Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN Cần Thơ, 2015 Công trình hoàn thành tại: Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGs.TS Đặng Thị Hoàng Oanh Phản biện 1:………………………………………………………… Phản biện 2:………………………………………………………… Phản biện 3:………………………………………………………… Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại……………………………………………………………… Vào …… giờ………, ngày………tháng…… năm……………… Có thể tìm luận án tại: Trung tâm học liệu Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần Thơ, 2015 Chương TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN 1.1 Giới thiệu Cá bống kèo (Pseudapocryptes elongates) loài thủy đặc sản có giá trị kinh tế cao, tiêu thụ rộng rãi nước có giá trị xuất Cá bống kèo nuôi tập trung tỉnh vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long, nhiên thời gian gần cá bống kèo nuôi thương phẩm bị bệnh với dấu hiệu bệnh lý xuất huyết thân, vi hậu môn với tỉ lệ chết cao chết diện rộng Tác nhân gây xuất huyết mô tả nhiều vi khuẩn Điển Streptococcus agalactiae tác nhân gây bệnh xuất huyết cá rô phi (Oreochromis sp.) (Phạm Hồng Quân ctv., 2013), cá điêu hồng (Oreochromis sp.) (Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương, 2012) Vi khuẩn S iniae tác nhân gây bệnh xuất huyết cá chẽm (Latex calcarifer) (Trần Vĩ Hích Nguyễn Hữu Dũng, 2011), cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus), cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999) Ngoài ra, bệnh xuất huyết cá vi khuẩn S dysgalactiae cá đối (Liza alata, Liza haemotocheila) (Qi et al., 2013), cá tầm (Acipencer schrenckii) (Yang Li, 2009), cá nâu (Mugil cephalus) cá bớp (Rachycentron canadum) (Abdelsalam et al., 2009) Tác nhân gây bệnh xuất huyết cá tìm thấy nhiều loài vi khuẩn khác Aeromonas hydrophila gây bệnh cá tra (Loan ctv., 2009), Vibrio parahaemolyticus V alginolyticus gây bệnh cá mú giống cá mú thịt, (Somkiat Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh Thùy ctv., 2009 trích dẫn Võ Văn Nha, 2012) Do tác nhân gây bệnh đa dạng, nên việc phòng trị bệnh xuất huyết động vật thủy sản có hiệu tác nhân nguyên nhân gây bệnh xác định xác Hiện nay, chưa có nghiên cứu thức bệnh xuất huyết cá bống kèo, nhằm cung cấp thông tin khuyến cáo người nuôi phòng, trị bệnh cách hiệu quả, đề tài “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus)” thực 1.2 Mục tiêu tổng quát luận án Khảo sát đánh giá tình hình xuất bệnh xuất huyết cá bống kèo nuôi tỉnh Bạc Liêu Xác định đặc điểm bệnh học tác nhân gây bệnh cá bống kèo từ đề xuất giải pháp phòng trị bệnh hiệu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Thông tin từ kết khảo sát trạng bệnh cá bống kèo qui trình phòng trị bệnh góp phần hạn chế thiệt hại trình nuôi cá bống kèo mang lại hiệu suất kinh tế, tăng thu nhập cho người nuôi 1.4 Những điểm luận án Xác định tác nhân gây bệnh xuất huyết cá bống kèo vi khuẩn S dysagalactiae thời điểm bệnh thường xuất cá bống kèo nuôi ao Thực chuẩn hóa qui trình phát vi khuẩn S dysgalactiae để ứng dụng chẩn đoán sớm, nhanh đặc hiệu tác nhân gây bệnh xuất huyết cá bống kèo phương pháp PCR Đề xuất số loại kháng sinh điều trị bệnh xuất huyết cá bống kèo Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong phần tổng quan tài liệu, luận án nêu phân tích vấn đề liên quan đến tình hình nuôi cá bống kèo tình hình nghiên cứu số loại vi khuẩn gây bệnh cá với nội dung chính: - Tình hình nuôi cá bống kèo giới nước - Tình hình xuất bệnh cá bống kèo - Tổng quan bệnh xuất huyết cá - Tổng quan đặc điểm vi khuẩn gây bệnh cá - Tổng quan tình hình vi khuẩn Streptococcus gây bệnh cá nước lợ, mặn - Xác định độc lực số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết - Chẩn đoán bệnh xuất huyết - Phòng trị bệnh xuất huyết cá Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2011 đến tháng 12/2014 3.2 Đối tượng nghiên cứu: Cá bống kèo 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Điều tra vấn 3.3.1.1 Số liệu thứ cấp Thu thập từ báo cáo quan chức tỉnh Bạc Liêu Số liệu thứ cấp gồm: Tình hình nuôi trồng thủy sản tình hình nuôi thương phẩm cá bống kèo tỉnh Bạc Liêu 3.3.1.2 Số liệu sơ cấp Tiến hành điều tra 90 hộ nuôi cá bống kèo thương phẩm thành phố Bạc Liêu, huyện Hòa Bình huyện Đông Hải tỉnh Bạc Liêu Số liệu sơ cấp gồm: Thông tin bản, kinh nghiệm, kỹ thuật nuôi, thông tin bệnh cá nuôi cách phòng trị cá bống kèo bệnh người nuôi 3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá - Mẫu cá: thu 254 cá bống kèo sống 34 ao nuôi (11 ao cá khỏe, 23 ao cá có biểu cá bị xuất huyết) - Điều kiện thu mẫu: thu mẫu ao cá bống kèo nuôi thương phẩm giai đoạn cá nuôi - tháng tuổi, cá đạt từ 15 – 25 g/con Thời gian thu mẫu - sáng 3.3.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng Số lượng mẫu kiểm tra ký sinh trùng 120 mẫu cá 12 ao gồm 04 đợt thu mẫu, đợt 03 ao, ao 10 Kiểm tra da, mang ruột cá Mức độ cảm nhiễm ký sinh trùng tính: Tỷ lệ cảm nhiễm = (Số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu kiểm tra) x 100 Cường độ cảm nhiễm = (Số trùng/Con cá, quan, lame, thị trường) 3.3.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn 3.3.4.1 Phương pháp nhuộm Giemsa Phết mẫu thận lên lame Mẫu cố định qua dung dịch Methanol phút Phương pháp nhuộm mẫu theo Humason, 1979 trích dẫn Rowley, 1990 Đọc kết kính hiển vi vật kính 100X có giọt dầu 3.3.4.2 Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn - Dùng dao mổ tiệt trùng rạch đường thận Đặt que cấy vào, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm cấy đĩa agar Ủ đĩa môi trường tủ ấm nhiệt độ 28°C Sau 24 – 48 giờ, đọc kết - Kiểm tra tính ròng vi khuẩn, phản ứng oxidase, catalase, O/F, khả phát triển vi khuẩn môi trường TSB (+ 6,5%NaCl), khả tan huyết vi khuẩn d Phương pháp định danh vi khuẩn kit API 20 Strep (Biomérieux, Pháp) Định danh ngẫu nhiên 32 chủng vi khuẩn sưu tập vi khuẩn thu qua 06 lần thu mẫu kit API 20 Strep 3.3.5 Định danh vi khuẩn phương pháp giải trình tự 3.3.5.1 Phương pháp chiết tách DNA vi khuẩn Qui trình chiết tách DNA từ vi khuẩn áp dụng theo phương pháp Bartie et al (2006) Vi khuẩn nuôi tăng sinh từ 16 - 18 ml môi trường NB (+ 1,5% NaCl) nhiệt độ 28ºC, ly trích DNA cách cho 1,5 ml dung dịch vi khuẩn vào ống ly tâm với 100 µl 10 mM TrisHCL, mM EDTA, pH 8.0 (TE) Hỗn hợp đun nóng 95ºC 15 phút, làm lạnh nước đá ly tâm phút vận tốc 14.000 vòng/phút để tách dung dịch DNA trữ -20ºC sử dụng 3.3.5.2 Phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA vi khuẩn 10 mẫu vi khuẩn chọn từ kết phân lập định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA gồm: B1-6T; B2-5G; B2-3TT; B6-9TT; A1F1; A1F2; A1F4; A1F6; A1F9; A5F4 Sản phẩm PCR mẫu gởi đến phòng thí nghiệm NK-Biotek đơn vị R&D công ty Nam Khoa giải trình tự gen 16S rRNA Sản phẩm giải trình tự chạy điện di giải trình tự máy giải trình tự ABI 3130XL 16 capillar Kết giải trình tự đoạn gen 16S so chuỗi chương trình Blast search sở liệu ngân hàng gen NCBI 3.3.6 Phương pháp mô bệnh học Số lượng mẫu phân tích mô học gồm 127 mẫu cá Lấy mẫu mô mang, gan, thận cá bệnh cá khỏe Mẫu cắt với độ dày từ – mm, sau xử lý máy xử lý tự động qua giai đoạn loại nước, làm mẫu tẩm paraffin Đúc khối cắt mẫu với độ dày 4-6 μm, nhuộm mẫu dung dịch Haematocyline Eosin (H&E) Tiêu quan sát kính hiển vi, đọc kết dựa theo tài liệu Ferguson (2006) (trích dẫn Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011) 3.3.7 Phương pháp huyết học 3.3.7.1 Phương pháp phân tích mẫu máu cá Số lượng mẫu phân tích huyết học gồm 102 mẫu cá Máu lấy động mạch chủ đuôi cá (Houston, 1990) Phết mẫu máu Mẫu máu sau cố định cách ngâm methanol 1-2 phút (Rowley, 1990) 3.3.7.2 Định lượng hồng cầu Hồng cầu đếm qua buồng đếm hồng cầu vật kính 40X Công thức tính mật độ hồng cầu: R = C x 10 x x 200 Trong đó: R: mật độ hồng cầu (tb/mm3); C: tổng số hồng cầu vùng đếm; 10: khoảng cách lamelle buồng đếm 0,1mm; 5: diện tích vùng đếm 0,2 mm2; 200: độ pha loãng hồng cầu 3.3.7.3 Định tính định lượng bạch cầu Phương pháp nhuộm mẫu: mẫu nhuộm theo phương pháp Wright’s & Giemsa (Humason, 1997 trích dẫn Rowley, 1990) Quan sát kính hiển vi vật kính 100X (Supranee et al., 1991) Tổng bạch cầu (TBC)= (Bạch cầu 1500 tế bào x mật độ hồng cầu buồng đếm)/ Số hồng cầu 1500 tế bào mẫu nhuộm Mật độ loại (tb/mm3) = Số lượng loại bạch cầu x mật độ TBC/200 3.3.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết 3.3.8.1 Phương pháp chiết tách DNA từ vi khuẩn: (giống 3.3.5.1) 3.2.8.2 Phương pháp chiết tách DNA từ mô thận cá Dựa phương pháp chiết tách Phenol chloroform Taggart et al (1992) (được điều chỉnh Đặng Thị Hoàng Oanh Đặng Thụy Mai Thy, 2009) để chiết tách DNA thận cá 3.3.8.3 Phương pháp khuếch đại DNA Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA thực dựa theo qui trình Nunan et al (2003) Trọng lượng phân tử đoạn DNA S dysgalactiae cần phát 1500 bp Cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA thiết kế Zinniel et al., (2002) mồi 1: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’, mồi 2: p13B 5’AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’ 3.3.8.4 Phương pháp PCR phát vi khuẩn S dysgalactiae Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 cho phản ứng PCR theo Hassan et al (2003): STRD-DyI: “5′ TGGAACACGTTAGGGTCG 3′” dys-16S–23S-2: “5′ CTTAACTAGAAAAACTCTTGATTATTC 3′” Thực qui trình PCR phát vi khuẩn S dysgalactiae dựa phương pháp Hassan et al (2003), đối chứng dương sử dụng phản ứng PCR phát vi khuẩn S dysgalactiae vi khuẩn giải mã định danh phương pháp giải trình tự gen 16S có ký hiệu B2-5G 3.3.8.5 Phương pháp điện di Sử dụng 10 l sản phẩm PCR chạy điện di gel 1.5% agarose (ABgene, UK) dung dịch đệm  TAE (10 mM Tris, mM acetate, 0,1 mM EDTA) 3.3.8.6 Phương pháp xác định độ nhạy phản ứng PCR phát S dysgalactiae Lấy 0,5 g mô thận cá trộn với mật độ vi khuẩn 25 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, 400 ng, 800 ng, 1.600 ng 3.200 ng dùng cho phản ứng PCR phát S dysgalactiae để xác định độ nhạy qui trình 3.3.8.7 Phương pháp xác định tính đặc hiệu qui trình PCR phát S dysgalactiae Dùng cặp mồi phản ứng PCR phát S dysgalactiae để phát loại vi khuẩn khác bao gồm: Vibrio parahaemolyticus, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophilla, Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare Đối chứng dương sử dụng S dysgalactiae giải mã định danh phương pháp giải trình tự gen 16S có ký hiệu B2-5G 3.3.8.8 Khả ứng dụng qui trình PCR phát vi khuẩn S dysgalactiae Khả ứng dụng qui trình nhiều dòng vi khuẩn S dysgalactiae khác trực tiếp thận cá 3.3.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ Phương pháp lập kháng sinh đồ theo Geert Huy, 2002 3.3.9.1 Phương pháp phục hồi vi khuẩn Vi khuẩn trữ -80oC phục hồi môi trường TSA có bổ sung 1,5% NaCl ủ sau 48 30oC 3.3.9.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ Dùng pipet hút 0,1 ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch MHA (+ 1,5% NaCl) trãi đều, dùng pen lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri Mỗi đĩa petri dán đĩa kháng sinh Đặt đĩa vào tủ ấm 30oC Đọc kết sau 48 3.3.9.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh lên vi khuẩn xác định theo phương pháp Geert Huys (2002) 3.3.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.3.10.1 Chuẩn bị bể thí nghiệm Các dụng cụ thí nghiệm như: bể nhựa 500 L, xô nhựa 60 L, ống sục khí, vợt, đá bọt vệ sinh kỹ xà phòng chlorine 200 ppm, phơi khô Sau cấp nước vào khoảng 2/3 bể, có sục khí Cấp nước vào 1/3 xô nhựa thí nghiệm Nguồn nước sử dụng nước máy có độ mặn 10‰ 3.3.10.2 Nguồn cá thí nghiệm Cá bống kèo đồng cỡ, khỏe mạnh, linh hoạt, da sáng, trọng lượng khoảng 15 - 20 g/con Cá nuôi dưỡng bể nhựa 500 L, có sục khí khoảng tuần Kiểm tra sức khỏe cá (chọn ngẫu nhiên con) trước tiến hành bố trí thí nghiệm 3.3.10.3 Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm Vi khuẩn trữ phục hồi môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl (TSA+), ủ 28oC Nuôi tăng sinh vi khuẩn, sau đó, vi khuẩn ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút 4oC phút Đếm mật độ vi khuẩn máy so màu quang phổ bước sóng 610 nm Dung dịch vi khuẩn pha loãng 10 lần (1ml dung dịch vi khuẩn x 109 CFU/ml + ml nước muối sinh lý) để mật độ 108, 107, 106, 105, 104, 103 CFU/ml 3.3.10.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm cảm nhiễm Thí nghiệm cảm nhiễm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nghiệm thức chủng vi khuẩn B1-6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT với mật độ tiêm 108 CFU/cá tiêm nước muối sinh lý nghiệm thức đối chứng Cá tiêm 0,1 ml/cá gốc vi ngực Mỗi nghiệm thức lặp lại lần với mật độ 10 cá/bể Sau tiêm, biểu cá theo dõi liên tục Dấu hiệu bệnh lý biểu bên cá bệnh xuất huyết màu sắc nhợt nhạt, xuất huyết thân, vi ngực, vi bụng, vi lưng, vi hậu môn, khối u bề mặt thể, mắt lồi, mờ đục phù (Hình 4.7) Hình 4.7 Dấu hiệu bệnh lý bên cá bống kèo bệnh xuất huyết (A) cá bống kèo tấp mé (B) (C): Cá bống kèo bị xuất huyết vây toàn thân Dấu hiệu bệnh lý bên ghi nhận xoang bụng cá chứa đầy dịch nhờn, gan bị xuất huyết tái nhạt, tỳ tạng bị sưng to teo nhỏ xuất huyết, thận xuất huyết bị nhũn (Hình 4.8) Hình 4.8: Dấu hiệu bệnh lý bên cá bống kèo bệnh xuất huyết (A) Cá bống kèo khỏe (B) Tỳ tạng sưng to xuất huyết (C) Gan cá sưng to xuất huyết (D) Gan cá xuất huyết, tỳ tạng sưng to, thận bị nhũn 4.2.1.2 Kết quan sát tiêu mẫu tươi thận phết kính Kết quan sát cho thấy vi khuẩn công phá vỡ màng tế bào hồng cầu, tập trung chung quanh vách tế bào hồng cầu (Hình 4.9) Hình 4.9 Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X) (A): Mẫu thận cá khỏe (B): Vi khuẩn phá tế bào, tập trung thành cụm; (C): Mẫu đại thực bào (D): Vi khuẩn bao quanh phá vỡ màng tế bào hồng cầu Trên mẫu cá khỏe có vi khuẩn tiến hành quan sát mẫu thận phết kính 4.2.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết cá bống kèo 4.2.2.1 Biến đổi cấu trúc mô học mang Kết quan sát cho thấy có 127/127 mẫu mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết có tượng phình to tơ mang dính lại sợi mang Tơ mang phình to bị xuất huyết, sợi mang bị dính lại cấu trúc phiến mang, sợi mang ngắn lại thoái hóa, động mạch vào mang bị xuất huyết có tượng bị nhiễm khuẩn (Hình 4.10) 13 Hình 4.10 Mô mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) (A) Mang cá bống kèo khỏe: tơ mang (), sợi mang (); (B) Sợi mang phình to, có tượng tăng sinh biểu mô (), động mạch vào sợi mang bị nhiễm khuẩn (); (C) Sợi mang dính lại cấu trúc phiến mang (), tế bào biểu mô tăng kích thước () (D) Mang bị cấu trúc 4.2.2.2 Biến đổi cấu trúc mô học thận Quan sát mô thận cá bệnh cho thấy chủ yếu tượng xuất huyết, sung huyết mao mạch tĩnh mạch, ống thận xơ hóa lòng ống giãn nở, quản cầu thận phình to kèm theo biến đổi cấu trúc, hoại tử Hiện tượng sung huyết mô thận cá ghi nhận hầu hết mẫu cá bị bệnh, tượng xuất huyết hoại tử hạt hay hoại tử hóa lỏng tìm thấy mẫu mô thận cá bệnh (Hình 4.11) Hình 4.11 Mô thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) (A): Thận cá bống kèo khỏe, ống thận (↓); (B) Mô thận bị xuất huyết (↓), trung tâm đại thực bào sắc tố (↓); (C): Mô thận bị hoại tử (↓), biến đổi cấu trúc; (D): Mô thận bị nhiễm khuẩn (↓); (E): Quản cầu thận phình to biến đổi cấu trúc (↓) (100X); (F): Mô thận có tượng sung huyết (↓), Quản cầu thận phình to biến đổi cấu trúc (↓) 4.2.2.3 Biến đổi cấu trúc mô học gan Kết quan sát mẫu mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết cho thấy gan có tượng bị nhiễm khuẩn (Hình 4.12E), tĩnh mạch gan bị sung huyết (Hình 4.12C), không bào lipid phình to, không đồng tạo nên vùng mô gan bị biến đổi cấu trúc (Hình 4.12E & F) Gan hoại tử gần hóa lỏng, vùng sung huyết tế bào máu phân hủy thành dịch viêm, tế bào chất trở nên đồng bắt màu Eosin (Hình 4.12B & D) 14 Hình 4.12 Mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E) (40X) (A): Gan cá khỏe, tĩnh mạch gan (↓), không bào lipid (↓); (B) Dịch viêm tế bào (↓); (C): Tĩnh mạch gan bị sung huyết (↓); (D): Vùng tế bào gan bị sung huyết (↓); (E): Gan bị nhiễm khuẩn (↓), không bào lipid phình to (↓), biến đổi cấu trúc tế bào gan (↓); (F): Vùng mô gan bị biến đổi cấu trúc (↓) 4.2.3 Đặc điểm huyết học cá bống kèo bệnh 4.2.3.1 Hình thái tế bào Quan sát máu cá bống kèo cho thấy tế bào hồng cầu có dạng hình oval hay elip nhân hình tròn Bốn loại bạch cầu tìm thấy gồm tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tiểu cầu Hình 4.13 Hình dạng tế bào máu cá bống kèo (100X) (A): Hồng cầu (↓), (B): Tiểu cầu (↓); (C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tiểu cầu (↓), Bạch cầu trung tính (↓), Tế bào Lympho (↓), (D): Bạch cầu đơn nhân (↓) Kết quan sát tế bào máu mẫu phết kính cá bống kèo bị bệnh xuất huyết cho thấy xuất nhiều cụm vi khuẩn máu cá tế bào máu bị biến đổi hình dạng (Hình 4.14) Vi khuẩn công làm màng tế bào hồng cầu bị phá vỡ, bên tế bào chất có nhiều khoảng không bào hay không tế bào chất Bên cạnh loại tế bào bạch cầu thay đổi hình dạng, cá bệnh tìm thấy bốn loại tế bào bạch cầu 15 Hình 4.14 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X) (A): Vi khuẩn hình cầu công màng tế bào hồng cầu (↓); (B): vi khuẩn công màng tế bào (↓) tạo khoảng không bào tế bào chất (↓) 4.2.3.2 Huyết học Số lượng hồng cầu máu cá dao động từ 6,8 x 106 CFU/ml đến 28,6 x 106 CFU/ml, có khác biệt số lượng hồng cầu cá bống kèo khỏe cá bệnh xuất huyết, mẫu cá bệnh số lượng hồng cầu giảm so với cá khỏe, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P[...]... 4.2 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo 4.2.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá 4.2.1.1 Dấu hiệu bệnh lý Cá bị xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý bất thường như bơi lờ đờ, tấp mé, bỏ ăn, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động 12 Dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngoài của cá bệnh xuất huyết như màu sắc nhợt nhạt, xuất huyết trên thân, ở vi ngực, vi bụng,... số bệnh xuất hiện trên cá bống kèo nuôi thương phẩm là bệnh xuất huyết (chiếm 78,89%), bệnh lở loét (50%), bệnh chướng bụng (50%), bệnh gan (25,56%) Amoxicillin là loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong các ao nuôi cá bống kèo - Vi khuẩn gây ra bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm là vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae với đặc điểm bệnh lý là cá bị xuất huyết trên thân và các vi; ... bụng, vi lưng, vi hậu môn, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi, mờ đục và phù ra (Hình 4.7) Hình 4.7 Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bống kèo bệnh xuất huyết (A) cá bống kèo tấp mé (B) (C): Cá bống kèo bị xuất huyết trên các vây và toàn thân Dấu hiệu bệnh lý bên trong được ghi nhận là xoang bụng cá chứa đầy dịch nhờn, gan bị xuất huyết hoặc tái nhạt, tỳ tạng bị sưng to hoặc teo nhỏ và xuất huyết, ... quả của vi c sử dụng thuốc kháng sinh trong vi c điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo trong điều kiện phòng thí nghiệm Với kết quả thử nghiệm thành công trong thí nghiệm đã xác định được DO và FFC điều trị thành công bệnh xuất huyết trên cá bống kèo trong điều kiện phòng thí nghiệm Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Thời gian cá bống kèo xuất hiện bệnh tập trung ở giai đoạn cá đạt 2... lại có chiều hướng biến động tăng so với cá khỏe - Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đã phát hiện chính xác 100% vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo thương phẩm - Kết quả LD50 của 2 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G với giá trị lần lượt là 4,25 x 104 CFU/ml và 3,5 x 103,17 CFU/ml - Vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo nhạy với các loại kháng sinh như FFC, DO và kháng... lại Ao cá bình thường b Bạch cầu đơn nhân Kết quả định lượng cho thấy, bạch cầu đơn nhân trong các ao nuôi cá bống kèo dao động từ 10.800 – 211.500 tế bào/ml Số lượng bạch cầu đơn nhân ở các ao nuôi có dấu hiệu bệnh cao hơn so với ao nuôi cá khỏe và có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P