Các mẫu cá bệnh thu đƣợc qua 5 lần lấy mẫu ở trên sẽ đƣợc làm tiêu bản phết. Các tiêu bản phết đƣợc làm từ bệnh phẩm lấy ở mang và các nội tạng của cá bệnh nhƣ: cơ dƣới vùng da bị phồng rộp, gan, thận, lách có đốm trắng của cá chim vây
vàng bị bệnh và đƣợc nhuộm bằng 2 phƣơng pháp: nhuộm Gram và nhuộm Ziehl- Neelsen.
Quan sát dƣới kính hiển vi quang học với vật kính dầu: Chúng tôi quan sát đƣợc một loại vi khuẩn dạng sợi mảnh, phân nhánh, có đốt, dài từ 2 đến 20µm, Gram (+) trên hầu hết các tiêu bản phết làm từ mô nội tạng của cá bị bệnh.
Nhuộm tiêu bản phết bằng phƣơng pháp của Ziehl-Neelsen: Các vi khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin, mô của cá bắt màu xanh của thuốc nhuộm methylen blue. Do vậy, có thể nhận định rằng, loài vi khuẩn phát hiện trong mô nội tạng của cá bệnh là loại vi khuẩn kháng acid (acid fast bacteria). Các tiêu bản phết mô từ cá chim vây vàng khỏe mạnh đã không phát hiện đƣợc loại vi khuẩn nhƣ đã trình bày ở hình 3.5.
Các kết quả đọc trên các tiêu bản phết mô nội tạng cá bệnh cho phép ta nhận định rằng: cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng đã bị nhiễm hệ thống một loại vi khuẩn dạng sợi mảnh, phân nhánh, kích thƣớc từ 2 đến vài chục µm, Gram (+) và là vi khuẩn kháng acid.
Mặt khác vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu và bƣớc đầu khẳng định thuộc chi Nocardia (Nguyễn Thị Thùy Giang và cs 2011). Vi khuẩn Nocardia cũng có kích thƣớc và hình dạng giống với kết quả mà chúng tôi quan sát đƣợc. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác loài vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng đã thu mẫu chúng tôi đã tiến hành phân lập và định danh tác nhân gây bệnh.
3.3. Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh
Để tìm hiểu sâu hơn và xác định loài vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên các mẫu cá chim vây vàng mà chúng tôi thu thập đƣợc từ các vùng khác nhau trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa, chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn gây bệnh từ các tổ chức
Hình 3.5. Các tiêu bản phết mô của cá bệnh nhuộm Gram (a,b,c,d)
mô, cơ quan (gan, mang, cơ, lách, thận, u xƣơng) của cá bệnh. Theo Nguyễn Thị Thùy Giang và cs (2011), vi khuẩn Nocardia gây bệnh đốm trắng trên cá chim vây vàng không phân lập đƣợc trên các môi trƣờng TSA, NA, TCBS mà chỉ phân lập đƣợc trên môi trƣờng Ogawa. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn gây bệnh trên môi trƣờng Ogawa (đã đƣợc mô tả trong phần vật liệu và phƣơng pháp). Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 26 - 28ºC, trên môi trƣờng Ogawa xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng kem, khô và nhăn nheo, khuẩn lạc lớn nhất có đƣờng kính khoảng 0,2 cm (Hình 3.6). Chúng tôi chọn ống phân lập đƣợc vi khuẩn mà không bị tạp nhiễm (theo quan sát bằng mắt thƣờng) rồi đặt tên cho chủng theo nguồn gốc nơi lấy mẫu và cơ quan phân lập đƣợc chúng. Kết quả phân lập đƣợc tổng kết trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả phân lập vi khuẩn Norcadia từ cá bệnh
Địa điểm lấy mẫu Cơ quan Số lƣợng mẫu cá Số chủng vi khuẩn Tỷ lệ phân lập đƣợc (%) Số chủng thuần khiết Tên chủng Ninh Hòa Gan 7 3 42,86 2 NHG1, NHG2 Mang 7 5 71,43 1 NHM1 Cơ 7 4 57,14 2 NHC1, NHC2 Lách 7 4 57,14 2 NHL1, NHL2 Thận 7 3 42,86 2 NHT1, NHT2 U
xƣơng 2 2 100 2 NHU1, NHU2
Cam Ranh
Gan 8 4 50 3 CRG1 – CRG3
Cơ 8 5 62,5 2 CRC1, CRC2
Lách 8 4 50 2 CRL1, CRL2
Thận 8 4 50 2 CRT1, CRT2
U
xƣơng 4 4 100 4 CRU1 – CRU4
Nha Trang Gan 25 15 60 10 NTG1 – NTG10 Mang 25 18 72 8 NTM1 – NTM8 Cơ 25 15 60 9 NTC1- NTC9 Lách 25 16 64 9 NTL1 – NTL9 Thận 25 13 52 9 NTT1 – NTT9 U
xƣơng 6 6 100 6 NTU1 – NTU6
Tổng số chủng phân lập thành công 75 75
Bảng 3.3 cho chúng ta thấy để phân lập đƣợc vi khuẩn Nocardia khá khó khăn, kể cả khi phân lập đƣợc thì khả năng bị tạp nhiễm cũng rất cao, đặc biệt khi phân lập ở mang tạp nhiễm rất lớn, ở u sƣơng và cơ quan khác phân lập thành công, ít bị tạp hơn.
Từ các khuẩn lạc đơn phân lập đƣợc trên môi trƣờng Ogawa, khuẩn lạc đƣợc cấy tăng sinh trên môi trƣờng lỏng BHI có bổ sung huyết thanh bê (2%). Sau 15 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 26ºC khuẩn lạc mọc và kết tủa trắng bông trong môi trƣờng (hình 3.7). Trong tổng số 75 chủng nuôi tăng sinh có 13 chủng bị tạp nhiễm (NHG2, NHL1, CRL1, CRT2, CRC1, NTG7, NTG4, NTG8, NTC6, NTC3, NTU2, NTT4, NTT9) đƣợc chúng tôi loại bỏ, còn lại 62 chủng. Do thời gian làm đề tài có hạn nên chúng tôi chỉ chọn 20 chủng để xác định đặc tính sinh hóa, còn lại 42 chủng sẽ đƣợc bảo quản lạnh sâu -80ºC.
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch OGAWA
20 chủng vi khuẩn thu đƣợc sau khi nuôi cấy tăng sinh thành công trong môi trƣờng BHI sẽ đƣợc dùng để làm các tiêu bản nhuộm Gram và nhuộm Ziehl- Neelsen. Dƣới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 - 1000 lần, kết quả thu đƣợc 100% chủng vi khuẩn phân lập đƣợc có dạng sợi, phân nhánh, gram (+) và kháng acid. Khi so sánh về đặc điểm hình thái và các đặc điểm khác, chúng tôi nhận thấy loại vi khuẩn có khuẩn lạc mùa trắng kem, khô và nhăn nheo trên chính là loại vi khuẩn đã tìm thấy trong các tiêu bản phết từ mô nội tạng của cá bệnh (hình 3.8) và tƣơng đƣơng với các kết quả khác (Nguyễn Thị Thùy Giang và cs 2011).
Hình 3.7.Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trƣờng BHI bổ sung huyết thanh bê
(ống phải: ống đối chứng, ống trái: vi khuẩn đang trong quá trình phát triển tạo thành kết
Hình 3.8. Hình ảnh tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi a. Kết quả nhuộm Ziehl- Neelsen
b. Kết quả nhuộn Gram