2.3.1. Thu mẫu cá bệnh
Cá bệnh đƣợc thu tại các địa điểm nuôi cá ở Khánh Hòa nhƣ: Ninh Hòa, Cam Ranh, Nha Trang bằng các dụng cụ chuyên biệt, chuyển về phòng thí nghiệm bằng phƣơng pháp vận chuyển kín có bơm oxy (đảm bảo cá còn sống khi đƣa về phòng thí nghiệm).
Tình hình bệnh và hiện tƣợng chết xảy ra tại cơ sở nuôi kết hợp với một số yếu tố môi trƣờng nhƣ nhiệt độ nƣớc, độ mặn, sóng gió, thời tiết đƣợc thu thập lại trong quá trình thu mẫu.
2.3.2. Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh
Cá dấu hiệu bệnh đƣợc mang về phòng thí nghiệm, trƣớc khi phân lập vi khuẩn mặt ngoài cơ thể cá đƣợc khử trùng bằng cồn 70º và lau sạch. Tiến hành đo kích thƣớc cá rồi ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài. Tiếp đó tiến hành giải phẫu cá bằng dao mổ và kéo tiệt trùng. Dấu hiệu bệnh lý bên trong cơ thể cá đƣợc ghi nhận. Dùng dao mổ tiệt trùng sạch rạch những vùng có dấu hiệu bệnh nhƣ cơ, gan, thận ,lách, mang sau đó đặt que cấy vào nơi vừa rạch, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và ria cấy trên mặt thạch thạch nghiêng ogawa theo các kiểu: Hình chữ chi, hình vòng xoắn hoặc hình vạch song song. Các u sƣơng cũng đƣợc phân lập vi khuẩn. Các thao tác đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng. Môi trƣờng sau khi cấy đƣợc ủ ở nhiệt độ 26 – 28ºC trong khoảng 6 – 10 ngày.
2.3.4. Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn.
Có nhiều phƣơng pháp bảo quản vi khuẩn khác nhau nhƣ cấy truyền định kỳ lên môi trƣờng mới, phƣơng pháp đông khô, phƣơng pháp bảo quản bằng nitơ lỏng…. Và tùy theo mục đích sử dụng, loại vi sinh vật cần bảo quản, thời gian bảo quản và điều kiện kinh tế, cơ sở vật chất mà ta lựa chọn phƣơng pháp bảo quản thích hợp nhất.
Với loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia này chúng tôi sử dụng phƣơng pháp bảo quản lạnh sâu ở -80ºC . Với phƣơng pháp này tế bào vi khuẩn có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu do việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nƣớc đá trong tế bào, vì thế để khắc phục nhƣợc điểm này ngƣời ta thƣờng bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh nhƣ glycerol, DMSO (dimethyl sulfoside), trong đề tài này chúng tôi sử dụng glycerol bổ sung vào dịch trƣợc khi đem đi bảo quản.
Cách tiến hành:
Vi khuẩn sau khi đƣợc phân lập trên môi trƣờng thạch ogawa sẽ chuyển sang nuôi cấy lỏng trong môi trƣờng BHI có bổ sung huyết thanh bò (Newborn Calf Serum) tỉ lệ: 2%.
Vi khuẩn đƣợc nuôi lắc ở nhiệt độ 24 – 26°C tốc độ 200 vòng/ phút, trong vòng 8 - 15 ngày thu sinh khối vi khuẩn.Tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng trong 5 phút để thu sinh khối vi khuẩn. Thêm 300µl dung dịch glycerol 50%, mix đều cho glycerol trộn đều với dịch vi khuẩn. Ghi tên loài, ngày tháng tiến hành bảo quản lên trên eppendorf sau đó cho vào trong túi đem bảo quản trong tủ lạnh -80ºC. Chú ý đầu tuýp, eppendorf, glycerol phải đƣợc hấp khử trùng 121º
C trong 15 phút để tránh tạp nhiễm.
2.3.5. Nhuộm vi khuẩn và nhuộm các tiêu bản phết từ mô của nội tạng cá bệnh
a) Phƣơng pháp nhuộm của Ziehl- Neelsen:
Phƣơng pháp nhuộm Ziehl-Neelsen đã đƣợc sử dụng để nhận biết loại vi khuẩn kháng acid (acid fast) có mặt trong tổ chức mô của cá bệnh.
Trƣớc tiên tiến hành sát trùng bề mặt cá nghiên cứu bằng miếng bông thấm cồn etanol 70%, dùng kéo vô trùng giải phẫu cá để quan sát các nội tạng nhƣ gan, lách, và thận ở bên trong ổ bụng. Dùng kéo và panh vô trùng để cắt và kẹp một miếng nhỏ mô từ các tổ chức có bộc lộ bệnh lý, phết mô cắt này trên mặt của phiến kính sạch (đã đƣợc ngâm trong acid acetic đậm đặc sau 24 h, rồi rửa sạch trƣớc khi dùng), trong một giọt nƣớc muối sinh lý vô trùng (0,85%) để tạo một vết bôi và để khô trong không khí. Cố định tiêu bản này bằng cách đƣa phiến kính có vết bôi qua lại 3 lần trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhỏ Carbol fuchsine tràn trên mặt vết bôi và hơ nóng phiến kính này trên ngọn lửa nhỏ để bốc hơi trong 10 phút, tuy nhiên không nên để khô vết bôi, do vậy Carbor fuchsine đã đƣợc bổ sung. Tiếp theo đƣa phiến kính rửa nhẹ nhàng với nƣớc sạch trƣớc khi làm mất màu bằng acid acetic 0,5% trong 20 - 30 giây. Tiếp theo nhuộm tiêu bản phết bằng Methylene blue trong 60 giây, sau đó rửa nhẹ bằng nƣớc cất và để khô rồi quan sát ở kính hiển vi dƣới vật kính dầu (100x) để phát hiện phần cơ chất của các tổ chức vật chủ bắt màu xanh của methylene blue các khuẩn lạc hay các tế bào của vi khuẩn kháng acid bắt màu hồng tím của Fuchsine.
b. Phƣơng pháp nhuộm Gram
Phƣơng pháp này nhằm nhận dạng ra các tế bào hay khuẩn lạc vi khuẩn trong mô của vật chủ và xếp vi khuẩn đó vào 1 trong 2 nhóm: Gram (+) hoặc Gram (-).
Các thao tác đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Cắt một miếng mô nhỏ từ các tổ chức của cá bệnh có bộc lộ bệnh lý, dùng kẹp phết mô này lên mặt của tấm lam sạch (đã đƣợc ngâm trong acid acetic đậm đặc sau 24 h, rồi rửa sạch trƣớc khi dùng) trong một giọt nƣớc muối sinh lý vô trùng (0,85%), để tạo một vết bôi và để khô trong không khí. Cố định tiêu bản này bằng cách đƣa lamel có vết bôi qua lại 3 lần trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ tràn thuốc nhuộm tím crystal ( bao gồm: 2g tím crystal hòa tan trong 20ml cồn etylic, sau đó trộn lẫn với 80 ml dung dịch ammonium oxalate 1% trong nƣớc cất) lên bề mặt của vết mô phết và để yên trong 30-60 giây. Sau đó rửa nhẹ bằng nƣớc vòi, vẩy khô. Nhỏ tràn dung
dịch lugol lên bề mặt của vết mô phết trong 1 phút sau đó rửa nhẹ và vẩy khô nƣớc. Tiếp tục làm mất màu tím bằng cồn-aceton rồi rửa nhẹ và vẩy khô. Sau đó nhỏ tràn thuốc nhuộm Fuchsine trên vết mô phết trong 1- 2 phút. Cuối cùng rửa nƣớc chảy nhẹ, để khô tự nhiên và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 100x trong dầu. Vi khuẩn Gram (+) có mầu tím và vi khuẩn Gram (-) có mầu hồng.
Phƣơng pháp nhuộm vi khuẩn cũng đƣợc thao tác với các bƣớc tƣơng tự nhƣ trên.
2.3.6. Định danh vi khuẩn bằng thử nghiệm test hóa sinh
Các phản ứng sinh hóa truyền thống nhƣ OF, KIA, khả năng di động, catalase, oxidase, và khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ: Arabinose, glucose, mantiol sucrose, galactose, manose, maltose đã đƣợc thực hiện làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn theo hệ thống phân loại của Bergey đƣợc trình bày bởi Holt J.G và cs (xuất bản lần thứ 9,1994).
a. Tính di động
Dùng phiến kính sạch, nhỏ lên phiến kính một giọt canh khuẩn, sau đó đậy lá kính lên, quan sát kính hiển vi quang học 40 X.
b. Phản ứng Oxidase
Dùng que cấy lấy một khuẩn lạc cho tiếp xúc trên que thử oxidase. Quan sát que thử trong 30 giây và quan sát sự thay đổi màu sắc: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dƣơng tính (+) và không chuyển màu là âm tính (-).
c. Phản ứng Catalase
Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên lame. Dùng que cấy triệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2 3%. Phản ứng Catalase dƣơng tính khi có hiện tƣợng sủi bọt và ngƣợc lại catalase âm tính không sủi bọt.
d. Khả năng lên men và oxy hóa đƣờng glucose (O/F test).
Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa môi trƣờng O/F đã tiệt trùng ở 121ºC trong 15 phút. Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn thuần trong ống thạch nghiêng và cấy thẳng vào2 ống nghiệm chứa môi trƣờng O/F, sau đó phủ 0,5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào một ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm (F). Ống còn lại
sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn (O). Để 2 ống nghiệm vào trong tủ ấm 28ºC. Đọc kết quả sau 1-7 ngày.(Dựa vào bảng 2.1).
Bảng 2.1. Bảng đọc kết quả của O/F test Ống tiếp xúc không
khí Ống phủ dầu paraffin Kết quả
Xanh lá cây Xanh lá cây Không phản ứng với
glucose
Xanh lơ ở phần trên Xanh lá cây Phản ứng kiềm tính
Vàng Xanh lá cây Phản ứng oxy hóa
Vàng Vàng Phản ứng lên men
e. Khả năng sinh H2S Các bƣớc thực hiện:
+ Đun và khuấy cho tan hoàn toàn môi trƣờng TSI + Tiệt trùng ở 121ºC trong 15 phút. Để nguội ở 45ºC. + Cho khoảng 5ml môi trƣờng vào ống nghiệm.
+ Để nghiêng ống nghiệm tạo một mặt phẳng nghiêng.
+ Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. + Ủ ở 28ºC. Đọc kết quả sau 14-28 giờ.
Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm. f. Khả năng sử dụng các loại đƣờng
Các bƣớc thực hiện:
+ Môi trƣờng: Các dung dịch đƣờng mannitol, glucose, galactose, arabinose, sucrose, mantolse, mannose có bổ sung thêm2% NaCL và 2% nấm men (thích hợp với loại vi khuẩn kháng acid)
+ Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm. Ủ trong tủ ấm ở 28ºC. + Sau 48 giờ đọc kết quả.
Phản ứng dƣơng tính khi ống nghiệm chuyển sang màu vàng và ngƣợc lại.
2.3.7. Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tửa. Phƣơng pháp tách chiết DNA a. Phƣơng pháp tách chiết DNA
Từ môi trƣờng thạch nghiêng OGAWA, ta chọn khuẩn lạc riêng lẻ chuyển qua ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng BHI (có bổ sung huyết thanh bê đã đƣợc hấp khử trùng), nuôi lắc ở 26ºC, tốc độ 200 vòng/ phút trong 14 ngày. Sau đó thu sinh khối và tách chiết DNA tổng số vi khuẩn bằng bộ kít
DNeasy® Blood and Tissue Kits (Qiagen, Đức). DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ kiểm tra bằng cách điện di trong đệm TBE 0.5X dƣới nguồn điện 134 V để đọc kết quả, DNA đƣợc tách chiết thành công sẽ đƣợc bảo quản -20ºC để sử dụng cho các phản ứng PCR sau đó.
Các bƣớc tách chiết DNA với bộ kít DNeasy® Blood and Tissue Kits
(QIAGEN, Đức):
Bƣớc 1: Ly tâm dịch nuôi vi khuẩn ở tốc độ 7500 vòng/ 10 phút, loại bỏ dịch nổi và thu cặn.
Bƣớc 2: Bổ sung 180µl enzymatic lysis buffer (dung dịch phá vỡ tế bào). Ủ ở 37º C, trong 2 giờ.
Bƣớc 3: Thêm 25µl dung dịch proteinase K và 200µl đệm AL (không trộn etanol), trộn đều.
Bƣớc 4: Ủ 56ºC trong 30 phút.
Bƣớc 5: Thêm 200µl etanol ( 96 - 100%) vào mẫu, trộn đều.
Bƣớc 6: Dùng pipet hút hỗn hợp từ bƣớc 5 sang cột DNeasy Mini Spin Colum (cột đặt trên ống thu mẫu 2ml), ly tâm 8000/ 1 phút, loại bỏ dịch.
Bƣớc 7: Chuyển các cột DNeasy Mini Spin Colum sang ống thu mẫu 2ml mới, thêm 500µl đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
Bƣớc 8: Chuyển các cột sang ống thu 2ml mới, thêm 500 µl đệm AW2, ly tâm 14000 vòng/ 3 phút, loại bỏ dịch.
Bƣớc 9: Đặt cột sang ống eppendorf 1,5ml hoặc 2ml sạch, thêm 200µl Buffer AE, để yên 1 phút ở nhiệt độ phòng, rồi ly tâm 8000 vòng/ 1 phút. Loại bỏ cột DNeasy Mini Spin thu đƣợc dung dịch DNA.
DNA đƣợc bảo quản -20ºC cho đến khi sử dụng.
b. Phƣơng pháp PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của Nocardia sp.
Cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR này là N5F1 và N5R1 dùng để khuếch đại đoạn gen đặc trƣng cho loài vi khuẩn Nocardia dài 1069 bp. Trình tự của 2 mồi nhƣ sau:
Mồi xuôi N5F1: 5' -TGA GCC TGA ACT GCA TGG TTC-3'. (21nu)
Mồi ngƣợc N5R1: 5'-ACG GTA TCG CAG CCC TCT GTA-3'. (21 nu) ( Labrie và cs, 2008)Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl). Master Mix 12,5 Mồi N5F1 1 Mồi N5R1 1 H2O 9,5 DNA 1 Tổng thể tích cho một mẫu phản ứng PCR: 25 Chu trình nhiệt:
Giai đoạn 1: 95ºC trong 2 phút
Giai đoạn 2: 95ºC trong 30 giây 58ºC trong 1 phút
72ºC trong 1 phút Giai đoạn 3: 72ºC trong 5 phút
Giai đoạn 4: giữ ở 4ºC
c. Kỹ thuật điện di gel Agarose.
Nguyên tắc chung:
Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử tích điện âm khác nhau về kích thƣớc, điện tích, mức cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua
hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dƣơng (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trƣờng điện di dƣới tác dụng của điện trƣờng. Các phân đoạn DNA có kích thƣớc càng nhỏ thì tốc độ di chuyển trên điện trƣờng nhanh hơn và ngƣợc lại vì vậy có thể phân tách đƣợc từng đoạn DNA hoặc gen riêng rẽ.
Các nucleic acid trong gel agarose sẽ đƣợc phát hiện dƣới tia tử ngoại UV nhờ ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dƣới tác dụng của ti tử ngoại (λ = 300 nm) sẽ phát huỳnh quang và quan sát thấy các vạch đỏ màu cam. Mỗi một băng điện di phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thƣớc.
Các bƣớc tiến hành:
- Cân 0,4 g agarose và thêm vào 40ml đệm TBE 0,5X ( gel agarose 1%) vào trong bình schott duran 250 ml, rồi cho vào lò vi sóng đun đến lúc gel tan hoàn toàn.
- Sau đó để nguội khoảng 500C – 600C, thêm 1,6µl ethidium bromide vào gel, lắc đều, đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lƣợc.
- Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lƣợc ra.
- Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm TBE 0,5X cho đến khi ngập bản gel. - Trộn 9µl mẫu DNA (sau khi khuếch đại bằng PCR) với loadingdye 6X. Tra mẫu lần lƣợt các giếng.
- Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 134 V, thời gian 30 phút. Đọc kết quả trên máy chụp và phân tích hinh ảnh gel.
2.4. Sơ đồ khối mô tả các bƣớc thực hiện khi nghiên cứu định danh vi khuẩn từ cá bệnh khuẩn từ cá bệnh
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Cá chim vây vàng bị bệnh
Phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng OGAWA (phân lập ở gan, thận, lách, mang, cơ)
Giải phẫu cá
Nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng BHI
Bảo quản vi khuẩn Kiểm tra các đặc điểm hóa
sinh vi khuẩn
Làm các tiêu bản phết từ: cơ, gan, thận, lách, mang
Nhuộm Gram và nhuộm Ziehl-Neelsen
Chọn khuẩn lạc đơn riêng lẻ, đặc trƣng.
Giải trình tự, phân tích trình tự
Điện di kiểm tra kết quả PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA
Tách chiết DNA
Định danh loài
Hình 2.1. Sơ đồ khối mô tả các bƣớc thực hiện khi nghiên cứu định danh vi khuẩn từ cá bệnh
3.1. Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng tại Khánh Hòa Khánh Hòa
Chúng tôi tiến hành thu mẫu 5 lần tại các địa điểm nuôi cá chim vây vàng ở Khánh Hòa (Ninh Hòa, Cam Ranh, Nha Trang) từ 3/3/2014 đến 21/5/2014. Đối tƣợng thu mẫu là những cá chim vây vàng có dấu hiệu nhiễm bệnh đốm trắng: gốc vây lở loét, có các nốt phồng rộp nhỏ ở da, khi vỡ tạo nên các vết loét nhỏ màu xám, có các khối u dọc cột sống làm cơ thể cá cong vẹo, dị dạng, bụng cá hơi phình và cứng. Cá có một số biểu hiện bất thƣờng về tập tính sống nhƣ: bỏ ăn, bơi tách khỏi đàn, thƣờng bơi lờ đờ, bơi không định hƣớng, bơi xoắn nhiều vòng trên mặt nƣớc (Nguyễn Thị Thùy Giang và cs 2011). Sau đó các mẫu cá đƣợc tiến hành phân tích tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học - Phân viện Thú y Miền trung, Nha Trang, Khánh Hòa.
Bảng 3.1. Bảng tổng hợp mẫu cá bị bệnh thu đƣợc sau 5 lần thu mẫu
Địa điểm Số lần thu mẫu Số lƣợng mẫu
Ninh Hòa 1 7
Cam Ranh 1 8
Nha Trang 3 25
Trong tổng số 40 con cá chim vây vàng thu đƣợc qua 5 lần lấy mẫu (bảng 3.1) có 35 con cá bộc lộ dấu hiệu bệnh lý rõ ràng đó là:
Dấu hiệu bên ngoài của bệnh nhƣ: Da cá mất màu sáng bạc do mất nhớt, có