ung dụng của enzyme protease

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau . Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm (làm mềm thịt , đông tụ sữa làm pho mát, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…)

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO

Đề tài: Ứng dụng enzyme protease trong công nghệ

chế biến thịt

Giáo viên: Trần Thị Minh Hà

Thành viên nhóm 2:

Tháng 5- 2016

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm (làm mềm thịt , đông tụ sữa làm pho mát, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…)

I Tổng quan về emzyme protease

1.1 Định nghĩa enzyme protease

- Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton

- Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein.

- Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

3

- Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường

có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Protease.

1.

2 Phân loại

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

5

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

II Nguồn thu nhận enzyme protease

- Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận

để sản xuất enzyme Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật

2.1 Nguồn động vật:

- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp, men này do tuyến

tụy tiết ra, tiền thân của nó là trypsinogen, được hoạt hóa bởi Enterokinaza của ruột Trypsin là một enzyme có chức năng phân cắt các protein ta ăn vào thành mảnh nhỏ đồng thời tự phân cắt nó ra mảnh nhỏ

- Ngoài ra ở tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzyme này góp phần phân giải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò

- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepxin (trong

trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus

2.2 Nguồn thực vật:

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica) Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên

7

Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật Hình 1.3 Mô hình phân tử e Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật nzyme protease (papain)

2.3 Vi sinh vật

Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài

thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số

loại nấm men

 Vi khuẩn

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis,

B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó,

B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm

ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính

có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm Chúng được sinh ra nhiều

bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi

Clostridium.

Clostridium

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ

20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12

Bacillus

 Xạ khuẩn

9

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp

protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S Trerimosus

Hình 2.5 Xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách

chiết từ S grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90%

liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ S fradiae cũng

có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide định trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau:

• Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm

• Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng

sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

• Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sản xuất

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp

ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó

III Ứng dụng enzyme protease trong công nghệ chế biến thịt

3.1 Làm mềm thịt

- Trong công nghiệp chế biến thịt, các enzyme phân giải protein cũng được sử dụng trong việc làm mềm thịt Kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt

- Chế phẩm enzyme để làm mềm thịt thường chứa papain hay hỗn hợp của papain với protease của vi sinh vật Tùy theo tính chất của thịt mà sử dụng các chế phẩm một cách thích hợp Chẳng hạn đối với thịt cứng thì trong chế phẩm ngoài hoạt tính proteolizơ

ra phải có cả hoạt tính elastaza ( nghĩa là có khả năng phân giải elastin) Chế phẩm loại

này có thể thu được từ Actinomyces fradiae Người ta nhận thấy rằng chế phẩm keratinaza từ Actinomyces fradiae này có tác dụng mềm thịt xấp xỉ với tandrin (là chất

11

làm mềm thịt tốt nhất của nước ngoài) Chế phẩm protease từ Aspergillus terricola thì

không có hoạt tính elastaza do đó khả năng làm mềm thịt rất yếu

- Kĩ thuật làm mềm thịt :

+ Enzyme protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt) Tiêm dung dịch enzyme vào thịt; tiêm dung dịch enzyme

vào con vật trước khi giết mổ) Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces

fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất

dịch đạm từ da, lông vũ Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin) Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân

Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân

- Để làm mềm thịt, người ta hay sử dụng papain, bromelin, fixcin….có điều các enzyme này chỉ phân giải được các liên kết peptit ở vùng không xoắn của collagen do đó hoặc có thể không mấy hiệu quả đối với thịt chứa nhiều collagne hoặc thủy phân thịt quá mức làm cho thịt có chất lượng cảm quan xấu

- Các yêu cầu đối với chế phẩm enzyme sử dụng trong làm mềm thịt:

+ Có khả năng chịu nhiệt

+ Không độc đối với con người

+ Có khả năng làm giảm độ bền vững của mô liên kết khi gia nhiệt

Ngày nay, papain và các enzyme proteolitic nguồn gốc vi khuẩn, nấm, thực vật được sử dụng phổ biến trong xử lý thịt bảo quản chủ yếu bằng 3 phương pháp sau

 Ngâm trong dung dịch enzyme,

 Bôi bột làm mềm thịt có chứa enzyme cùng với mì chính, muối ăn, tinh bột…

 Bơm dung dịch enzyme vào mô thịt

Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân

Các enzyme papain, bromelin, pepsin hoặc các protease vi khuẩn từ Aspergillus,

Bacillus…., được sử dụng làm mềm thịt, hòa tan các protein cá,…nói chung thủy phân

bằng protease làm tăng khả năng tiêu hóa của protein nên đặc biệt có lợi cho những người bị mắc bệnh tiêu hóa kém hoặc làm mất tính mẫn cảm của người sử dụng với protein

Thủy phân protein trong điều kiện thích hợp lúc đầu thu được các peptid có kích thước nhỏ sau đó xảy ra hiện tượng plastein hóa như sắp xếp lại các peptid hoặc gắn thêm các acid amin không thay thế Protease cũng được dùng để xử lý, tận dụng các phế liệu từ thịt, hoặc các nguyên liệu có nguồn gốc từ protein (thịt vụn, xương, gelatin…) để tạo ra các sản phẩm có giá trị như dịch protein, chất tăng vị, chất cải thiện mùi…

Enzyme Papain :

Papain là một protease điển hình được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến

thịt, có trong cây đu đủ và đu đủ núi

Cấu trúc: bao gồm 212 amino acid được ổn định bằng 3 cầu nối disulfide Cấu trúc

không gian gồm 2 phần rõ rệt với 1 khe ở giữa Khe này chứa vùng hoạt động chứa đựng một “bộ ba xúc tác” được ví như chymotrypsin Bộ 3 xúc tác được làm từ 3 amino acid: cystein - 25, histidine - 159 và asparagines - 158

13