Ngày nay, sự phát triển của của kỹ thuật sinh học hiện đại đã đƣa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bƣớc phát triển mới. Phƣơng pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên, phƣơng pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền.
Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thƣớc đo tiến hóa”.
Một số phƣơng pháp phân lọai dựa vào vật liệu di truyền đang đƣợc sử dụng hiện nay:
a) Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Một đoạn gene mong muốn trƣớc khi giải trình tự cần phải đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR. PCR là một phƣơng pháp in vitro đƣợc dùng để khuếch đại nhân số lƣợng DNA từ mạch khuôn là một trình tự DNA đích ban đầu, thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis và cs (Mỹ) phát minh năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gene, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm.
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này đƣợc nối dài để hình thành mạch mới. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ đƣợc khuếch đại thành một số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Kỹ thuật PCR đƣợc coi là nền tảng của nhiều kỹ thuật phân tích DNA.
Phản ứng nhân gene đƣợc thực hiện với enzyme DNA chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bƣớc:
Bƣớc 1: biến tính DNA, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bƣớc 2: bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn.
Bƣớc 3: kéo dài chuỗi theo mồi theo chiều 5’- 3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng PCR đƣợc quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Nhƣ vậy, kết quả sẽ tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn DNA có kích thƣớc 20 - 30 nucleotide đƣợc thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ nhƣ vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuếch đại đƣợc đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao nhƣ rDNA thì khi cặp mồi đƣợc thiết kế, chúng có thể nhân đƣợc gene từ nhiều đối tƣợng. Ngƣợc lại, trong nhiều trƣờng hợp dùng mồi không đặc hiệu chúng có thể nhân các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều đƣợc dùng cho định type vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzyme DNA polymerase I từ E. coli. Tuy nhiên, enzyme này bị biến tính ở 94oC cần phải bổ sung enzyme mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này đã đƣợc cải thiện do dùng enzyme Taq DNA polymerase chịu nhiệt (Taq = Thermus aquaticus ). Enzyme này đƣợc tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nƣớc nóng. Tốc độ xúc tác cho phản ứng của enzyme này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại 75oC. Hoạt tính enzyme giảm một nửa khi bị xử lý tại 92,5oC trong 23 phút hoặc 40 phút tại 95oC. Nhƣ vậy khi dùng enzyme này thì không cần bổ sung enzyme mới sau mỗi chu kỳ phản ứng.
Các thông số kỹ thuật:
Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách DNA làm sợi khuôn. Nhƣ vậy, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩm nhƣng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị DNA theo phƣơng pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) hoặc đệm phosphate vì kết quả sẽ làm giảm Mg2+ (do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có thể nhân đƣợc đoạn gene dài 10 Kb nhƣng trong thực tế thƣờng dùng để nhân các đoạn có kích thƣớc ngắn hơn (<2 Kb).Có thể tham khảo các thông số thành phần phản ứng PCR trong bảng 1.3 dƣới đây.
Bảng 1.3.Thành phần phản ứng PCR Thành phần Số lƣợng ADN khuôn 10-100 ng dNTP (mỗi loại) 200 mM Mồi xuôi 0,1 – 1,0 mM Mồi ngƣợc 0,1 – 1,0 mM Taq polymerase 1 U KCl 50 mM Tris HCl (pH = 8,4) tại 25oC 10 mM MgCl2 2,85 mM Gelatin 100 mg/l Nonidet-40 0,05%
Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20 - 30 chu kỳ. Điều chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với DNA đích gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện tƣợng kẹp tóc. Ngày nay ngƣời ta có thể tối ƣu hoá việc chọn mồi nhờ sự trợ giúp của các chƣơng trình máy tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện tƣợng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu, điều này thƣờng hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin.Tuy nhiên trong hầu hết các trƣờng hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng có thể hạn chế đƣợc các sản phẩm không mong muốn.Các thành phần nhƣ nhiệt độ, nồng độ Mg2+
và enzyme có ảnh hƣởng lớn đến tính đặc hiệu. Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau.Với cách này yêu cầu sản phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Quy trình có thể đƣợc thực hiện nhƣ sau: sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa DNA với ethanol. Kết tủa sau đó đƣợc hoà với
đệm thích hợp và sau đó đƣợc xử lý với enzyme cắt giới hạn thích hợp. Kiểm tra kết quả trên gel agarose, trong một số trƣờng hợp kết quả có thể đƣợc phân tích trên gel polyacrylamide để thu đƣợc độ phân giải cao hơn. Thông thƣờng hoạt tính enzyme giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Nhƣ vậy, có thể ƣớc lƣợng 50% hiệu quả khuếch đại sẽ bị mất trong toàn bộ quá trình phản ứng.
+ Một số khó khăn với phản ứng PCR
PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhƣng cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh do virus hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dƣơng tính trong phản ứng PCR, và vì phản ứng PCR rất nhạy nên có thể sẽ cho kết quả dƣơng tính giả trong. Để hạn chế thực tế này cần tiến hành với các mẫu đối chứng cần thiết để biết đƣợc sự nhiễm tạp từ các thành phần phản ứng hay từ dụng cụ thí nghiệm.
Một vấn đề nữa cũng cần đề cập là sai số trong phản ứng nhân gene với enzyme taq DNA polymerase. Sai sót thêm nucleotid xảy ra với mỗi một đơn vị sao chép khoảng 9000 nucleotide và đột biến dịch khung xảy ra với số lƣợng tƣơng ứng khoảng 40000 nucleotide.
b. Giải trình tự các gene mã hóa cho tiểu phần 16S rRNA
Khi muốn nghiên cứu trình tự các nucleotide của một gene, một đoạn DNA, hoặc cả phân đoạn DNA cần phải tiến hành giải trình tự. Một số phƣơng pháp giải trình tự thƣờng dùng hiện nay đó là:
Phƣơng pháp hóa học (Phƣơng pháp Maxam và Gilbert, 1977)
Các đoạn DNA đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ở đầu 5’, và đƣợc xử lý bằng các chất hóa học nhằm bẻ gãy các đoạn DNA tại các vị trí base khác nhau. Từ các đoạn DNA sau một loạt lần giải trình tự ngƣời ta có thể ghép nối để có trình tự nucleotide hoàn chỉnh.
Phƣơng pháp Dideoxy (Phƣơng pháp Sanger, 1977):
Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA
polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ có chứa nhóm OH tự do, khi gặp nucleotide không có nhóm 3’OH thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trƣng của phƣơng pháp là sử dụng dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một các ngẫu nhiên. Trong phản ứng sử dụng DNA mồi là đoạn DNA mạch đơn có kích thƣớc 20 nucleotide.
Phƣơng pháp đƣợc chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Tap polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có bổ sung khoảng 1% các loại ddNTP (dideoxynucleotide). Cho mỗi phản ứng khác nhau. Các dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở cacbor thứ 3 và carbon thứ 4. Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP thì không có nhóm 3’OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không đƣợc kéo dài, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.
Chính do lƣợng ddNTP đƣợc đƣa vào với một lƣợng nhỏ so với lƣợng dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP đƣợc sử dụng ngẫu nhiên làm phản ứng tổng hợp DNA dừng lại. Kết quả sẽ tổng hợp đƣợc đoạn nucleotide có kích thƣớc dài ngắn khác nhau. Dể xác định trình tự, ngƣời ta điện di kết quả thu đƣợc trên gel polyacylamid. Các đoạn oligonucleotide có kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trên bản gel. Lúc này thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát đƣợc các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả sẽ thu đƣợc trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen [35].
1.4.1.4. Các phƣơng pháp định danh loài thuộc chi Nocardia
a. Định danh bằng test hóa sinh
Yêu cầu đầu tiên và quan trọng đối với test hóa sinh là thu đƣợc khuẩn lạc đơn, thuần khiết để việc định danh đƣợc chính xác hơn. Việc định danh này đƣợc thực hiện dựa vào các đặc điểm kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật. Các cách tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục đích định danh là cách truyền thống.
Các thử nghiệm hóa sinh của hàng trăm loài vi sinh vật tại nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới đƣợc tổng hợp thành những bản định danh vi sinh vật. Bảng hóa sinh bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trƣng nhất để phân loài vi sinh vật đƣợc biểu thị bằng một trị số là tỷ lệ phần trăm thử nghiệm hóa sinh cho kết quả dƣơng tính theo thống kê ở một loài sinh vật. Nhƣ vậy, trị số 100 có nghĩa là 100% trƣờng hợp của loài này đã thử đều cho các thử nghiệm dƣơng tính, ngƣợc lại 0 có nghĩa là 0% trƣờng hợp thử nghiệm cho kết quả dƣơng tính. Trong thực tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị quy ƣớc bằng các ký hiệu nhƣ (+): dƣơng tính, (-): âm tính; (+/-) khoảng trên 70% là dƣơng tính và (-/+) khoảng 70% là âm tính.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phản ứng hóa sinh Catalase, Cytochrom oxydase, O/F, sinh hơi, sinh H2S, khả năng di động, và ngoài khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ: glucose, lactose, mannitol, maltose, mannose và galactose, để định danh loài vi khuẩn thuộc chi Nocardia gây bệnh trên cá chim vây vàng.
b.Định danh bằng sinh học phân tử
Phân tử 16S rRNA ở prokaryote và 18S ở eukaryote là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật.
Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử 16S rRNA còn có ƣu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhƣng vẫn có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trƣng từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp vì mục tiêu phân lọai nhờ có kích thƣớc vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự.
Phƣơng pháp hiện đại dùng để định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thƣờng đƣợc sử dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA.Vi khuẩn
Nocardia sp. đƣợc phân lập trên môi trƣờng Ogawa, nuôi cấy trên môi trƣờng BHI sau đó đƣợc tách chiết DNA bằng bộ kit DNeasy® Blood and Tissue Kits
(QIAGEN, Đức), DNA đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR và giải trình tự. Sau đó, sử dụng chƣơng trình BLAST N (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) để
so sánh trình tự 16S rDNA của các dòng vi khuẩn với trình tự 16S rDNA của loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information).Và giá trị tƣơng đồng 98,6% của trình tự rADN 16S đƣợc coi là ngƣỡng để phân biệt hai loài khác nhau.Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kết hợp cả quan sát hình thái, nhuộm Gram, test hóa sinh và sinh học phân tử để định danh loài vi khuẩn Nocardia
sp.
Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
a. Đối tƣợng nghiên cứu: loài vi khuẩn Nocardia sp. gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng Trachinotus blochii (Lacepéde, 1801) tại Khánh Hòa.
b. Thời gian nghiên cứu: 20/2/ 2014 – 2/6/2014.
c. Địa điểm nghiên cứu: Phân viện thú y miền Trung – Nha Trang – Khánh Hòa.
2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất và môi trƣờng, thuốc thử
a. Hóa chất.
Các loại đƣờng sử dụng để kiểm tra đặc tính hóa sinh của loài vi khuẩn
Nocardia sp. nhƣ: mannitol, glucose, galactose, arabinose, sucrose, maltose, mannose.
Các loại hóa chất dùng cho test hóa sinh: H2O 2,Paraffin, NaCl...
Bộ kít tách chiết DNA: DNeasy® Blood and Tissue Kits (QIAGEN, Đức).
- Dung dịch Buffer AW1. - Dung dịch Buffer AW2. - Dung dịch Buffer AE.
- Enzymatic lysis buffer ( 20 mM Tris-Cl, pH = 8,0; 2mM Sodium EDTA; 1,2 % Triton X – 100; 200mg / ml lysozyme).
- Ethanol (96 – 100%) . - Proteinase K 20mg/ml. Hóa chất điện di
- Dung dịch đệm Tris – borat/ EDTA 10X (TBE): 108g Tris base, 55g acid boric, 40ml EDTA 0,5M
- Ethidium bromide 10mg/ml - Thang DNA chuẩn 100 - 1000kb
- Agarose tinh khiết. Hóa chất cho PCR.
- Nƣớc không chứa RNase, DNase do công ty Promega cung cấp.
- Cặp mồi N5F1 và N5R1 do công ty IDT (Integrated DNA Technologies tổng hợp ) có trình tự nhƣ sau:
- Mồi xuôi N5F1: 5' -TGA GCC TGA ACT GCA TGG TTC-3'. (21nu) - Mồi ngƣợc N5R1: 5'-ACG GTA TCG CAG CCC TCT GTA-3'. (
21 nu)
- Master Mix (1,5mM MgCl2, 0,16 mM dNTP, 1U Taq DNA polymerase, 2,5 µl RCR buffer minus 1X) đƣợc cung cấp bởi công ty Promega.
b. Môi trƣờng.
Môi trƣờng Ogawa
- Dịch muối khoáng bao gồm: Kaliđihydrosunphát (KH2PO4) 3%, Sodium glutamate 3%, NaCl 6%
- Dung dịch malachite green, 2% - Dịch trứng gà
- Dung dịch glycerol
Trộn đều kỹ 300 ml dung dịch muối khoáng, 18ml dung dịch malachite