SẮC ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

 Do vậy phải dùng một bơm có áp suất cao high pressure  300atm để đẩy pha động Mobile Phase MP qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh High Performance

V - MỤ M ỤC C L LỤ ỤC C I- ĐỊNH NGHĨA

Lịch sử

Năm 1967-1968, Huber, Hulsman và Giddings đã giới thiệu một phương pháp sắc ký lỏng mới, được gọi là sắc ký lỏng tốc độ cao (HSLC) và hiệu lực cao (HELC), hiện nay được công nhận chính thức là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Các khái niệm

 HPLC hay Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột đƣợc nhồi đầy bằng các hạt có kích thước 10m

 Là phương tiện định tính, định lượng hiệu quả trong các Dược điển hiện đại UPS, BP, EP,

… trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích hóa hợp chất tự nhiên

Để đạt được hiệu quả phân giải cao, cần sử dụng bơm có áp suất khoảng 300 atm nhằm đẩy pha động (Mobile Phase) qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút, cho phép phân tích nhanh chóng một lượng mẫu nhỏ khoảng 20 µg.

 Quá trình cho chất lỏng đi qua cột gọi là sự rửa giải (ELUTION)

 Trong quá trình này, chất tan được vận chuyển trong môi trường phân tách bằng một dòng chất lỏng hay chất khí đƣợc gọi là chất rửa giải (ELUANT)

 Dung dịch sau khi qua cột có chứa chất tan đƣợc gọi là dung dịch rửa giải (ELUATE)

 Pha tĩnh có thể tác động lên chất tan bằng:

 Cơ chế hấp phụ như trong trường hợp của oxyt nhôm, silicagel đã được hoạt hoá

 Cơ chế phân bố giữa pha tĩnh và pha động như trong trường hợp silicagel ghép pha đảo

 Cơ chế trao đổi ion với các hạt pha tĩnh trao đổi ion

 Để tiến hành có kết quả tốt trong HPLC điều quan trọng là phải hiểu thấu đáo về bản chất các thành phần của hệ sắc ký gồm:

 Chất tan ( chất cần phân tích),

 Lực tương tác phân tử đƣợc mô tả một cách định tính chính là độ phân cực tương đối của ba thành phần này

 Chất cần phân tích có độ phân cực tăng lên theo các nhóm chức:

Hydrocarbon < ether < ester < Cetone < aldhehyde < amide < amine < Alcohol< H 2 O

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 2

 Độ nhạy, độ chính xác cao

 Áp dụng cho hầu hết các hợp chất không bay hơi chịu nhiệt hay dễ bị phân hủy bởi nhiệt, …

 Giảm thời gian sắc ký,

II I I- - CÁ C Á C C T TH H ÀN À N H H P PH HẦ Ầ N N C CƠ Ơ B B ẢN Ả N C CỦ ỦA A H HP PL LC C

A BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐỘNG

 Dùng loại thủy tinh trung tính , rửa sạch có thể tích từ 100ml  2 lít

 Dùng bình thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy cảm với ánh sáng

 Dùng nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi

 Bình đƣợc gắn với một ống bằng polytetrafluoroetylen (d=1-3mm) để dẫn pha động từ bình chứa đến bơm:

 Các chất lỏng vào bơm không chứa bụi hay tiểu phân khác vì chúng len lỏi vào các mối hàn gây hại cho bơm và làm nghẽn cột

 Pha động phải được lọc trước khi vào bơm bằng màng lọc thép không gỉ được nhấn khít vào bề mặt của ống polytetrafluoroethylen đặt trong bình chứa

2- Xử lý dung môi động a Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi

 Dung môi là nước : cellulose nitrat hay cellulose acetat kích thước 0,45 và 0,22

 Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước : RC (regenerated cenlulose) hay polyamid nylon

 Dung môi hữu cơ : lọc qua màng lọc teflon b Đầu lọc dung môi

Kích thước thường gặp của các mẫu là từ 5 đến 10μm, vì vậy cần thực hiện vệ sinh định kỳ Quy trình vệ sinh bao gồm ngâm mẫu trong dung dịch acid nitric 5% hoặc methanol, sau đó sử dụng máy siêu âm trong khoảng 15 phút và rửa lại bằng nước cất đã được lọc qua màng lọc 0,45μm Cuối cùng, cần đuổi khí dung môi để đảm bảo chất lượng mẫu.

 Lọc dưới áp suất giảm

 Đuổi khí dung môi bằng siêu âm (Ultrasonic)

 Đuổi khí dung môi bằng sạc khí helium d Nước rửa cột HPLC

 là nước cất hai lần , phải lọc qua màng lọc 0,45m và đƣợc đánh siêu âm để đuổi khí hoà tan hay khí dưới dạng treo (sức kháng trở 18MΩ)

B BỘ PHẬN KHỬ KHÍ DUNG MÔI (DEGASSER)

 Là bộ phận quan trọng để loại khí ngay trong bình chứa dung môi hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi dung môi vào bơm

 Kỹ thuật khử khí dung môi với Degasser in line là kỹ thuật rẻ tiền so với kỹ thuật sục khí helium

Dung môi sẽ được xử lý qua hệ thống khử khí thông qua màng tổng hợp nhựa đặc biệt Các khí hòa tan trong dung môi có ái lực và linh độ cao hơn với màng này so với các phân tử dung môi lỏng, do đó, khí sẽ được đuổi ra ngoài hệ thống.

 Chất lỏng đƣợc khử khí

 Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000psi (1psi=0.068atm, 1bar.7psi)

 Chịu đƣợc tác động của nhiều dung môi

 Đảm bảo lƣợng lặp lại 0.01-10ml/phút

 Hút pha động vào thân bơm

 Đẩy pha động từ thân bơm vào cột sắc ký b Thân bơm

 Có 1 pisston chuyển động qua lại

 Khi pisston tiến tới 1 bi đóng lỗ phía cột lại và bi khác nhấc ra để pha động vào thân bơm

 Khi pisston lùi lại, 1 bi đóng lỗ phía bình đựng dung môi và mở lỗ phía cột để pha động vào cột sắc ký

3- Phân loại a Bơm đẳng dòng (isocratic pump)

 Chỉ lấy đƣợc một loại dung môi không tự động pha trộn đƣợc dung môi

 Không tăng tốc độ dòng đột ngột

 Theo dõi áp suất bơm trong quá trình phân tích

 Định kỳ rửa lọc dung môi đầu vào

Để ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc, hãy nạp đầy hệ thống HPLC bằng methanol, acetonitril hoặc hỗn hợp của chúng với nước khi không tiến hành phân tích Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump) là một phần quan trọng trong quy trình này.

 Lấy đồng thời 4 loại dung môi động

 Chạy được chương trình dung môi (gradient) một cách uyển chuyển và đa dạng

 c Bơm có áp suất không đổi

 d Bơm có lưu lượng hằng định

 Di chuyển đơn giản (ống tiêm) có lưu lượng thường không đổi, áp suất không đổi

 Thân bơm có thể tích nhỏ

 Phải làm đầy pha động thường xuyên

+ Áp suất không đổi và hằng định

+ Lưu lượng không đổi; có thể điều chỉnh bằng motơ

+ Thể tích không bị giới hạn

4- Lưu ý khi sử dụng bơm nhị phân và bơm tứ phân

 Tương tự như bơm đẳng dòng

 Phối hợp dung môi hợp lý tránh kết tủa chất điện giải trên đƣợng ống

 Dùng dung môi trung gian một cách hợp lý khi phối hợp dung môi

 Cân bằng cột bằng hỗn hợp dung môi – nước với tỷ lệ tương tự hỗn hợp dung môi đệm

Sau khi hoàn tất quá trình phân tích, cần rửa kỹ đường ống chứa đệm bằng nước, sau đó tiếp tục rửa bằng hỗn hợp dung môi ethanol hoặc acetonitril với nước.

 Không làm xáo trộn chất nhồi trong cột khi đưa mẫu thử vào cột

1- Phương pháp sử dụng syringe trực tiếp a Đặc điểm, cấu trúc

 Tiêm chính xác đến l để tiêm mẫu qua cột vách ngăn tự liền bằng cao su, Teflon, silicone

 Không tương kị với pha động của hệ thống sắc ký

 Không chứa chất dẻo hóa, chất chống oxy hóa b Ưu điểm

 Tiện lợi, đơn giản, hiệu lực cao

 Hạn chế thể tích ngoài cột c Nhược điểm

 Độ lặp lại không cao vì thể tích mỗi lần bơm khác nhau

 Ngƣng dòng chảy khi mỗi lần đƣa mẫu vào cột, đợi đến khi áp suất bằng áp suất không khí rồi mới thêm

2- Phương pháp sử dụng van bơm - Kiểu van loop a Đặc điểm

 Dùng dưới áp suất cao và tự động hóa được (autosampler)

Van tiêm mẫu hoạt động hiệu quả dưới áp suất cao, được trang bị một loop với các thể tích cố định (10, 20, 30, 50 µl) để đảm bảo mẫu được đưa vào cột một cách đồng nhất.

 Lượng mẫu bơm vào thường nhiều hơn lượng cần thiết (10-100l) b Ưu điểm

 Hệ thống bơm có thể làm việc dưới áp suất cao mà không bị gián đoạn dòng chảy nhờ trang bị một loop có thể tích hằng định

 Không bị tắt, bị bẩn do các mảnh đệm ngăn (septum)

 Loại bỏ sai số mỗi lần tiêm của loại syringe thẳng vào cột

 Tự động hóa đƣợc (autosampler)

3- Bơm mẫu tự động (Autosampler) a Đặc điểm

  Cũng là phương pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng van bơm với thể tích xác định

 Nhưng hệ thống này sẽ tự động bơm mẫu sau khi cài đặt chương trình điều khiển với thể tích bơm mẫu có thể thay đổi 1-100l b Ưu điểm

 Có thể tự động hóa đƣợc

1- Tiền cột (pre-column, guard column, scavenger column)

 Hấp phụ, giữ lại các tiểu phân tạp kích thước nhỏ có thể sẽ gây nghẹt hay phá hủy cột sắc ký nhằm kéo dài tuổi thọ cột

 Cột bảo vệ có tác dụng bão hòa pha động với pha tĩnh làm cho sự mất dung môi là tối thiểu

 Cấu tạo chất nhồi cột bảo vệ giống như cột phân tích nhƣng kích thước hạt lớn hơn một ít, làm áp suất hệ thống tăng lên 200-300psi

 Thường 3 tháng phải thay tiền cột hay áp suất cao hơn áp suất lịch sử 50%

 Thép không rỉ hay thủy tinh đặc biệt a Cột phân tích

 Thường dùng: 15 hay 25 cm x 4 – 6 mm, 5 m, H = 40000 – 60000 đĩa/mét

 Hiện nay: 5 – 10 cm x 1 – 4.6 mm, 1.7 m, H = 100.000 đĩa/mét  tiêu tốn ít dung môi và giảm thời gian phân tích

Chất nhồi cột sắc ký lỏng được sản xuất từ silica (SiO2) thông qua quá trình kết tụ các hạt silica, tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn với đường kính đồng đều.

 Các hạt silica gel đƣợc hình thành đƣợc bao bởi lớp mỏng hữu cơ liên kết hóa học và vật lý với bề mặt

 Ngoài ra còn sử dụng chất nhồi cột khác nhƣ: oxyd nhôm, polymer xốp, nhựa trao đổi ion, … tùy vào loại hình sắc ký

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 9 b Cột bán điều chế (semi - preparative column)

 Kích thước chất nhồi cột: 10-50m

 Tách 100-200mg mẫu thử để phân lập các chất c Cột chế hóa – cột điều chế (preparative column)

 Cột trao đổi ion, cột rây phân tử

 Có thể tác 0.5-1g mẫu thử Quy mô công nghiệp có thể đạt tải lƣợng lên đến hàng kg mẫu thử

 Chất tan đi qua đầu dò  tạo những tín hiệu điện

 Sự thay đổi về độ lớn vật lý chất tan sẽ chuyển thành xung điện và đọc đƣợc trên máy ghi

 Sự đáp ứng đầu dò tỷ lệ với lƣợng chất tan, lặp lại và độc lập với chất rửa giải

 hấp thụ uv-vis, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn, khuếch tán ánh sáng…

 Đáp ứng rộng rãi đối với các mẫu cần phân tích

 Không quá nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt, ẩm, tốc độ pha động, …

 Không phá hỏng mẫu thử

 Vận hành dễ, liên tục, giá thành rẻ

2- Phân loại a Đầu dò quang phổ kế khả kiến và tử ngoại (detector UV-Vis)

 Phổ biến nhất hiện nay trong định lượng thường qui

Nguyên tắc của phương pháp này là pha động chứa chất phân tích được rửa giải từ cột, đi qua tế bào đo và hấp thụ năng lượng bức xạ UV-Vis Chất phân tích thường có cấu trúc không no hoặc có màu sắc đặc trưng, giúp xác định nồng độ và tính chất của chúng trong mẫu.

 Sự hấp thu bức xạ này bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer

 Dung môi dùng trong trường hợp này không hấp thu hay hấp thu rất ít tại bước sóng phân tích; chứa tạp chất cực nhỏ

-ii- Cấu tạo một) Nguồn ánh sáng đơn sắc (Source of monochromatic light)

 Đèn kết hợp với kính lọc hay đèn kết hợp bộ tạo ánh sáng đơn sắc

 Cho phép chọn 1 bước sóng từ đèn nguồn phát ra ánh sáng trên 1 vùng dải bước sóng rộng hai) Flow cell

Cửa sổ của thiết bị được làm từ thủy tinh quartz, bao quanh hai đầu ống hình trụ có đường kính 1mm và chiều dài 1cm Bộ phận này có chức năng đo sự thay đổi cường độ ánh sáng khi ánh sáng đi qua Flow cell.

 Là diod quang (photodiode) hay ống nhân quang (photomultiplier tube)

 Tín hiệu từ diode quang hay ống nhân quang đƣợc khuếch đại và truyền tới máy ghi

(Recorder), Interrator hay máy vi tính

Peak trên sắc ký đồ phản ánh sự đáp ứng của các thành phần có thể được tách ra khi rửa giải khỏi cột sắc ký Chiều cao và diện tích của peak tương ứng với từng thành phần cho phép xác định nồng độ thông qua việc so sánh với peak từ mẫu chuẩn có cùng hoạt chất.

 Độ nhạy cao (3ng/ml), giá thành không quá cao, dễ vận hành

 Ít phụ thuộc vào các thay đổi điều kiện (nhiệt độ, tốc độ dòng )

 Đòi hỏi dung môi phù hợp và tinh khiết

 Chọn lọc các chất tan hấp thu trong vùng Uv-vis

 Độ nhạy thấp hơn UV-Vis

 b Đầu dò dãy diode quang PDAD (Photo-Diode Array Detector)

 Phát triển từ UV-Vis

 Sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu [phòng RD]

 Tia đa sắc sau khi qua tế bào đo đƣợc đƣa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc rồi đi đến một dãy diod quang

 Mỗi một diod với một băng có độ dài sóng hẹp phát hiện sự hấp thu ở một bước sóng nhất định

 Toàn bộ dãy diod [1024 con diode] đƣợc quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý

 Thu đƣợc phổ UV-Vis của pic

 Có thể nhìn toàn thang sóng (maxplot)

 Phát hiện đồng thời chất được phân tích ở nhiều bước sóng khác , cung cấp thông tin về phổ uv-vis của một peak

 Xác định bước sóng hấp thụ tối đa của một chất

 Phát hiện tạp chất, chất gây nhiễu [biến đổi của thuốc] ở bước sóng thấp hơn không đặc trƣng

 Cung cấp thông tin vầ độ tinh khiết của peak

 % tinh khiết peak [có phải đó chỉ là 1 đỉnh?]

 Cung cấp phổ 3D [độ hấp thu, thời gian lưu, bước sóng] giúp cho việc chọn bước sóng phân tích tối ƣu cho định lƣợng, định danh chất phân tích

 Cung cấp phổ UV-Vis của một peak, định danh peak

 [đo NMR phải tinh khiết 95%]

 [vanillin sulfuric dùng để phát hiện tạp nối đơn]

 Độ nhạy kém hơn đầu dò UV-Vis thông thường

 Không tách đƣợc các đồng phân quang học

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 13 c Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi ELSD (Evaporative light scattering detector)

-i- Hoạt động một) Giai đoạn 1: phun sương

 Dung dịch rửa giải được phun sương

 Hình thành hạt phân tán hai) Giai đoạn 2:

 Hạt phân tán đi qua buồng nhiệt

 Pha động bốc hơi khỏi hạt

 Phân lập chất phân tích thành những giọt nhỏ ba) Giai đoạn 3:

 Chất phân tích đƣợc chiếu chùm tia laser của đèn nguồn và gây tán xạ ánh sáng

 Ánh sáng khuếch tán đƣợc giữ lại bởi ống nhân quang hay diode quang và chuyển thành tín hiệu điện tỉ lệ với lƣợng chất tan

 Phát hiện tất cả các hợp chất có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động

 Sự bay hơi của pha động

 Độ nhạy cao ( ng/ml )

 Khảo sát đường và những chất có áp suất hơi yếu

 [rất sạch tạp, sắc ký rõ đẹp]

 Sử dụng với pha động dễ bay hơi

 Mẫu phân tích có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 14 d Đầu dò khúc xạ kế vi sai RI (Refractive Index detector)

 Dựa trên sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ của pha động và pha động có lẫn chất tan sau quá trình tách qua sắc ký cột

 Là loại thứ 2 đƣợc dùng phổ biến làm detector trong HPLC phân tích, rây phân tử

 Là detector vạn năng do có khả năng phát hiện hầu hết các chất tan (đường, glycoside no, …)

 Rất bền và rất nhạy

 Độ nhay kém hơn UV-Vis

 Phụ thuộc nhiều vào sự thay đổi thành phần của pha động nên thường không sử dụng khi cần gradient hóa dung môi

 Các máy HPLC phải đƣợc trang bị bộ phận điều nhiệt giữ cho độ biến thiên nhiệt độ của hệ thống khoảng ±0.5 o C

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 15 e Đầu dò huỳnh quang FD (Fluorecence detector)

 Cột sắc ký : RP-LC 18 (25 cm x 4,6 mm, 5 μm

 Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

 Bước sóng/FD: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm

 [chất phát huỳnh quang đƣợc khi có nhiều nối đôi liên hợp, cồng kềnh], tách đẹp hơn ELS

 Phát hiện huỳnh quang cho:

 Khả năng tăng độ nhạy hang nghìn lần so với phát hiện bằng đo độ hấp thu

 Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bước sóng khác biệt làm giảm đi các peak gây nhiễu

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 16 f Đầu dò điện hóa ED (Electrochemical detector)

 Rất nhạy, dùng rộng rãi

 Giới hạn phát hiện: 1pg/ml g Đầu dò đo độ dẫn CD (conductivity detector)

 Khảo sát ion và hợp chất có thể ion hóa

 Giới hạn phát hiện: 0.2% của sự sai lệch độ dẫn h Đầu dò khối phổ MSD (Mass spectroscopy detector)

 [mạnh nhất: sắc ký lỏng ghép khối phổ thời gian bay]

 Giới hạn phát hiện: cực nhỏ,

 Đắt tiền, lĩnh vực áp dụng rộng rãi

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 18 i Đầu dò đo cường độ xung PAD (Pulsed Amperometry Detector)

 Hệ thống gồm 3 điện cực:

 Điện cực bề mặt nhỏ làm bằng thủy tinh hay vàng

3- Tóm tắt tính năng sử dụng các đầu dò trong HPLC

Detector Sử dụng Giới hạn phát hiện Chú ý Ưu điểm Nhược điểm

g/ml điều kiện nhiệt độ, độ ẩm

 Là detector vạn năng do có khả năng phát hiện hầu hết các chất tan

 Rất bền và rất nhạy

 Độ nhạy kém hơn UV-Vis

 Phụ thuộc nhiều vào sự thay đổi thành phần của pha động nên thường không sử dụng khi cần gradient hóa dung môi

 Các máy HPLC phải đƣợc trang bị bộ phận điều nhiệt giữ cho độ biến thiên nhiệt độ của hệ thống khoảng ±0.5 o C

Chọn lọc  3ng/ml sử dụng nhiều nhất trong phân tích thường qui

 Độ nhạy cao (3ng/ml), giá thành không quá cao, dễ vận hành

 Ít phụ thuộc vào các thay đổi điều kiện (nhiệt độ, tốc độ dòng )

 Đòi hỏi dung môi phù hợp và tinh khiết

 Chọn lọc các chất tan hấp thu trong vùng

 Độ nhạy thấp hơn UV-

Dùng nhiều trong nghiên cứu

 Phát hiện đồng thời chất được phân tích ở nhiều bước sóng khác , cung cấp thông tin về phổ uv-vis của một peak

 Xác định bước sóng hấp thụ tối đa của một chất

 Phát hiện tạp chất, chất gây nhiễu ở bước sóng thấp hơn không đặc trƣng

 Cung cấp thông tin vầ độ tinh khiết của peak

 Cung cấp phổ 3D [độ hấp thu, thời gian lưu, bước sóng] giúp cho việc chọn bước sóng phân tích tối ƣu cho định lƣợng, định danh chất phân tích

Vis của một peak, định danh peak

 Độ nhạy kém hơn đầu dò

 Không tách đƣợc các đồng phân quang học

FD Chọn lọc  8 pg/ml

 Phát hiện huỳnh quang cho:

 Khả năng tăng độ nhạy hang nghìn lần so với phát hiện bằng đo độ hấp thu

 Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bước sóng khác biệt làm giảm đi các peak gây nhiễu

Chọn lọc  1 pg/ml Nhạy cao, dùng rộng rãi

CD Chọn lọc  1 pg/ml Hợp chất có thể ion hóa

EL SD Chọn lọc  1 ng đối với glucose

Nhiệt độ bay hơi chất phân tích thấp hơn pha động

 Phát hiện tất cả các hợp chất có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động

 Sự bay hơi của pha động

 Độ nhạy cao ( ng/ml )

 [rất sạch tạp, sắc ký rõ đẹp]

 Sử dụng với pha động dễ bay hơi

 Mẫu phân tích có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động

MS Vạn năng fg/ml đắt tiền, áp dụng mọi lĩnh vực

II I II I- - CÁ C Á C C T TH H ÔN Ô N G G S SỐ Ố ĐẶ Đ ẶC C T TR R Ư Ư NG N G T TR RO O NG N G H HP PL LC C

 Hệ số bất đối (AF)

A TỐC ĐỘ DI CHUYỂN CỦA CÁC CHẤT

1- Tốc độ di chuyển của một chất

Hệ số phân bố giữa hai pha của một chất được đặc trưng bởi các đại lượng liên quan đến sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh, bao gồm thời gian lưu và thể tích lưu Thời gian lưu (Retention time) là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình này.

Thời gian lưu (t R) là khoảng thời gian tính từ khi mẫu được tiêm vào cột cho đến khi tín hiệu đạt đến detector Thời gian lưu càng lớn, chất tan sẽ bị giữ lại mạnh mẽ hơn, dẫn đến tốc độ di chuyển của nó càng chậm.

Thời gian chết (t M (t 0 )) đề cập đến khoảng thời gian mà một chất không bị giữ lại trong môi trường, tức là tốc độ của nó tương đương với tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi.

 t R ’: là thời gian lưu tương đối

 V R ’: thể tích lưu tương đối

 V M thể tích chết của cột = V 0 : thể tích rỗng là thể tích dung môi từ nơi tiêm trong cột đến đầu dò c Hệ số dung lượng k’(capacity factor)

 V M , V S : là thể tích pha tĩnh, pha động

 k’: bản chất các pha, chất tan, nhiệt độ, pH

 k’>8: thời gian phân tích quá dài

 k’ 1

  càng lớn thì 2 chất càng tách khỏi nhau; nếu  quá lớn thì thời gian tách càng kéo dài

 Nếu chỉ dựa vào  thì không biết hiệu lực tách của quá trình sắc ký

B HÌNH DẠNG- SỰ ĐỐI XỨNG CỦA PIC

 Dạng pic sắc ký có tính đối xứng nhƣ phân bố Gauss là dạng lý tưởng

 Pic thường bị dãn ra và chỉ gần đối xứng ; để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối

 Hệ số bất đối (asymmetrical factor) :

 BC: nửa chiều rộng phía sau của pic được đo ở 1/10 chiều cao của peak

 AC: nửa chiều rộng phía trước của pic được đo ở 1/10 chiều cao của peak

 Khi A f càng tăng thì hiện tượng kéo đuôi (tailing peak) càng rõ do:

 tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh

 Đỉnh kéo tuyến trước (fronting peak) có thể lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột

 Khi A f của đỉnh càng gia tăng  tính tương thích và độ chính xác kém tin cậy hơn

C HIỆU LỰC CỘT- SỐ ĐĨA LÝ THUYẾT

 Hiệu lực cột là thông số về hiệu lực tách của cột, đƣợc biểu thị bằng 2 thông số:

 Chiều cao đĩa lý thuyết H

 N: số đĩa lý thuyết của cột

 H: chiều cao đĩa lý thuyết (0.03-1mm)

 W B : chiều rộng của peak ở đáy peak

 W 1/2 : chiều rộng của peak đo ở nữa chiều cao

 Hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp, không dãn rộng)  N càng lớn  H càng nhỏ 

W B nhỏ (độ dãn peak nhỏ)

 d p : đường kính hạt pha tĩnh (m)

  Kích thước hạt càng nhỏ  Số đĩa lý thuyết càng lớn  Hiệu lực cột càng tăng  N > 1500

D ĐỘ PHÂN GIẢI – HỆ SỐ TÁCH CỘT (RESOLUTION)

 Độ phân giải là đại lƣợng đo mức độ tách 2 chất trên 1 cột sắc ký

 Độ phân giải R S thể hiện:

 Độ nhọn của đỉnh (hiệu lực cột, column efficacy)

 Khoảng cách giữa các đỉnh (hiệu lực dung môi, sonvent efficacy)

 R s = 0,75: hai peak không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

 R s = 1,0: hai peak tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

 R s = 1,5: hai peak tách hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%)

+ Cột dài hơn (áp suất, thời gian và độ rộng của peak cũng tăng theo)

+ Giảm tốc độ dòng pha động

 Tăng hệ số dung lượng k' B :

+ thay đổi thành phần pha động trong sắc ký lỏng

+ tăng nhiệt độ đối với sắc ký khí

+ Nếu k B ’ tăng nhiều thì tăng thời gian phân tích (1

Tiêu đề	Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tác giả	Trần Trung Trực
Trường học	Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành	Hóa phân tích
Thể loại	Đề tài tốt nghiệp
Năm xuất bản	2023
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	36
Dung lượng	6,79 MB

SẮC ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

V - MỤ M ỤC C L LỤ ỤC C I- ĐỊNH NGHĨA

Lịch sử

Các khái niệm

Dựa vào diện tích peak

Chế phẩm đa thành phần