SẮC ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY I- ĐỊNH NGHĨA 1- Lịch sử 2- Các khái niệm  Năm 1967- 1968: Huber, Hulsman, Giddinngs đã công bố phƣơng pháp sắc ký lỏng mới có tên là SK lỏng tốc độ cao (HSLC), hiệu lực cao (HELC) và ngày nay mang tên chính thức là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).  HPLC hay Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột đƣợc nhồi đầy bằng các hạt có kích thước 10m.  Là phƣơng tiện định tính, định lượng hiệu quả trong các Dƣợc điển hiện đại UPS, BP, EP, … trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích hóa hợp chất tự nhiên.  Do vậy phải dùng một bơm có áp suất cao (high pressure)  300atm để đẩy pha động (Mobile Phase) MP qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh (High Performance) một lượng mẫu nhỏ cỡ 20g.  Quá trình cho chất lỏng đi qua cột gọi là sự rửa giải (ELUTION).  Trong quá trình này, chất tan được vận chuyển trong môi trường phân tách bằng một dòng chất lỏng hay chất khí đƣợc gọi là chất rửa giải (ELUANT).  Dung dịch sau khi qua cột có chứa chất tan đƣợc gọi là dung dịch rửa giải (ELUATE).  Pha tĩnh có thể tác động lên chất tan bằng:  Cơ chế hấp phụ như trong trường hợp của oxyt nhôm, silicagel đã được hoạt hoá.  Cơ chế phân bố giữa pha tĩnh và pha động như trong trường hợp silicagel ghép pha đảo.  Cơ chế trao đổi ion với các hạt pha tĩnh trao đổi ion.  Để tiến hành có kết quả tốt trong HPLC điều quan trọng là phải hiểu thấu đáo về bản chất các thành phần của hệ sắc ký gồm:  Chất tan ( chất cần phân tích),  pha tĩnh  pha động.  Lực tương tác phân tử đƣợc mô tả một cách định tính chính là độ phân cực tương đối của ba thành phần này.  Chất cần phân tích có độ phân cực tăng lên theo các nhóm chức: Hydrocarbon < ether < ester < Cetone < aldhehyde < amide < amine < Alcohol< H2O Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 1  3     Ưu điểm vượt trội Độ nhạy, độ chính xác cao. Áp dụng cho hầu hết các hợp chất không bay hơi chịu nhiệt hay dễ bị phân hủy bởi nhiệt, … Giảm thời gian sắc ký, Giảm kích thƣớc hạt, Tăng độ phân giải, … II- CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA HPLC A. BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐỘNG 1- Đặc điểm, tính chất  Dùng loại thủy tinh trung tính, rửa sạch có thể tích từ 100ml  2 lít  Dùng bình thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy cảm với ánh sáng.  Dùng nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi.  Bình đƣợc gắn với một ống bằng polytetrafluoroetylen (d=1-3mm) để dẫn pha động từ bình chứa đến bơm:  Các chất lỏng vào bơm không chứa bụi hay tiểu phân khác vì chúng len lỏi vào các mối hàn gây hại cho bơm và làm nghẽn cột.  Pha động phải được lọc trước khi vào bơm bằng màng lọc thép không gỉ được nhấn khít vào bề mặt của ống polytetrafluoroethylen đặt trong bình chứa.  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 2 2- Xử lý dung môi động a. Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi  Dung môi là nước: cellulose nitrat hay cellulose acetat kích thƣớc 0,45 và 0,22.  Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước: RC (regenerated cenlulose) hay polyamid nylon  Dung môi hữu cơ: lọc qua màng lọc teflon b. Đầu lọc dung môi  Thƣờng có kích thƣớc 5  10m cần phải thƣờng xuyên làm vệ sinh (ngâm trong dung dịch acid nitric 5% hoặc methanol+ đánh siêu âm khoảng 15’, rửa lại bằng nước cất đã được lọc qua màng lọc 0,45m) [lọc chân không]. c. Đuổi khí dung môi  Lọc dƣới áp suất giảm  Đuổi khí dung môi bằng siêu âm (Ultrasonic)  Đuổi khí dung môi bằng sạc khí helium d. Nước rửa cột HPLC  là nước cất hai lần, phải lọc qua màng lọc 0,45m và đƣợc đánh siêu âm để đuổi khí hoà tan hay khí dưới dạng treo (sức kháng trở 18MΩ). B. BỘ PHẬN KHỬ KHÍ DUNG MÔI (DEGASSER)  Là bộ phận quan trọng để loại khí ngay trong bình chứa dung môi hoặc trên dòng chảy của pha động trƣớc khi dung môi vào bơm.  Kỹ thuật khử khí dung môi với Degasser in line là kỹ thuật rẻ tiền so với kỹ thuật sục khí helium.  Dung môi qua hệ thống khử khí sẽ qua màng tổng hợp nhựa đặc biệt, những khí hòa tan trong dung môi có ái lực và linh độ cao hơn với màng này so với các phân tử dung môi lỏng vì thế khí đƣợc đuổi ra ngoài hệ thống.  Chất lỏng đƣợc khử khí. C. BƠM (PUMP) 1-    Đặc điểm Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000psi (1psi=0.068atm, 1bar=14.7psi). Chịu đƣợc tác động của nhiều dung môi. Đảm bảo lƣợng lặp lại 0.01-10ml/phút. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 3 2- Cấu tạo 3- Phân loại a. Đầu bơm  Hút pha động vào thân bơm  Đẩy pha động từ thân bơm vào cột sắc ký b. Thân bơm  Có 1 pisston chuyển động qua lại.  Khi pisston tiến tới 1 bi đóng lỗ phía cột lại và bi khác nhấc ra để pha động vào thân bơm.  Khi pisston lùi lại, 1 bi đóng lỗ phía bình đựng dung môi và mở lỗ phía cột để pha động vào cột sắc ký. a. Bơm đẳng dòng (isocratic pump)   Chỉ lấy đƣợc một loại dung môi không tự động pha trộn đƣợc dung môi.  Không tăng tốc độ dòng đột ngột.  Theo dõi áp suất bơm trong quá trình phân tích.  Định kỳ rửa lọc dung môi đầu vào.  Nạp đầy hệ thống HPLC bằng methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng với nƣớc khi không tiến hành phân tích để tránh nấm mốc phát triển. b. Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump)  Lấy đồng thời 4 loại dung môi động  Chạy đƣợc chƣơng trình dung môi (gradient) một cách uyển chuyển và đa dạng  Tiết kiệm dung môi  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 4  c. Bơm có áp suất không đổi  Áp suất không đổi.  Lƣu lƣợng thay đổi.  d. Bơm có lưu lượng hằng định.  Di chuyển đơn giản (ống tiêm) có lưu lượng thường không đổi, áp suất không đổi.  Thân bơm có thể tích nhỏ.  Phải làm đầy pha động thƣờng xuyên.  Phân loại:  Bơm 1 pisston: + Hệ thống tâm sai + Lưu lượng không đổi + Áp suất thay đổi  Bơm 2 pisston: + Áp suất không đổi và hằng định. + Lưu lượng không đổi; có thể điều chỉnh bằng motơ. + Thể tích không bị giới hạn. + + Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 5 4- Lưu ý khi sử dụng bơm nhị phân và bơm tứ phân  Tƣơng tự nhƣ bơm đẳng dòng.  Phối hợp dung môi hợp lý tránh kết tủa chất điện giải trên đƣợng ống.  Dùng dung môi trung gian một cách hợp lý khi phối hợp dung môi.  Cân bằng cột bằng hỗn hợp dung môi – nước với tỷ lệ tƣơng tự hỗn hợp dung môi đệm.  Rửa kĩ đường ống chứa đệm bằng nước sau khi kết thúc quá trình phân tích, sau đó rửa lại bằng hỗn hợp dung môi ethanol hay acetonitril với nước. D. BỘ PHẬN TIÊM MẪU  Không làm xáo trộn chất nhồi trong cột khi đưa mẫu thử vào cột. 1- Phương pháp sử dụng syringe trực tiếp a. Đặc điểm, cấu trúc  Tiêm chính xác đến l để tiêm mẫu qua cột vách ngăn tự liền bằng cao su, Teflon, silicone.  Không tƣơng kị với pha động của hệ thống sắc ký.  Chịu áp suất cao.  Không chứa chất dẻo hóa, chất chống oxy hóa. b. Ưu điểm  Tiện lợi, đơn giản, hiệu lực cao  Hạn chế thể tích ngoài cột c. Nhược điểm  Độ lặp lại không cao vì thể tích mỗi lần bơm khác nhau.  Tắt kim  Ngƣng dòng chảy khi mỗi lần đƣa mẫu vào cột, đợi đến khi áp suất bằng áp suất không khí rồi mới thêm. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 6 2- Phương pháp sử dụng van bơm - Kiểu van loop a. Đặc điểm  Hay sử dụng  Thể tích thay đổi: 5 – 100 l  Dùng dưới áp suất cao và tự động hóa được (autosampler)  Van tiêm mẫu có thể hoạt động dưới áp suất cao và đƣợc trang bị một loop có thể tích nhất định chứa mẫu (loop: 10, 20, 30, 50 l) đƣợc đƣa vào cột lúc nào cũng hằng định.  Lƣợng mẫu bơm vào thƣờng nhiều hơn lƣợng cần thiết (10-100l) b. Ưu điểm  Hệ thống bơm có thể làm việc dƣới áp suất cao mà không bị gián đoạn dòng chảy nhờ trang bị một loop có thể tích hằng định  Không bị tắt, bị bẩn do các mảnh đệm ngăn (septum)  Độ lặp lại cao  Loại bỏ sai số mỗi lần tiêm của loại syringe thẳng vào cột  Tự động hóa đƣợc (autosampler)  3- Bơm mẫu tự động (Autosampler) a. Đặc điểm   Cũng là phƣơng pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng van bơm với thể tích xác định  Nhƣng hệ thống này sẽ tự động bơm mẫu sau khi cài đặt chƣơng trình điều khiển với thể tích bơm mẫu có thể thay đổi 1-100l b. Ưu điểm  Độ lặp lại cao  Độ chính xác cao  Có thể tự động hóa đƣợc Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 7 E. CỘT SẮC KÝ 1- Tiền cột (pre-column, guard column, scavenger column)  Hấp phụ, giữ lại các tiểu phân tạp kích thƣớc nhỏ có thể sẽ gây nghẹt hay phá hủy cột sắc ký nhằm kéo dài tuổi thọ cột.  Cột bảo vệ có tác dụng bão hòa pha động với pha tĩnh làm cho sự mất dung môi là tối thiểu.  Cấu tạo chất nhồi cột bảo vệ giống như cột phân tích nhƣng kích thước hạt lớn hơn một ít, làm áp suất hệ thống tăng lên 200-300psi.  Thƣờng 3 tháng phải thay tiền cột hay áp suất cao hơn áp suất lịch sử 50%.  2- Cột sắc ký  Thép không rỉ hay thủy tinh đặc biệt a. Cột phân tích  Dài: 10 – 30 cm  Đƣờng kính trong: 4 – 10 mm  Cỡ hạt pha tĩnh: 1.5 – 10 m  Thƣờng dùng: 15 hay 25 cm x 4 – 6 mm, 5 m, H = 40000 – 60000 đĩa/mét  Hiện nay: 5 – 10 cm x 1 – 4.6 mm, 1.7 m, H = 100.000 đĩa/mét  tiêu tốn ít dung môi và giảm thời gian phân tích.  Chất nhồi cột sắc ký lỏng đƣợc chế tạo từ silica (SiO2) bằng cách làm kết tụ các hạt silica để tạo thành hạt có kích thước lớn hơn có đường kính đều nhau.  Các hạt silica gel đƣợc hình thành đƣợc bao bởi lớp mỏng hữu cơ liên kết hóa học và vật lý với bề mặt.  Ngoài ra còn sử dụng chất nhồi cột khác nhƣ: oxyd nhôm, polymer xốp, nhựa trao đổi ion, … tùy vào loại hình sắc ký.  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 8 b. Cột bán điều chế (semi - preparative column)  Đƣờng kính >10mm.  Kích thƣớc chất nhồi cột: 10-50m.  Tách 100-200mg mẫu thử để phân lập các chất. c. Cột chế hóa – cột điều chế (preparative column)  Dài 25 – 100 cm  Đƣờng kính trong: 6 mm  Cột trao đổi ion, cột rây phân tử  Kích thƣớc hạt > 10 m  Có thể tác 0.5-1g mẫu thử. Quy mô công nghiệp có thể đạt tải lƣợng lên đến hàng kg mẫu thử.  F. ĐẦU DÒ (DETECTOR) 1           2- Đặc điểm Chất tan đi qua đầu dò  tạo những tín hiệu điện Sự thay đổi về độ lớn vật lý chất tan sẽ chuyển thành xung điện và đọc đƣợc trên máy ghi. Sự đáp ứng đầu dò tỷ lệ với lƣợng chất tan, lặp lại và độc lập với chất rửa giải. hấp thụ uv-vis, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn, khuếch tán ánh sáng… Detector lý tưởng Độ nhạy cao (< 1μg/ml) Độ lặp lại cao Đáp ứng rộng rãi đối với các mẫu cần phân tích Không quá nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt, ẩm, tốc độ pha động, … Không phá hỏng mẫu thử Vận hành dễ, liên tục, giá thành rẻ Phân loại a. Đầu dò quang phổ kế khả kiến và tử ngoại (detector UV-Vis) -i- Nguyên tắc  Phổ biến nhất hiện nay trong định lƣợng thƣờng qui  Nguyên tắc: pha động chứa chất phân tích đƣợc rửa giải từ cột đi ngang qua tế bào đo sẽ hấp thụ năng lƣợng bức xạ UV-Vis; chất phân tích có cấu trúc không no hay có màu  Sự hấp thu bức xạ này bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer  Dung môi dùng trong trƣờng hợp này không hấp thu hay hấp thu rất ít tại bƣớc sóng phân tích; chứa tạp chất cực nhỏ. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 9 -ii- Cấu tạo mộ t) Nguồn ánh sáng đơn sắc (Source of monochromatic light)  Đèn kết hợp với kính lọc hay đèn kết hợp bộ tạo ánh sáng đơn sắc.  Cho phép chọn 1 bƣớc sóng từ đèn nguồn phát ra ánh sáng trên 1 vùng dải bước sóng rộng. hai)   Flow cell Kiểu hình chữ “Z”. Cửa sổ là thủy tinh quartz bao lấy 2 đầu ống hình trụ có đường kính 1mm và dài 1cm. ba) Bộ phận đo sự thay đổi cường độ ánh sáng khi đi qua Flow cell  Là diod quang (photodiode) hay ống nhân quang (photomultiplier tube)  Tín hiệu từ diode quang hay ống nhân quang đƣợc khuếch đại và truyền tới máy ghi (Recorder), Interrator hay máy vi tính.  Peak trên sắc ký đồ biểu thị cho sự đáp ứng với các thành phần có thể dùng chúng đƣợc khi rửa giải khỏi cột sắc ký. Chiều cao peak hay diện tích peak của từng thành phần có thể dùng để xác định nồng độ khi đối chiếu với peak thu đƣợc từ việc tiêm mẫu chuẩn có cùng hoạt chất.       -iii- Ưu điểm -iv- Nhược điểm Độ nhạy cao (3ng/ml), giá thành không quá cao, dễ vận hành Ít phụ thuộc vào các thay đổi điều kiện (nhiệt độ, tốc độ dòng..) Đòi hỏi dung môi phù hợp và tinh khiết Chọn lọc các chất tan hấp thu trong vùng Uv-vis Độ nhạy thấp hơn UV-Vis. b. Đầu dò dãy diode quang PDAD (Photo-Diode Array Detector) -i- Đặc điểm  Phát triển từ UV-Vis  Sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu [phòng RD].  Tia đa sắc sau khi qua tế bào đo đƣợc đƣa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc rồi đi đến một dãy diod quang  Mỗi một diod với một băng có độ dài sóng hẹp phát hiện sự hấp thu ở một bƣớc sóng nhất định  Toàn bộ dãy diod [1024 con diode] đƣợc quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý  Thu đƣợc phổ UV-Vis của pic.  Có thể nhìn toàn thang sóng (maxplot) Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 10   -ii- Ưu điểm  Phát hiện đồng thời chất được phân tích ở nhiều bước sóng khác, cung cấp thông tin về phổ uv-vis của một peak.  Xác định bƣớc sóng hấp thụ tối đa của một chất.  Phát hiện tạp chất, chất gây nhiễu [biến đổi của thuốc] ở bƣớc sóng thấp hơn không đặc trƣng.  Cung cấp thông tin vầ độ tinh khiết của peak.  % tinh khiết peak [có phải đó chỉ là 1 đỉnh?].  Cung cấp phổ 3D [độ hấp thu, thời gian lƣu, bƣớc sóng] giúp cho việc chọn bƣớc sóng phân tích tối ƣu cho định lƣợng, định danh chất phân tích.  Cung cấp phổ UV-Vis của một peak, định danh peak.  [đo NMR phải tinh khiết 95%].  [vanillin sulfuric dùng để phát hiện tạp nối đơn].  … Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 11   -iii- Nhược điểm Độ nhạy kém hơn đầu dò UV-Vis thông thƣờng Không tách đƣợc các đồng phân quang học.   Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 12 c. Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi ELSD (Evaporative light scattering detector) -i- Hoạt động mộ t) Giai đoạn 1: phun sương  Dung dịch rửa giải đƣợc phun sƣơng  Trộn với khí nitơ  Hình thành hạt phân tán        -ii- hai) Giai đoạn 2: Bốc hơi pha động  Hạt phân tán đi qua buồng nhiệt  Pha động bốc hơi khỏi hạt  Phân lập chất phân tích thành những giọt nhỏ ba) Giai đoạn 3: Phát hiện  Chất phân tích đƣợc chiếu chùm tia laser của đèn nguồn và gây tán xạ ánh sáng.  Ánh sáng khuếch tán đƣợc giữ lại bởi ống nhân quang hay diode quang và chuyển thành tín hiệu điện tỉ lệ với lƣợng chất tan. Ưu điểm Phát hiện tất cả các hợp chất có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động. Sự bay hơi của pha động Độ nhạy cao (ng/ml). Khảo sát đƣờng và những chất có áp suất hơi yếu. [rất sạch tạp, sắc ký rõ đẹp]. -iii- Nhược điểm Sử dụng với pha động dễ bay hơi Mẫu phân tích có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 13 d. Đầu dò khúc xạ kế vi sai RI (Refractive Index detector) -i- Nguyên tắc chung -ii- Ưu điểm -iii- Nhược điểm  Dựa trên sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ của pha động và pha động có lẫn chất tan sau quá trình tách qua sắc ký cột.  Là loại thứ 2 đƣợc dùng phổ biến làm detector trong HPLC phân tích, rây phân tử.  Là detector vạn năng do có khả năng phát hiện hầu hết các chất tan (đƣờng, glycoside no, …)  Rất bền và rất nhạy.  Độ nhay kém hơn UV-Vis  Phụ thuộc nhiều vào sự thay đổi thành phần của pha động nên thƣờng không sử dụng khi cần gradient hóa dung môi.  Các máy HPLC phải đƣợc trang bị bộ phận điều nhiệt giữ cho độ biến thiên nhiệt độ của hệ thống khoảng ±0.5oC. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 14 e. Đầu dò huỳnh quang FD (Fluorecence detector)        -i- Đặc điểm Cột sắc ký : RP-LC 18 (25 cm x 4,6 mm, 5 μm. Nhiệt độ cột : 35oC Pha động : H2O- MeOH- ACN (4:3:5) Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Bƣớc sóng/FD: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm. Thể tích tiêm : 20 μl [chất phát huỳnh quang đƣợc khi có nhiều nối đôi liên hợp, cồng kềnh], tách đẹp hơn ELS.         -ii- Ưu điểm Phát hiện huỳnh quang cho: Các thuốc trừ sâu, Carbamate Aflatoxin (nấm mốc), Vitamin, Acid amin.  Khả năng tăng độ nhạy hang nghìn lần so với phát hiện bằng đo độ hấp thu.  Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bƣớc sóng khác biệt làm giảm đi các peak gây nhiễu. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 15 f.           Đầu dò điện hóa ED (Electrochemical detector) Đo các cation, anion.  Rất nhạy, dùng rộng rãi. Có trong ion chromatography.  Giới hạn phát hiện: 1pg/ml g. Đầu dò đo độ dẫn CD (conductivity detector) Chọn lọc ion Khảo sát ion và hợp chất có thể ion hóa. Giới hạn phát hiện: 0.2% của sự sai lệch độ dẫn. h. Đầu dò khối phổ MSD (Mass spectroscopy detector) [mạnh nhất: sắc ký lỏng ghép khối phổ thời gian bay]. Giới hạn phát hiện: cực nhỏ, Đắt tiền, lĩnh vực áp dụng rộng rãi.  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 16     Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 17 i.        3- Đầu dò đo cường độ xung PAD (Pulsed Amperometry Detector) Hệ thống gồm 3 điện cực: Điện cực đối chứng Điện cực chỉ thị Điện cực bề mặt nhỏ làm bằng thủy tinh hay vàng. Phát hiện: Carbohydrate  Aldehyd  Acid amin Alcool  Amine  Chất hữu cơ có S. Tóm tắt tính năng sử dụng các đầu dò trong HPLC Giới hạn phát hiện RI Sử dụng Vạn năng  0,7 g/ml UV-VIS Detector Chọn lọc  3ng/ml Hóa phân tích 2 Chú ý Ưu điểm Nhược điểm  Là detector vạn  Độ nhạy năng do có khả năng phát kém hơn UV-Vis Phụ thuộc hiện hầu hết các chất tan  (đƣờng, glycoside no, …) nhiều vào sự  Rất bền và rất nhạy. thay đổi thành phần của pha động nên thƣờng điều không sử dụng kiện khi cần gradient nhiệt hóa dung môi. độ, độ  Các máy ẩm HPLC phải đƣợc trang bị bộ phận điều nhiệt giữ cho độ biến thiên nhiệt độ của hệ thống khoảng ±0.5oC.  Độ nhạy cao  Đòi hỏi sử (3ng/ml), giá thành không dung môi phù dụng quá cao, dễ vận hành hợp và tinh khiết nhiều  Ít phụ thuộc vào các  Chọn lọc nhất thay đổi điều kiện (nhiệt các chất tan hấp trong độ, tốc độ dòng..) thu trong vùng phân Uv-vis tích  Độ nhạy thường thấp hơn UVqui Vis. Trần Trung Trực 18 PDAD Giới hạn phát hiện Chọn lọc  10ng/ml FD Sử dụng Chọn lọc  8 pg/ml ECD Detector Chọn lọc  1 pg/ml Hóa phân tích 2 Chú ý Ưu điểm Nhược điểm Độ nhạy  Phát hiện đồng thời  kém hơn đầu dò chất được phân tích ở nhiều bước sóng khác, UV-Vis thông cung cấp thông tin về phổ thƣờng. uv-vis của một peak.  Không tách  Xác định bƣớc sóng đƣợc các đồng hấp thụ tối đa của một phân quang học chất.  Phát hiện tạp chất, chất gây nhiễu ở bƣớc Dùng sóng thấp hơn không đặc nhiều trƣng. trong  Cung cấp thông tin nghiên vầ độ tinh khiết của peak. cứu  % tinh khiết peak.  Cung cấp phổ 3D [độ hấp thu, thời gian lƣu, bƣớc sóng] giúp cho việc chọn bƣớc sóng phân tích tối ƣu cho định lƣợng, định danh chất phân tích.  Cung cấp phổ UVVis của một peak, định danh peak.  Phát hiện huỳnh quang cho:  Các thuốc trừ sâu,  Carbamate  Aflatoxin (nấm mốc), Tính  Vitamin, đặc  Acid amin. hiệu  Khả năng tăng độ nhạy hang nghìn lần cao so với phát hiện bằng đo độ hấp thu.  Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bƣớc sóng khác biệt làm giảm đi các peak gây nhiễu. Nhạy cao, dùng rộng rãi Trần Trung Trực 19 Sử dụng Giới hạn phát hiện Chú ý  1 pg/ml Hợp chất có thể ion hóa ELSD Chọn lọc Chọn lọc MS CD Detector Vạn năng Nhiệt độ bay hơi chất  1 ng đối phân với glucose tích thấp hơn pha động fg/ml Ưu điểm Nhược điểm  Phát hiện tất cả các  Sử dụng hợp chất có sự bay hơi với pha động dễ thấp hơn sự bay hơi của bay hơi. pha động.  Mẫu phân  Sự bay hơi của pha tích có sự bay động hơi thấp hơn sự  Độ nhạy cao (ng/ml) bay hơi của pha  [rất sạch tạp, sắc ký động rõ đẹp]. đắt tiền, áp dụng mọi lĩnh vực III- CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG TRONG HPLC     Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Hệ số dung lượng (k’) Hệ số chọn lọc (α) Hóa phân tích 2  Hệ số bất đối (AF)  Độ phân giải (RS)  Số đĩa lý thuyết (N) Trần Trung Trực 20 A. TỐC ĐỘ DI CHUYỂN CỦA CÁC CHẤT 1- Tốc độ di chuyển của một chất  Được đặc trưng bởi: hệ số phân bố của nó giữa hai pha các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh: thời gian lưu, thể tích lưu a. Thời gian lưu (Retention time)  tR = t’R + tM  tR: Thời gian lưu là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector; thời gian lưu càng lớn thì chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di hcuye6n3 của nó càng nhỏ.  tM (t0): thời gian chết là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi (pic nhỏ bên trái).  tR’: là thời gian lưu tương đối  b. Thể tích lưu VR’=VR-VM=VM-V0  VR: thể tích lƣu.  VR’: thể tích lƣu tƣơng đối.  VMthể tích chết của cột = V0: thể tích rỗng là thể tích dung môi từ nơi tiêm trong cột đến đầu dò. c. Hệ số dung lượng k’(capacity factor) Qs Cs xVs VS t ' R k   k   t M (1  k ' ) QM CM xVM VM t M '   VM, VS: là thể tích pha tĩnh, pha động.  k’: bản chất các pha, chất tan, nhiệt độ, pH  1 < k’ < 8 (tối ƣu 1 1500 Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 23 D. ĐỘ PHÂN GIẢI – HỆ SỐ TÁCH CỘT (RESOLUTION)  Độ phân giải là đại lƣợng đo mức độ tách 2 chất trên 1 cột sắc ký.  Độ phân giải RS thể hiện:  Độ nhọn của đỉnh (hiệu lực cột, column efficacy)  Khoảng cách giữa các đỉnh (hiệu lực dung môi, sonvent efficacy). 2(t R ) B  (t R ) A  N      k 'B   Rs     ; Rs  WA  WB 4    1  k 'B   Rs = 0,75: hai peak không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.  Rs = 1,0: hai peak tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.  Rs = 1,5: hai peak tách hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%).   Tăng độ phân giải RS:  Tăng số đĩa N + Cột dài hơn (áp suất, thời gian và độ rộng của peak cũng tăng theo) + Kích thước hạt nhỏ + Giảm tốc độ dòng pha động  Tăng hệ số dung lượng k'B: + thay đổi thành phần pha động trong sắc ký lỏng + tăng nhiệt độ đối với sắc ký khí. + Nếu kB’ tăng nhiều thì tăng thời gian phân tích (1[...]... không biết hiệu lực tách của quá trình sắc ký B HÌNH DẠNG- SỰ ĐỐI XỨNG CỦA PIC  Dạng pic sắc ký có tính đối xứng nhƣ phân bố Gauss là dạng lý tưởng  Pic thƣờng bị dãn ra và chỉ gần đối xứng; để đánh giá tính bất đối xứng của pic ngƣời ta dùng hệ số bất đối          Hệ số bất đối (asymmetrical factor): AF  BC (0,8 < AF < 1,2) AC BC: nửa chiều rộng phía sau của pic được đo ở 1/10 chiều cao của... 1/10 chiều cao của peak Khi Af càng tăng thì hiện tượng kéo đuôi (tailing peak) càng rõ do: tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh cột sắc ký bẩn Đỉnh kéo tuyến trƣớc (fronting peak) có thể lƣợng mẫu đƣa vào quá lớn so với năng lực cột Khi Af của đỉnh càng gia tăng  tính tƣơng thích và độ chính xác kém tin cậy hơn Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 22 C HIỆU LỰC CỘT- SỐ ĐĨA LÝ THUYẾT  Hiệu lực... lực cột là thông số về hiệu lực tách của cột, đƣợc biểu thị bằng 2 thông số:  Số đĩa lý thuyết N  Chiều cao đĩa lý thuyết H 𝑳  t  t  L N   16 R   5,54 R   H= H 𝑵  WB   W1/ 2  2 2   N: số đĩa lý thuyết của cột  H: chiều cao đĩa lý thuyết (0.03-1mm)  WB: chiều rộng của peak ở đáy peak  W1/2: chiều rộng của peak đo ở nữa chiều cao  Hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp, không... Độ nhạy cao  Kỹ thuật chuẩn bị mẫu đơn giản Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 26 B ĐỊNH LƯỢNG 1- Các phương pháp định lượng thường áp dụng a Dựa vào chiều cao peak  Khi peak có hình dạng không đổi thì chiều cao peak (khoảng cách từ đường nền đến đỉnh peak) tỷ lệ với diện tích và cũng đƣợc dùng để đánh giá sắc ký đồ  Điều kiện áp dụng: K’ phải hằng định  Để đo tính tuyến tính, việc đo chiều cao peak... HPLC theo các điều kiện của tiêu chuẩn  Xem xét sắc ký đồ mẫu thử, nếu có pic tạp (pic có vị trí thời gian lƣu tƣơng tự pic trong sắc ký đồ mẫu tạp chuẩn), tính lượng tạp chất này bằng cách so sánh diện tích pic tạp với diện tích của pic chuẩn có nồng độ đã biết  b Không sử dụng tạp chuẩn  Trong tiêu chuẩn sẽ cho biết vị trí của tạp chất trên sắc ký đồ để dựa vào đó xác định mà không cần mẫu tạp... định lượng Lincomycin B trong chế phẩm không được quá 5%  Xác định vị trí của tạp Lincomycin B trong sắc ký đồ mẫu thử bằng cách cho biết hời gian lưu liên quan là khoảng 0.5 cho Lincomycin B và 1.0 cho Lincomycin  Nếu sắc ký đồ mẫu thử cho thấy thời gian lưu của Lincomycin là 8’ thì nếu trên sắc ký đồ có pic với thời gian lưu khoảng 4’ thì đó là tạp Lincomycin B Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 32... (nấm mốc), Tính  Vitamin, đặc  Acid amin hiệu  Khả năng tăng độ nhạy hang nghìn lần cao so với phát hiện bằng đo độ hấp thu  Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bƣớc sóng khác biệt làm giảm đi các peak gây nhiễu Nhạy cao, dùng rộng rãi Trần Trung Trực 19 Sử dụng Giới hạn phát hiện Chú ý  1 pg/ml Hợp chất có thể ion hóa ELSD Chọn lọc Chọn lọc MS CD Detector Vạn năng Nhiệt độ bay hơi chất  1 ng đối phân...  Kích thước hạt càng nhỏ  Số đĩa lý thuyết càng lớn  Hiệu lực cột càng tăng  N > 1500 Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 23 D ĐỘ PHÂN GIẢI – HỆ SỐ TÁCH CỘT (RESOLUTION)  Độ phân giải là đại lƣợng đo mức độ tách 2 chất trên 1 cột sắc ký  Độ phân giải RS thể hiện:  Độ nhọn của đỉnh (hiệu lực cột, column efficacy)  Khoảng cách giữa các đỉnh (hiệu lực dung môi, sonvent efficacy) 2(t R ) B  (t R )... Cột dài hơn (áp suất, thời gian và độ rộng của peak cũng tăng theo) + Kích thước hạt nhỏ + Giảm tốc độ dòng pha động  Tăng hệ số dung lượng k'B: + thay đổi thành phần pha động trong sắc ký lỏng + tăng nhiệt độ đối với sắc ký khí + Nếu kB’ tăng nhiều thì tăng thời gian phân tích (1 ... tự liền cao su, Teflon, silicone  Không tƣơng kị với pha động hệ thống sắc ký  Chịu áp suất cao  Không chứa chất dẻo hóa, chất chống oxy hóa b Ưu điểm  Tiện lợi, đơn giản, hiệu lực cao  Hạn... Lincomycin B sắc ký đồ mẫu thử cách cho biết hời gian lưu liên quan khoảng 0.5 cho Lincomycin B 1.0 cho Lincomycin  Nếu sắc ký đồ mẫu thử cho thấy thời gian lưu Lincomycin 8’ sắc ký đồ có pic... tốc độ dòng pha động  Tăng hệ số dung lượng k'B: + thay đổi thành phần pha động sắc ký lỏng + tăng nhiệt độ sắc ký khí + Nếu kB’ tăng nhiều tăng thời gian phân tích (1