đề tài sự tổng hợp và ứng dụng của enzyme protease

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chếphẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnhvực như: chế biến thực phẩm, nông

TRƯỜNG ĐẠI HOC KHOA HỌC – HUẾ

KHOA SINH HỌC

Tiểu luận

protease

GVHD : ….Trần Thanh Phong

SVTH : Nguyễn Ngọc Phúc

Nguyễn Tuấn Anh

Hồ Thị Thùy Dung

Trần Quang Tuyến

LỚP : CNSH- K32

Huế 21/12/2012

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chếphẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnhvực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzymeđược sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD,được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzymeđơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủyphân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sảnxuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làmtăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thựcphẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở visinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạkhuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme

ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống

Protease có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống con người, nhiều loạienzyme protease được dùng để sản xuất thuốc hay các chế phẩm của chúng được dùng

để mang lại lợi ích cho con người Thông qua bài tiểu luân này giúp chúng em hiểu rỏhơn cấu trúc hóa học và chức năng của enzyme protease, cũng như các ứng dụng quantrọng của protease trong cuộc sống

Phần I:

TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE

1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme.

1.1.1 Vấn đề nghiên cứu enzyme ở nước ta

Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc táccủa enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút

sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiêncứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạchenzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quangiữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực

tế Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụngphủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ để sảnxuất amylase Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộngtằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằngenzyme cố định trên cột Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P450trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc Trong lĩnh vực y dược, việcnghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một

số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suydinh dưỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà Đây là một đóng góp rấtthiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta

1.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới.

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trêntoàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%),

và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%)

1.2 Tổng quan về enzyme Protease.

1.2.1 Giới thiệu chung.

Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liênkết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuốicùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kếteste và vận chuyển axit amin

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein.

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tếbào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinhvật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê )

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzymerất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dướidạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường cótính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Protease.

Hình 1.3 Mô hình phân tử enzyme protease (papain) 1.2.2 Phân loại Protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Hình 1.3 Sơ đồ phân loại protease

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chiathành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗipolypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗipolypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốnnhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trongtrung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của

Peptidase (Protease)(E.C.3.4)

enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhómchymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisinBPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tínhđặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạtđộng Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, mộtvài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạtđộng ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thườnghoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vikhuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thườnghoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

- Ngoài ra ở tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzyme này góp phầnphân giải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò.

- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệphomat Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì Khi đó dạ dày bê đã pháttriển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus

2.2 Nguồn thực vật:

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từnhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏdứa (Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắngcủa bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác củaprotease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá Ficinthu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica) Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tựnhiên

Hình 2.1 Mô hình phân tử papain

Hình 2.2 Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật 2.3 Nguồn vi sinh vật:

Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài

thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số

loại nấm men

 Vi khuẩn

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm59% lượng enzyme được sử dụng

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidasehoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó proteasecủa vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% cácliên kết peptide trong phân tử protein

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn

Trọng Cẩn và cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thíchhợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và cókhả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thựcphẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các proteasetrung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm Chúng được

sinh ra nhiều bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.

Hình 2.2 Clostridium

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ

20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… cũng có

khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát

Hình 2.4 Nấm mốc

 Xạ khuẩn

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn

và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp

protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S Trerimosus

Hình 2.5 Xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách

chiết từ S grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới

90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid Ở Liên Xô (cũ), người tacũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin.

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ S fradiae

cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sửdụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptideđịnh trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxylhoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong

hệ hai pha lỏng

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ởquy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợiích chính như sau:

 Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

 Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc nhiềulần quanh năm

 Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng

sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

 Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sảnxuất

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gâybệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật

có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổnghợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó

Phần III :

THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ

VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT

3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.

Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạnchủ yếu

Hình 3.1 Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme

Tuyển chọn và cải tạo giống

3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.

Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta cóthể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tácđộng lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biếnchủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳnchủng gốc ban đầu

3.1.1.1 Phương pháp gây đột biến.

Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:

 Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repressor hoặc tổng hợprepressor có ái lực thấp với gene opertor

 Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có thểgiảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược

Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì cóthể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme

 Gây đột biến ở đoạn gene hoạt hóa promotor để làm tăng áp lực của nó đối vớiARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã…Dùng biện pháp này có thể làmtăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần

Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lồi” mộtbazo khi tái tạo phân tử ADN

Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ)hay hóa học (các hóa chất) tác dụng lên tế bào sinh vật

3.1.1.2 Phương pháp biến nạp.

Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi vi sinh vật dưới ảnh hưởng củaADN trong dịch chiết nhận nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác Ở đây yếu tố biếnnạp là AND Sự chuyển vật liệu di truyền (ADN) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thểxảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bàocho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào

Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chớ không đòi hỏi phải là ADN từcác giống họ hàng Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn ADN nhất định,

thường không quá 10 đoạn Các đoạn ADN được di truyền trong biến nạp có M=106

-107 và phải có cấu trúc xoắn kép Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loài vi khuẩn

như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas.

3.1.1.3 Phương pháp tiếp hợp gene.

Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được truyền từ tế bào cho đến tếbào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạpthì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa Hiện nay quá trình tiếp hợp gene

đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa.

3.1.1.4 Phương pháp tải nạp

Vật liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vaitrò trung gian của thực khuẩn thể (phage) Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND đượcchuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận Do đó làm biến đổitính chất di truyền của tế bào nhận

3.1.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đãđược kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu ýđến điều kiện bảo quản giống Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian cóthể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền vàkiểm tra lại các đặc tính ban đầu

 Phương pháp cấy chuyền

Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môitrường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điềukiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó Sau khi giống đã mọc tốt cần bảoquản ở nhiệt độ lạnh 3-40C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại Khi cấy chuyền chỉ lấybào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo khôngchuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi

không thể lường hết được) Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môitrường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng.

Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó Cầnlưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý

Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn vàrất hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫnđến hư hỏng giống gốc

Hình 3.2 Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch

 Phương pháp làm khô

Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đềuđược khử trùng cẩn thận) Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tụccủa giống khi bảo quản Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấmmốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1năm

Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền Tuynhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn

 Phương pháp đông khô

Hình 3.3 Đông khô vi sinh vật.

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạngthái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và đượclàm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùngmẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu

là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đốitượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut Tuynhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bàođộng vật

 Phương pháp bảo quản lạnh sâu:

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môitrường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt

độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C)

Hình 3.4 Bảo quản lạnh sâu

Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tanmẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trongmẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểmnày người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh nhưglycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu nàyđược thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C

và -196° C Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịunồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Phương pháp bảo quản này có hiệu quảvới nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn vàvirut

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạnnăng hơn cả Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhaunhư vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật Tuy nhiên,phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị vàđiện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ Đặc biệt phương pháp này không thích hợpvới các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp này thường

được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp vớiphương pháp đông khô.

Hình 3.5 Bảo quản trong nitơ lỏng.

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease.

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởngtrực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môitrường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật vàtổng hợp enzyme

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiệntượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất

đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chấtkìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chấtcảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứngcủa enzyme cần tổng hợp

Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca,

P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác

3.1.3.1 Nguồn cacbon.

Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tínhcủa enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp.

Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đốivới nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao Các nguồn cacbon có tác dụngđến sinh tổng hợp proteinase của nấm mốc có thể theo thứ tự:

Đối với Asp flavus 74: fructoza→ glucoza→ sacaroza→ ramnoza→ manoza→

galactoza→ arabinora→ lactoza

Đối với Asp awamori 200: fructoza→ manit→ sacaroza→ arabinoza→

manoza→ galactoza→ lactoza

Đối với Asp oryzae 79: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→

arabinoza→ galactoza

Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme

Protease Ví dụ: Vi khuẩn Bac Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Protease ở môi

trường tinh bột >8%

Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh

tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25- 1,5%sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu tăng nồng độ tinhbột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính Tỷ số giữa cacbon và nitơ cần phải

là 4: 1 Trên môi trường có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưngtổng hợp protease ngoại bào bị ức chế Xạ khuẩn không phát triển được ở trên môitrường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza hoặc arabinoza Glucoza,manoza, fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2- 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạkhuẩn và sinh tổng hợp enzyme

Ngoài ra một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi sinh

vật Chẳng hạn chủng Ps Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả năng

sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n- parafin với 12, 14 và 16nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol Chúng không chỉ đồng hoá được cảhydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm

3.1.3.2 Nguồn nito.

Nguồn nito sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.

Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao Trên

môi trường kzapek NaNO3 được thay bằng cả cazein hoạt lực protease của nấm mốcđược tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung pepton hoạt lựcenzyme tăng 6 lần Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme đượcnâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ Chothêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu

cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22- 74% Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơduy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có B subtilis và B mesentericus,

các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi trường sẽ tạo điềukiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4,H2PO4 là tốt hơn cả Những muối khác NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3,Ca(NO3)2 làm giảm hoạt lực protease tới 30- 50% , còn amylaza giảm 7- 10 lần Còntrong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực protease và amylaza cũng thấp hơntrong môi trường đối chứng (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương

Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm

ứng để sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất

Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật.Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng độtbiến A oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A oryzae 132- 63 tới 7- 24%.Nhiều axit amin có tác dụng ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin, axit glutamic,

izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B megaterium 60% Còn đối với B subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metionin, axit glutamic,

alanin, lơxin,…

Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất củachúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợpproteinza vi sinh vật