Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá bớp rachycentron canadum nuôi tại khánh hòa

i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trƣờng đại học Nha Trang, thầy cô giáo môn Viện Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, tạo điều kiện tốt cung cấp đầy đủ kiến thức chuyên ngành để có hội thực tập hoàn thành đề tài tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn TS Trần Vĩ Hích, ngƣời thầy hết lòng hƣớng dẫn truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian thực đề tài Xin cảm ơn tập thể lớp 55SH2 gắn bó với suốt năm học qua cảm ơn anh, chị, bạn bè bạn bè phòng thí nghiệm tận tình giúp đỡ thời gian hoàn thành đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình ngƣời thân bên cạnh động viên lúc khó khăn Trong trình thực tập không tránh khỏi sai sót, kính mong thầy cô giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu hoàn thiện ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá bớp 1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng, sinh dưỡng 1.1.4 Môi trường sống 1.2 Tình hình nuôi cá bớp giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình nuôi cá bớp giới 1.2.2 Tình hình nuôi cá bớp Việt Nam 1.3 Tình hình phát triển bệnh cá bớp 1.4 Bệnh đốm trắng nội tạng động vật thuỷ sản 1.4.1 Dấu hiệu bệnh lý 1.4.2 Một số loại bệnh có xuất đốm trắng nội tạng 1.4.3 Bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp 1.5 Tổng quan vi khuẩn Photobacterium damselae 10 1.5.1 Phân loại khoa học 10 1.5.2 Đặc điểm hình thái 10 1.5.3 Đặc điểm gây bệnh vi khuẩn Photobacterium damselae 11 2.1 Phân lập vi khuẩn 15 2.1.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 15 2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 15 2.1.3 Phương pháp giữ chủng giống vi khuẩn phân lập 15 2.2 Xác định đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn 16 iii 2.2.1 Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn 16 2.2.2 Xác định đặc tính sinh hoá vi khuẩn 17 2.2.2.1.Tiến hành kiểm tra kit API 20E 17 2.2.2.2.Các phản ứng bổ sung 18 2.2.3.Xác định thành phần protein màng chủng vi khuẩn 18 2.3.Xác định độc lực chủng vi khuẩn 20 2.3.1.Thí nghiệm cảm nhiễm 21 2.3.2.Thí nghiệm xác định giá trị LD50 22 2.4.Kiểm tra khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 22 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1.Kết phân lập vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp nuôi Khánh Hoà 24 3.2.Kết định danh chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 27 3.2.1.Kết xác định đặc điểm hình thái 27 3.2.2.Kết xác định đặc tính sinh hoá 28 2.3.3.Kết phân tích protein màng vi khuẩn 34 3.3.Kết xác định độc lực chủng vi khẩn phân lập đƣợc 35 3.3.1.Kết cảm nhiễm 35 3.3.2 Kết xác định giá trị LD50 chủng vi khuẩn Bt-X 38 3.4 Kết kiểm tra khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Kết thu mẫu cá bớp địa điểm nuôi Khánh Hoà 24 Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái chủng phân lập từ mẫu bệnh phẩm mang biểu bệnh đốm trắng nội tạng 26 Bảng 3.3: Kết đặc tính sinh hoá chủng phân lập đƣợc cá bớp nuôi Khánh Hoà chủng tham chiếu ATTC 17911 chủng ATCC NCIMB 2184T 30 Bảng 3.4: Kết kiểm tra khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 40 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cá bớp trƣởng thành Hình 1.2: Biểu bệnh lý cá bị đốm trắng nội tạng Hình 1.3: Hình thái vi khuẩn Photobacterium damselae dƣới kính hiển vi điện tử 10 Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 14 Hình 3.1: Mẫu cá bệnh thu điểm nuôi Khánh Hoà 25 Hình 3.2: Kết phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ gây bệnh đốm trắng nội tạng môi trƣờng TSA TCBS .27 Hình 3.3: Hình ảnh chủng Bt-X kính hiển vi quang học vật kính 40X 28 Hình 3.4: Hình ảnh định danh Kit API 20E 29 Hình 3.5: Một số phản ứng sinh hoá bổ sung chủng Bt-V .29 Hình 3.6: Kiểm tra kết định danh API 20E profile 32 Hình 3.7: Kết Blast trình tự hai chủng Bt-X Bt-V NCBI 33 Hình 3.8: Kết điện di protein màng chủng vi khuẩn phân lập đƣợc .34 Hình 3.9: Đồ thị thể tỉ lệ chết cộng dồn sau gây nhiễm chủng vi khuẩn nồng độ 105, 104 CFU/ cá 35 Hình 3.10: Biểu bệnh cá sau gây nhiễm 37 Hình 3.11: Kết kiểm tra tái phân lập vi khuẩn 37 Hình 3.12: Cá đƣợc giải phẫu kiểm tra thời điểm ngày sau cá chết nghiệm thức 38 Hìnhv 3.13: Đồ thị thể tỉ lệ cá chết qua 10 gây nhiễm chủng Bt-X nộng độ tiêm 102-105 CFU /cá 39 Hình 3.14: Tƣơng quan nồng độ vi khuẩn Bt-X tiêm vào cá tỉ lệ chết tích luỹ cá bớp thí nghiệm 39 Hình 3.15: Kháng sinh đồ chủng Bt-X 41 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Từ viết tắt CFU Colony Forming Unit FAO Fisheries Technical Paper h Giờ LD50 Lethal Dose, 50% NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density OF Oxydative-Fermentative 16S rRNA Gen 16S Ribosome RNA SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose TSA Tryptic Soya Agar TSB Tryptic Soya broth VP Voges-Proskauer MỞ ĐẦU Hiện ngành nuôi trồng thủy sản ngày có vai trò quan trọng, đem lại hiệu kinh tế cao Ngành thủy sản với phát triển nhanh tạo hàng loạt việc làm, nuôi trồng thủy sản chủ yếu quy mô hộ gia đình nên trở thành nguồn thu hút lực lƣợng lao động đông đảo tham gia vào tất công đoạn sản xuất, làm giảm sức ép nạn thiếu việc làm nƣớc Trong thời gian gần đây, cá bớp đƣợc nuôi phổ biến lồng bè vùng biển địa phƣơng nhƣ Hải Phòng, Quảng Ninh, Nghệ An Vũng Tàu Cá bớp loại cá biển nuôi có tốc độ tăng trƣởng nhanh, tính thích nghi cao, kháng bệnh tốt, tạo sản lƣợng lớn phục vụ thị trƣờng nƣớc xuất khẩu, nuôi quanh năm với kỹ thuật nuôi đơn giản, cá bớp thƣơng phẩm đƣợc nuôi phổ biến hình thức nuôi nhỏ lẻ nhƣ quy mô công nghiệp với sản lƣợng lớn để đáp ứng nhu cầu thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng Chúng có tốc độ sinh trƣởng nhanh, từ giống cỡ 20 -25g/con sau năm nuôi đạt - 5kg/con Ðây đối tƣợng có nhiều triển vọng nghề nuôi biển nƣớc ta Tuy nhiên nhiều nơi phát triển ạt, tự phát, thiếu quy hoạch, ngƣời nuôi chƣa có hiểu biết kỹ thuật nuôi chƣa nhận thức mức nguy ô nhiễm môi trƣờng dịch bệnh trình nuôi nên suất thấp, tổn thất điều không tránh khỏi, gây khó khăn đời sống kinh tế cho ngƣời nuôi Gần đây, nghề nuôi thâm canh đối tƣợng gặp trở ngại số hộ nuôi ngày nhiều, môi trƣờng ngày ô nhiễm, đồng thời tác động biến đổi khí hậu dẫn đến tình hình dịch bệnh diễn phức tạp, gây nhiều thiệt hại cho ngƣời nuôi Tác nhân gây bệnh chủ yếu ký sinh trùng, virus vi khuẩn chủ yếu vi khuẩn với nhiều bệnh gây thiệt hại nặng nề nhƣ bệnh mù mắt, lở loét, xuất huyết, đốm trắng nội tạng… Trong đó, bệnh đốm trắng nội tạng vi khuẩn Photobacterium damselae đƣợc nhiều tác giả mô tả nhƣ tác nhân nguy hiểm, gây tỉ lệ chết khoảng 80% cá bớp nuôi (Lopez cs, 2002; Liu cs, 2003; Rajan cs, 2003; Đỗ Thị Hoà cs, 2008) Do đó, đƣợc cho phép Viện Công nghệ sinh học Môi trƣờng, trƣờng Đại học Nha Trang; đƣợc định hƣớng TS Trần Vĩ Hích, thực đề tài tốt nghiệp với tiêu đề “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp Rachycentron canadum nuôi Khánh Hoà” với nội dung sau: Nội dung đề tài Phân lập số chủng vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp nuôi Khánh Hoà Xác định đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Xác định độc lực chủng phân lập đƣợc Xác định khả kháng kháng sinh chủng phân lập đƣợc Mục tiêu đề tài  Mục tiêu chung: Phân lập xác định đƣợc tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp nuôi Khánh Hòa  Mục tiêu cụ thể:  Phân lập đƣợc số chủng vi khuẩn từ mẫu cá bớp nuôi lồng nghi mắc bệnh đốm trắng nội tạng Khánh Hòa  Xác định đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập đƣợc nhƣ: phản ứng catalase, sinh H2S, sinh hơi, khả dung huyết, khả di động  Xác định khả gây bệnh chủng vi khuẩn phân lập đƣợc cá bớp  Xác định khả kháng kháng sinh số loại kháng sinh cho phép dùng nuôi trồng thuỷ sản chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Ý nghĩa đề tài  Ý nghĩa khoa học: Kết đề tài sở khoa học cho nghiên cứu dịch tễ học phƣơng pháp phòng, trị bệnh gây đốm trắng nội tạng vi khuẩn gây cá bớp  Ý nghĩa thực tiễn: Phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp sở cho việc nghiên cứu phát triển loại vaccine phòng bệnh qui mô công nghiệp CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá bớp Hình 1.1: Cá bớp trưởng thành Theo FAO (1974), cá bớp có hệ thống phân loại nhƣ sau: Ngành: Động vật có xƣơng sống (Chordata) Lớp: Cá (Pices) Bộ: Cá vƣợc (Perciformes) Họ: Cá bớp biển (Rachycentridae) Giống: Cá bớp (Rachycentron) Loài: Cá bớp biển (Rachycentron canadum) Tên thƣờng gọi: cá bớp hay cá giò Tên khoa học: Rachycentron canadum Tên tiếng Anh : Cobia/ Black king fish 1.1.1 Đặc điểm hình thái Cá bớp có thân hình thoi, dài, đầu thuôn, đỉnh đầu tƣơng đối phẳng Miệng rộng, hàm dƣới nhô dài hàm Răng nhung mọc thành đai hai hàm Mắt hai bên đầu, lồi, nhỏ, màng mở mắt chạy vòng quanh mắt Hai bên lƣờn phía lƣng có hai sọc trắng chạy dọc thân, phần lại có màu nâu đậm đen Phía bụng màu sáng bạc, vây lƣng gồm có hai vây: vây trƣớc có 6-9 vây ngắn, nhọn, không nối màng; 1-3 gai dài 26-33 tia mềm phía sau Vây hậu môn dài, có 2-3 gai 22-28 tia mềm 1.1.2 Phân bố Cá bớp sống vùng nƣớc mặn lợ ven biển, phân bố rộng toàn giới (Liao cs, 2004; Holt cs, 2007; Nguyen cs, 2008), tìm thấy vùng thềm lục địa, xung quanh rạn san hô vùng biển khơi thuộc khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới biển Đại Tây Dƣơng, Ấn Độ Dƣơng, Tây - Nam Thái Bình Dƣơng Cá thƣờng sống tầng tầng vùng nƣớc nên đƣợc gọi loài cá Vào tháng mùa thu mùa đông, chúng di cƣ xuống phía nam vùng nƣớc ấm khơi, có nhiệt độ nƣớc khoảng 20˚C - 30˚C, đến đầu mùa xuân chúng lại di cƣ ngƣợc lên phía Bắc dọc theo bờ Đại Tây Dƣơng 1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng, sinh dưỡng Cá bớp loài cá dữ, chủ động bắt mồi, vồ mồi nuốt chửng Thức ăn cá bớp trƣởng thành giáp xác, chân đầu loài cá nhỏ nhƣ: cá đối, cá trích, lƣơn, ƣu cua Khi nghiên cứu thành phần thức ăn dày cá bớp cho thấy 42% callinectes, 46% tôm (Micheal, 2001) Trong quần thể đàn cá thƣờng lớn nhanh cá đực, đạt - kg sau năm nuôi (Trần Ngọc Hải, 2012) Cá thành thục sau - tuổi, cỡ - 10 kg, cá thƣờng thành thục muộn cá đực Mùa sinh sản từ tháng - 9, cao điểm vào tháng - Vào mùa sinh sản cá tụ tập thành đàn, màu sắc sọc sáng dọc thân rõ hơn, nơi sinh sản vùng cửa sông, vũng, vịnh ven biển khơi Cá thƣờng đẻ vào lúc hoàng hôn đẻ 15 - 20 lần mùa sinh sản Sức sinh sản cá từ vài trăm nghìn đến hàng triệu trứng con, trứng cá thuộc dạng trôi nở tốt độ mặn 30 - 32‰ Trứng cá bớp hình cầu, đƣờng kính trung bình 1,4 mm, 24 – 36h sau thụ tinh nở nhiệt độ nƣớc từ 31˚C đến 22˚C Cá bột nở có chiều dài 2,5 mm, chƣa có sắc tố Năm ngày sau nở mắt miệng cá phát triển, lúc chúng bắt mồi Khi đạt 30 ngày tuổi hình dáng giống cá trƣởng thành 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thuý An, Trần Ngọc Hải Từ Thanh Dung (2013), “ Phân lập vi khuẩn Vibrio cá bớp ( Rachycentron canadum) bị lở loét”, Hội nghi khoa học trẻ ngành Thuỷ sản toàn quốc lần thứ IV, Hồ Chí Minh, 6-7/06/2016 Lê Thanh Cần (2015), “Một số đặc điểm bệnh học cá bớp (Rachycentron canadum Linaeus, 1766)”, Nông nghiệp, thuỷ sản & CNSH, 38(1), tr.53-60 Từ Thanh Dung (2004), “Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá Tra ( Pangaciusn hypophthalmus)”, Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142 Đồng Thanh Hà (2008), “Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh mủ gan, thận cá Tra (Pangaciusn hypophthalmus) nuôi Bến Tre”, Tạp chí thuỷ sản 2008 Trần Ngọc Hải, Đặng Khánh Hồng, Trần Nguyễn Duy Khoa, Lê Quốc Việt (2013), Ƣơng ấu trùng cá bớp (Ranchycentron canadum) với loại thức ăn khác Tạp chí Khoa Học, Trƣờng Đại học Cần Thơ số 25/2013: trang 43-49 Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Ngọc Du (2008), Bài giảng Tổng quan bệnh nguy hiểm thƣờng gặp động vật nuôi biển, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội (2004), Giáo trình Bệnh học thủy sản NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh Đỗ Thị Hòa, Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út Nguyễn Thị Nguyệt Huệ (2008), “Các loại bệnh thƣờng gặp cá biển nuôi Khánh Hòa”, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 02: 16-24 Đỗ Thị Hoà, Dƣơng Văn Quý Bình, Nguyễn Thị Thuỳ Giang (2011), “ Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng ( Trachinotus blochii) nuôi Nha Trang”, Tạp chí khoa học, Công nghệ thuỷ sản, 4/2012: 26=33 10 Trƣơng Thu Hƣơng (2015), “Phân lập xác định đặc tính sinh học chủng vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh tụ huyết trùng cá biển nuôi lồng Hải Phòng”, khóa luận tốt nghiệp, Viện đại học Mở Hà Nội 44 11 Lý Thị Thanh Loan (2007), “ Bƣớc đầu phát Clostridium sp cảm nhiễm cá Tra ( Pangasius hypophthalmus) nuôi ĐBSCL Việt Nam”, Trung tâm quốc gia quan trắc, cảnh báo môi trƣờng phòng ngừa dịch bệnh thuỷ sản khu vực Nam Bộ - Viện nghiên cứu NTTS II 12 Cao Lệ Quyên (2011), “Hiện trạng sản xuất nuôi trồng thủy sản tập trung toàn quốc” http://www.vifep.com.vn/NewsViewItem.aspx Cập nhật ngày 8/06/2013 13 Trần Linh Thƣớc (2007), “Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật nƣớc, thực phẩm mĩ phẫm”, nhà xuất giáo dục 14 La Quốc Triệu (2013), “ Khảo sát tình hình xuất số bệnh truyền nhiễm cá bớp Rachycentron canadum ( Linaeus, 1766) quần đảo Nam Du, huyện Kiên Hải, tỉnh Kiên Giang”, luận văn tốt nghiệp, khoa Thuỷ sản, trƣờng đại học Cần Thơ 15 Bùi Quang Tề (2009), Bệnh Học Thủy Sản, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I, Nhà xuất giáo dục Tài liệu tiếng anh Alvarez J.R., Lamba S., Dyer KY., Apuzzio J.J (2006), “An unusual case of urinary tract infection in a pregnant woman with Photobacterium damselae”, Infect Dis Obstet Gynecol 80682:1–3 Amable J.R., Manuel L.L and Carlos R.O (2013), “Photobacterium damselae subsp damselae, a bacterium pathogenic for marine animals and humans” Asato J., Kanaya F (2004), Fatal infection of the hand due to Photobacterium damsela: a case report”, Clin Infect Dis 38:e100–e101 Botella S., Pujalte M.J., Maciasn M.C., Hernandez J and Garay E (2002), “Amplified fragment length polymorphism (AFLP) and biochemical typing of Photobacterium damselae subsp Damselae”, Journal of Applied Microbiology, Volume 93, Issue 4, 681–688 Cheung W.L., Watson R and Pauly D (2013), “Signature of ocean warming in global fisheries catch”, Nature 497: 365-368 Clarridge J.L & Zighelboim D.S (1985), “Isolation and characterization of two hemolytic phenotypes of Vibrio damsel associated with a fatal wound infection”, Journal of Clinical Microbiology 21: 302-306 45 Cutter D.L., Kreger A.S (1990), “Cloning and expression of the damselysin gene from Vibrio damsel”, Infect, Immun; 58:266–268 Farto R., Armada, S.P., Montes M., Perez M.J & Nieto T.P (2006), “Presence of a lethal protease in the extracellular products of Vibrio splendidus-Vibrio lentus related strains” Journal of Fish Diseases 29: 701-707 Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y & Hase C.C (1992), “Vibrio cholera hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence, and detachment” Infection and Immunity 60: 472-478 10 Fouz B., Biosca, E.G and Amaro C (1997), “High affinity iron-uptake systems in Vibrio damsela: role in the acquisition of iron from transferrin”, Journal of Applied icrobiology 82, 157–167 11 Fouz B., Toranzo, A.E., Millan, M & Amaro, C (2000) “Evidence that water transmits the disease caused by the fish pathogen Photobacterium damselae subsp Damselae”, Journal of Applied Microbiology 88: 531-535 12 Hawke, J.P., Plakas, S.M., Minton, R.V., McPhearson, R.M., Snider, T.G & Guarino, A.M (1987), “Fish pasteurellosis of cultured striped bass (Morone saxatilis) in coastal Alabama”, Aquaculture: Volume 65, Issues 3–4, 15 September 1987, Pages 193–204 13 Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T and Williams S.T (1994), “Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, ninth Edition”, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland 21202, USA.605-649p 14 Ishihara M., Kawanishi A., Watanabe H., Tomochika K, Miyoshi S & Shinoda S (2002), “Purification of a serine protease of Vibrio parahaemolyticus and its characterization” Microbiology and Immunology 46: 298-303 15 Kim H.R., Kim J.W., Lee M.K., Kim J.G (2009), “Septicemia progressing to fatal hepatic dysfunction in a cirrhotic patient after oral ingestion of Photobacterium damsela: a case report”, Infection 37:555–556 16 Kubota K., Kageyama K., Maeyashiki I., Yamada K., Okumura S (1972), “Fermentative production of L-serine Production of L-serine from glycerin by Corynebacterium glycinophilum Now”, SP.J Gen Appl Microbiol, Pp 365-375 46 17 Labella A., Berbel C., Manchado M., Castro D and Borrego J.J (2011), “ Photobacterium damselae subsp Damselae, an emerging pathogen affecting new culture marine fish species in Southern Spain”, www.intechopen.com/download/pdf/24078, Archives of virology 142, 2345-2364 18 Leano E.M., Ku C.C and Liao I.C (2008), “Diseases of cultured cobia (Rachycentron canadum)”, The Seventh Symposium on Diseases in Asian Aquaculture, 22-26 June 2008, Taipei, Taiwan 19 Liao I.C., Huang T.S., Tsai W.S., Hsueh C.M and Chang S.L (2004), “Cobia culture in Taiwan: current status and problems”, Aquaculture 237:155–165 20 Liu P.C., Lin J.I and Lee K.K (2003), “Virulence of Photobacterium damsela Subsp Piscicida in Cultured cobia Rachycentron canadum”, In Basic Microbiol 42(6), 499-507 21 Lopez C., Rajan P.R, Lin J.H., Kuo T and Yang H (2002), “Disease outbreak in seafarmed cobia (Rachycentron canadum) associated with Vibrio spp., Photobacterium damselae ssp piscicida, monogenean and myxosporean parasites”, Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 22: 206–211 22 Love M, Teebken-Fisher D, Hose JE, Hickman FW, Fanning GR (1981), “Vibrio damselae, a Marine Bacterium, Causes Skin Ulcers on the Damselfish Chromis punctipinnis”, Science; 214(4525):1139-40 23 Miyoshi S., Sonoda Y., Wakiyama H., Rahman M.M., Tomochika K., Shinoda S., Yamamoto S & Tobe K (2002), “An exocellular thermolysin-like metalloprotease produced by Vibrio fluvialis: purification, characterization, and gene cloning” Microbial Pathogenesis 33: 127-134 24 Morris J.G., Jr., et al (1982), “Illness caused by Vibrio damsela and Vibrio hollisae”, Lancet i: 1294–1297 25 Norqvist A., Norrman B & Wolf-Watz H (1990), “Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio anguillarum” Infection and Immunity 58: 3731-3736 26 Osorio C.R., Romalde J.L., Barja J.L., Toranzo A.E (2000), “Presence of phospholipase D (dly) gene coding for damselysin production is not a pre-requisite 47 for pathogenicity in Photobacterium damselae subsp Damselae”, Microb, Pathog, 28:119–126 27 Pasqualina L., Gabriella C., Eleonora M., Renata Z., Santi D (2011), “Susceptibility to antibiotics of Vibrio spp and Photobacterium damsela ssp Piscicida strains isolated from Italian aquaculture farms”, The new microbiologica 34, 1/2011, 53-63 28 Perez-Tirse J, Levine J.F., Mecca M (1993), “Vibrio damsela A cause of fulminant septicemia”, Arch Intern Med, 153(15):1838-40 29 Rajan P.R., Lin J.H.Y., Ho M.S and Yang H.L., (2003), “Simple and rapid detection of Photobacterium damselae ssp piscicida by a PCR technique and plating method”, Journal of Applied Microbiology 2003, 95: 1375-1380 30 Resley M.J., Webb K.A & Holt G.J (2006), “Growth and survival of juvenile cobia Rachycentron canadum cultured at different salinities in recirculating aquaculture systems”, Aquaculture, 253:398-407 31 Richards C.E (1967), “Age, growth and fecundity of the cobia, Rachycentron canadum, from Chesapeake Bay and adjacent mid-Atlantic waters”, Trans, Amer, Fish, Soc 96: 343-350 32 Rivas A.J., Lemos M.L and Osorio C.R (2013), “Photobacterium damselae subsp damselae, a bacterium pathogenic for marine animals and humans”, Mini review article, 4: 1-6 33 Robohm R.A (1983), “Pasteurella piscicida In: Anderson DP, Dorsonand M, Dubourget P Antigens of fish pathogens”, Collection Foundation Marcel Merieux, Lyon, France, pp 161–175 34 Silva A.J., Pham, K & Benitez, J.A (2003), “Haemagglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholera”, Microbiology 149: 1883-1891 35 Thyssen A.S., Van Eygen L., Hauben J., Gori J., Swings and Ollevier F (2000), “Application of AFLP for taxonomic and epidemiological studies of photobacterium damselae subsp Piscicida”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, 1013–1019 48 36 Toranzo A.E & Barja, J.L (1993), “Virulence factors of bacteria pathogenic for coldwater fish” Annual Review of Fish Diseases 3: 5-36 37 Yamame K., et al (2004), “Two cases of fatal necrotizing fasciitis caused by Photobacterium damsela in Japan”, Microbiol, 42:1370–1372 38 Vaught Shaffer R and Nakamura E.L (1989), “Synopsis of biological data on the cobia Rachycentron canadum”, NOAA Technical Report NMFS 82, FAO Fisheries Synopsis 153: 1-21 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đọc kết kit API 20E STT Test Kết Âm tính Dƣơng tính ONPG Không màu Màu Vàng ADH Vàng Đỏ/ cam LDC Vàng Đỏ/ cam ODC Vàng Đỏ/ cam CIT Xanh nhạt/ vàng Xanh dƣơng-xanh lá/ xanh dƣơng H2 S Không màu/ xám Đen/ đƣờng mảnh URE Vàng Đỏ/ cam TDA Thêm giọt thuốc thử TDA Vàng 10 IND 12 Thêm giọt thuốc thử JAMES Không màu/ xanh nhạt/ vàng 11 VP 13 Nâu đỏ Hồng Thêm giọt thuốc thử VP1 VP2, chờ khoảng 10 phút Không màu Hồng/ đỏ 14 GEL Không khuếch tán Khuếch tán sắc tố đen 15 GLU Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng/ vàng xám 16 MAN Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng 17 INO Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng 18 SOR Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng 19 RHA Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng 20 SAC Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng 21 MEL Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng 22 AMY Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng 23 ARA Xanh dƣơng/ xanh dƣơng-xanh Vàng 24 OX Xem kết phản ứng oxidase 25 Mob Xem Kết phản ứng kiểm tra tính di động 26 NO2 Thêm giọt thuốc thử NIT1 NIT2 vào ống GLU, chờ 2-5 phút Vàng 27 N2 Đỏ Nếu NO2 âm tính ( màu Vàng), tiếp tục cho thêm 2-3mg Zn vào ống GLU, chờ phút Cam đỏ Vàng Phụ lục 2: kết định danh chủng Photobacterium damselae phân lập từ cá bớp phƣơng pháp giải trình tự gen 16S 1.1.Kết giải trình tự gen 16S chủng vi khuẩn Bt-X 1.2.Kết giải trình tự gen 16S chủng Bt-V Phụ lục 3: Thành phần môi trƣờng hoá chất thí nghiệm số hóa chất Glycerol 40% Glycerol 4ml Nƣớc cất 6ml Dung dịch cồn aceton Cồn 90˚ 100ml Aceton 25µl 2.Thành phần gel điện di Thành phần Gel gom 5% (Stacking gel) Gel phân tách 15% (Resolving gel) Nƣớc cất 6,2ml 3,6ml Monomer solution 40% 1,3ml 3,8ml 4X Resolving gel buffer (pH 8.8) - 2,5ml 4X Stacking gel buffer (pH 6.8) 2,5ml - SDS 10% 0,1ml 0,1ml APS 10% 50l 100l TEDMED 10l 10l Hoá chất điện di Monomere solution 40% Acrylamide (FW 71,08) 10g Bis-acrylamide (FW 145,2) 0,2g Nƣớc cất 25ml 4X Resolving gel buffer (0,5 Tris HCl, pH 8,8) Tris base (FW 121,1) 1,815g Nƣớc cất 7,5ml Chỉnh pH 8,8 với HCL đậm đặc Thêm nƣớc cất đến 10ml 4X Stacking gel buffer (0,5 Tris HCl, pH 6,8) Tris base (FW 121,1) 1,5g Nƣớc cất 20ml Chỉnh pH 6,8 với HCl đậm đặc Nƣớc cất 25ml SDS 10% SDS 2,5g Nƣớc cất 25ml 2X Treatment buffer 4X stacking gel buffer 2,5ml SDS 10% 4ml Glycerol 2ml Dithiothreitol (FW 154,2) 0,31g Bromophenol Blue 0,002g Nƣớc cất đến 10ml Tank buffer (0, 025M Tris HCl; 0, 192M glycine; 0,1% SDS; pH 8,3 Tris (FW 121,1) 3,028g Glycine 14,413g SDS 1g Nƣớc cất đến 1l Staining solution (dung dịch nhuộm gel) Coomassie Brilliant Blue G-250 0,025g Methanol 40ml Acid acetic 10ml Nƣớc cất đến 100ml Destaining solution (dung dịch rửa nhuộm) Methanol 400ml Acide acetic 70ml Nƣớc cất đến 1l Hoá chất Bradford Coomassive Brilliant Blue G-250 100mg Ethanol 96˚ 50ml H3PO4 85% 100ml Nƣớc cất đến 1l ... lập xác định đƣợc tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp nuôi Khánh Hòa  Mục tiêu cụ thể:  Phân lập đƣợc số chủng vi khuẩn từ mẫu cá bớp nuôi lồng nghi mắc bệnh đốm trắng nội tạng. .. phòng, trị bệnh gây đốm trắng nội tạng vi khuẩn gây cá bớp  Ý nghĩa thực tiễn: Phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp sở cho vi c nghiên cứu phát triển loại vaccine phòng bệnh. .. đƣợc định hƣớng TS Trần Vĩ Hích, thực đề tài tốt nghiệp với tiêu đề Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá bớp Rachycentron canadum nuôi Khánh Hoà” với nội dung sau: Nội dung