Ứng dụng của enzyme protease

Ứng dụng của enzyme protease

ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE

GVHD: TS Nguyễn Thị Thu Huyền

THÀNH VIÊN :

Nguyễn Triết Lãm MSSV : 61003212 Cao Đình Đương MSSV : 60903126 Văn Đường Phương Trang MSSV : 60903174 Nguyễn Thị Minh Thu MSSV: 60903170

II Ứng dụng trong thực phẩm

III Ứng dụng trong y học

Chương I: Tổng quan về enzyme protease

I Giới thiệu

Khái niệm Enzyme protease là gì?

Định nghĩa enzyme protease

Protease là enzyme thuộc nhóm

hydrolase, xúc tác cho quá trình

thủy phân liên kết peptid (-CO –

NH-) của phân tử protein và

peptid thành các acid amin tự

do, một ít peptid ngắn, pepton

Lịch sử

phát hiện

Lịch sử thu nhận từ những nguồn nào?

Nguồn động vật

TK XVIII, nhà KHTN Pháp là Reaunur đã làm TN rất đơn giản

và đã phát hiện dịch

dạ dày của chim ăn thịt tiêu hóa được thịt

Năm 1857, Corvisart tách trypsine từ dịch tụy

là protease đầu tiên thu nhận được dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein

Năm 1862, Danilevxki dùng PP hấp phụ trên colondion tách được trypsine với amylase tụy tạng Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme và protein

Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin).

Nguồn thực vật

Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt của một loại đậu

Năm 1879, Wurtz nêu lên rằng các phần

khác nhau của cây đu

đủ có chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận được một chế phẩm

enzyme không tinh khiết (100g/1 cây) gọi

là papain

Nguồn vi sinh vật

Năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn

Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950

Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp

thích hợp để nhận chế phẩm không tan của protesae

Nguồn thu

nhận

Enzyme protease thu nhận từ những nguồn nào?

Renin chỉ có ở ngăn thứ tư ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là

enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage

Từ thực vật

Papain có trong mủ cây đu đủ, quả

đu đủ còn xanh

Bromelin có trong thân cây thơm

xanh và quả thơm xanh Ficin có trong mủ cây sung, quả

sung, quả vả

Từ vi sinh vật

Các protease của VSV có nguồn gốc khác nhau có những tính chất khác nhau về nhiều mặt Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ưu,…Hartley (1960) đã phân loại các

protease vi sinh vật thành 4 nhómProtease

serine Protease kim loại Protease acid Protease tiol

Nhiều loài có khả năng tổng hợp mạnh protease, cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào Một số protease ngoại bào đã SX ở quy

mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ

Ứng dụng Enzyme protease được ứng dụng như thế nào?

Ứng dụng của enzyme protease

• Làm mềm thịt

• Làm tăng hương vị sau chế biến

Y học

• Phân hủy máu

đông chữa bệnh nghẽn mạch

• Thuốc tiêu hóa

Nông nghiệp

• SX dịch thủy phân làm tăng lượng đạm cho thức ăn vật nuôi

CN sữa

• Sữa đông tụ

• Pepsine được dùng trong sản xuất formate

CN Thuộc da

• Làm mềm lông

• Sạch lông

• Bóng da

Chương I: Tổng quan về enzyme protease

II Thu nhận Protease

từ nấm mốc A Oryzae

Thu nhận

protease từ

nấm mốc A

oryzae

Thông tin về A oryzae?

Nuôi và thu nhận như thế nào? Quy trình tinh sạch?

Thông tin về nấm mốc A oryzae

Hình thái

• Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty

Điều kiện phát

triển

• Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử : 45%.

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%.

Độ ẩm không khí : 85 -95%.

pH môi trường : 5,5 - 6,5

Nhiệt độ nuôi cấy : 27 – 30 độ C

Thu nhận enzyme protease từ phương

pháp nuôi cấy bề mặt

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô

Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương pháp nuôi

cấy chìm

Là PP nuôi cấy VSV được nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ

XX

Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt

Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán

rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt

Thu nhận enzyme protease từ phương

pháp nuôi cấy bề mặt

Kéo dài 10-14 giờ Giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng rất chậm.

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.

+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.

+ Khối môi trường còn rời rạc.

+ Enzym mới bắt đầu được hình thành.

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300  C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt

Giai đoạn 1

Thu nhận enzyme protease từ phương

+ Môi trường được kết lại khá chặt.

+ Độ ẩm môi trường giảm dần.

+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45 C.

+ Chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.

+ Các enzym được hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn

sẽ được tạo ra nhiều hơn.

+ Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30 C là tốt nhất.

Giai đoạn 2

Thu nhận enzyme protease từ phương

do đó lượng enzym sẽ giảm Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme Chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra,

chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có

trong môi trường) Người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ

ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh

Trích ly enzyme

- Toàn bộ khối lượng chế phẩm

enzyme thô đã sấy đem đi nghiền

nhỏ

- Các loại enzyme thủy phân hòa tan

trong nước nên sau khi nghiền mịn,

người ta dùng nước, các dung dịch

muối trung tính, các dung môi hữu

cơ (cồn, acetone)

- Nhiều thí nghiệm cho thấy dùng

nước cho kết quả tốt và dễ được

dùng rộng rãi trong sản xuất Theo

phương pháp khuếch tán bằng nước

có thể chiết được lượng enzyme trên

90 – 95% và trong nước chiết không

chứa các tạp chất không tan

Thời gian trích Thời gian càng lâu càng có khả năng trích được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính của enzyme Thời gian thích hợp khoảng 30 – 40’

Nhiệt độ trích

Nhiệt độ càng tăng vận tốc trích ly càng tăng nhưng làm giảm hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme Nhiệt độ trích ly tối thích là 20 – 30C

Quá trình tủa

Kết tủa bằng muối

Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein Khi cho một lượng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa Nếu quá trình này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa

mà không bị biến tính Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối thấp

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch Nhìn chung những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện

thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone, ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường

Chương II: Ứng dụng của protease

I Ứng dụng trong

công nghiệp

CN thuộc da

- Chất quan trọng nhất của da là collagen, dưới tác dụng của

- Enzyme sẽ tách các chất nhờn

và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn, loại bỏ khỏi da các chất nhớt

và làm cho da có độ mềm dẻo

nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da.

Xẻ da, xén tỉa Xém diềm, nạo thịt Tẩy lông, ngâm

Rửa, hồi tươi

Protease

Protease

CN chất tẩy rửa

- Tác dụng tẩy rửa các vết bẩn như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước sốt thức ăn, và chỉ có hoạt tính trong dung dịch giặt.

- Enzyme có những tác dụng như sau khi được sử dụng trong chất tẩy rửa:

+ Giúp tăng hiệu quả của việc giặt tẩy.

+ Giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh

+ Giảm năng lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp + Giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt rửa cao.

+ Giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzym là chất có thể phân hủy sinh học.

+ Tăng độ trắng và chống chất bẩn bám trở lại.

CN chất tẩy rửa

Năm 1956 sản xuất chất tẩy rửa đầu tiên BIO-40.

Năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại

là BIOTEX được chiết xuất từ B.licheniformis

Và đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus, và chủ yếu là từ B Subtilis

Ngoài ra còn một vài loại protease khác trên thị trường:

Tên thương mại: Savinase và Relase

CN chất tẩy rửa

Cơ chế xúc tác của subtilisin

Bước 1, Acyl hóa:

Hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử cácbon trong nhóm cácboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng) Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl-enzyme, vòng imidazole

và một amine (phản ứng khử).

Bước 2, Khử acyl hóa:

Phức hệ acyl-enzyme bị thủy phân bởi phân tử H 2 O theo chiều ngược lại của bước một Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme.

CN dệt

Protease được dùng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi tơ nhân tạo được cho vào các dung dịch casein, getalin) để được đánh bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thuỷ phân lớp serisin làm bết dính các sợi tơ tự nhiên làm bong và tách rời các sợi tơ tằm, do đó làm giảm hoá chất để tẩy trắng.

Sợi sau khi kéo kén thường có khoảng 30% serisin Muốn tách serisin phải nấu trong dung dịch xà phòng Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa.

Để tách lượng serisin còn lại người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm mốc,

vi khuẩn.

Trong nông nghiệp

Dùng để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt là các phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp.

Ở Nhật hằng năm đã sản xuất hàng vạn tấn chế phẩm cellulase các loại

để dùng trong nông nghiệp Có chế phẩm chứa cả cellulase,

hemicellulase, protease và amylase.

Công nghệ này khá phổ biến ở nhiều quốc gia Ở nước ta việc dùng

enzyme vi sinh vật góp phần trong sản xuất phân hữu cơ đang được khai thác để thay thế cho phân hóa học.

Trong nông nghiệp

Trong chăn nuôi : chủ yếu là bổ sung vào thức ăn gia súc cùng với 1 số enzym khác như amylase, phytase

Nguồn lấy cơ chất:

Tôm sú có một khối lượng xuất khẩu rất lớn của ngành chế biến thuỷ sản,

và cho rất nhìu phế liệu của nó như vỏ và đầu tôm

Bước tách chiết enzym protease:

Nguyên liệu là đầu tôm( bao gồm gan, tuỵ), vỏ tôm Sau khi thực hiện lấy thịt đi xuất khẩu, đem phế phẩm (đầu + vỏ) đóng gói bảo quản ở -20 o C sau đó quá trình tách chiết thực hiện ở 0-4 o C

Trong nông nghiệp

( đầu, vỏ tôm) nghiền mịn

Nguyên liệu

chiết dịch enzym thô

dịch chiết enzym thô

( li tâm dich chiết enzym thô) (xd hoạt tính protease và hàm lượng protein)

(li tâm chế phảm thô)

chế phẩm thô

tủa dịch chiết

( xd hoạt tính protease, hàm lương protein, khảo sát yếu tố ảnh hưởng hd enzym, chế pt : t o ,pH,độ ẩm…)

tinh sạch

Chế phẩm Rennet

Chế phẩm Rennet là hỗn hợp của Rennin và Pepsin Tỉ lệ pepsin/rennin thay đổi, vì renin chỉ hiện diện trong dạ dày của động vật còn non –

chưa cai sữa, phụ thuộc vào tuổi và loại động vật.

Chế phẩm Rennet thường tồn tại dưới dạng dịch, viên, bột Dưới đây là bảng tổng hợp dạng, thành phần, cách sử dụng, cách bảo quản và giá thành của các chế phẩm Rennet đang có mặt trên thị trường

Chế phẩm Pepsin

Pepsin có tên hệ thống là peptide-peptidohydrolase, thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), vừa là protein vừa là enzyme phân giải protein, và đặc biệt pepsin có khả năng phân hủy chính nó ( pepsin ở dạng dung dịch, pH=4, 45 0 C, 4 giờ).

Pepsin chỉ thủy phân những liên kết peptide, Pepsin bền nhất trong khoảng pH= 4-5, nhưng trong phần pH này hoạt lực của enzyme có phần giảm đi pH > 5.5 thì pepsin bị

vô hoạt.

Pepsin là một protease, tiền pepsin là pepsinogen ( pepsinogen có trong dịch vị, ngoài

ra còn thấy xuất hiện trong máu, nước tiểu, tinh dịch…)

Có 2 dạng là pepsin dạng tinh thể và dạng thô Pepsin thô là hỗn hợp của

pepsin,gelatinase,cathepsin và Brucke pepsin Ở heo pepsin thô chứa một lượng pepsin chính là A, pepsin phụ là B,C,D và gastricsin [E.C.3.4.4.22].

Pepsin được thu nhận từ nguồn động vật, vi sinh vật

Chế phẩm Pepsin

Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống nước thịt, vị hơi chua Nếu them lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt.

Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, không tan trong cồn 95 o , ester, chloroform.

Dưới đây là các dạng chế phẩm thương mại của Pepsin đang có mặt trên thị trường

Một số chế phẩm tiêu biểu của nhóm

nhà khoa học phòng vi sinh

BIO-I: Thành phần : Lactobacillus spp 108 CFU/g, Bacillus spp 108

CFU/g, Sacchromyces spp 107 CFU/g, amylase 300 UI/g,protease 40 UI/g

.Kích thích tiêu hóa cho gia súc, gia cầm, giúp tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn Giảm các chứng rối loạn tiêu hóa và tiêu chảy

VEM-K (dùng trong chăn nuôi), và VEM (nuôi trồng thuỷ sản (NTTS)

Thành phần: Lactobacillus spp 108 CFU/ml, Bacillus spp 106 CFU/ ml,

Sacchromyces spp 107 CFU/ ml, khoáng dễ tiêu Chăn nuôi: Kích thích

tiêu hóa, giảm tiêu tốn thức ăn Giảm mùi hôi của phân

NTTS: Xử lý các chất thải hữu cơ và các khí độc trong môi trường ao

nuôi.Cạnh tranh, ức chế vi khuẩn

Một số chế phẩm tiêu biểu của nhóm

nhà khoa học phòng vi sinh

PROBAC Glucan bổ sung vào các loại thức ăn chăn nuôi tăng hiệu quả sử dụng thức

ăn Giúp vật nuôi hấp thụ, tiêu hóa tối đa các thành phần đạm, béo, năng lượng trong thức ăn, giảm tiêu tốn thức ăn

BASE MIX – 47 là một hỗn hợp vi chất thiết yếu bổ sung vào thành phần công thức khẩu phần ăn, đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho heo trong giai đoạn TĂNG TRỌNG BASE MIX – 47 Với thành phần vitamin và vi chất giúp heo khỏe mạnh, tăng trọng nhanh Hệ đệm và các chất bổ sung: Protease, Cellulase, Lipase, Phytase, Xylanase, Pectinase,Saccharomyces ceverisiae

Chương II: Ứng dụng của protease

II Ứng dụng trong

thực phẩm

Ứng dụng protease trong sản xuất phomat

Phomat là thực phẩm có nguồn gốc từ sữa, được sản

xuất bằng cách lên men và đông tụ casein sữa bò, dê,

cừu hoặc một số động vật khác.

Hai quá trình quan trọng:

• Lên men tạo acid lactic

• Đông tụ casein sữa bằng enzyme rennin

Ứng dụng protease trong sản xuất phomat

Một số loại phomat:

• Cottage: là loại phomat có màu trắng, mùi

nhẹ giống như sữa, thường được dùng làm nước sốt, salad trộn hay làm bánh.

• Brie: một loại phomat lâu đời và truyền

thống, mặt ngoài sản phẩm có màu trắng, bên trong màu vàng nhạt, có mùi nhẹ tương

tự mùi bơ sữa.