẩn Proteus.