SẮC ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

 Do vậy phải dùng một bơm có áp suất cao high pressure  300atm để đẩy pha động Mobile Phase MP qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh High Performance

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

I- ĐỊNH NGHĨA

1- Lịch sử

 Năm 1967- 1968: Huber, Hulsman, Giddinngs đã công bố phương pháp sắc ký lỏng mới

có tên là SK lỏng tốc độ cao (HSLC), hiệu lực cao (HELC) và ngày nay mang tên chính thức là

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2- Các khái niệm

 HPLC hay Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi

đầy bằng các hạt có kích thước 10m

 Là phương tiện định tính, định lượng hiệu quả trong các Dược điển hiện đại UPS, BP, EP,

… trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích hóa hợp chất tự nhiên

 Do vậy phải dùng một bơm có áp suất cao (high pressure)  300atm để đẩy pha động

(Mobile Phase) MP qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh

(High Performance) một lượng mẫu nhỏ cỡ 20g

 Quá trình cho chất lỏng đi qua cột gọi là sự rửa giải (ELUTION)

 Trong quá trình này, chất tan được vận chuyển trong môi trường phân tách bằng một

dòng chất lỏng hay chất khí được gọi là chất rửa giải (ELUANT)

 Dung dịch sau khi qua cột có chứa chất tan được gọi là dung dịch rửa giải (ELUATE)

 Pha tĩnh có thể tác động lên chất tan bằng:

 Cơ chế hấp phụ như trong trường hợp của oxyt nhôm, silicagel đã được hoạt hoá

 Cơ chế phân bố giữa pha tĩnh và pha động như trong trường hợp silicagel ghép pha

đảo

 Cơ chế trao đổi ion với các hạt pha tĩnh trao đổi ion

 Để tiến hành có kết quả tốt trong HPLC điều quan trọng là phải hiểu thấu đáo về bản chất

 Chất cần phân tích có độ phân cực tăng lên theo các nhóm chức:

Hydrocarbon < ether < ester < Cetone < aldhehyde < amide < amine < Alcohol< H 2 O



3- Ưu điểm vượt trội

 Độ nhạy, độ chính xác cao

 Áp dụng cho hầu hết các hợp chất không bay hơi chịu nhiệt hay dễ bị phân hủy bởi nhiệt, …

 Giảm thời gian sắc ký,

 Giảm kích thước hạt,

 Tăng độ phân giải, …

II- CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA HPLC

A BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐỘNG

1- Đặc điểm, tính chất

 Dùng loại thủy tinh trung tính, rửa sạch có thể tích từ 100ml  2 lít

 Dùng bình thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy cảm với ánh sáng

 Dùng nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi

 Bình được gắn với một ống bằng polytetrafluoroetylen (d=1-3mm) để dẫn pha động từ

bình chứa đến bơm:

 Các chất lỏng vào bơm không chứa bụi hay tiểu phân khác vì chúng len lỏi vào các mối hàn gây hại cho bơm và làm nghẽn cột

 Pha động phải được lọc trước khi vào bơm bằng màng lọc thép không gỉ được nhấn

khít vào bề mặt của ống polytetrafluoroethylen đặt trong bình chứa



2- Xử lý dung môi động

a Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi

 Dung môi là nước: cellulose nitrat hay cellulose acetat kích thước 0,45 và 0,22

 Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước: RC (regenerated cenlulose) hay polyamid nylon

 Dung môi hữu cơ: lọc qua màng lọc teflon

b Đầu lọc dung môi

 Thường có kích thước 5  10m cần phải thường xuyên làm vệ sinh (ngâm trong dung

dịch acid nitric 5% hoặc methanol+ đánh siêu âm khoảng 15’, rửa lại bằng nước cất đã được

lọc qua màng lọc 0,45m) [lọc chân không]

c Đuổi khí dung môi

 Lọc dưới áp suất giảm

 Đuổi khí dung môi bằng siêu âm (Ultrasonic)

 Đuổi khí dung môi bằng sạc khí helium

d Nước rửa cột HPLC

 là nước cất hai lần, phải lọc qua màng lọc 0,45m và được đánh siêu âm để đuổi khí hoà tan hay khí dưới dạng treo (sức kháng trở 18MΩ)

B BỘ PHẬN KHỬ KHÍ DUNG MÔI (DEGASSER)

 Là bộ phận quan trọng để loại khí ngay trong bình chứa dung môi hoặc trên dòng chảy

của pha động trước khi dung môi vào bơm

 Kỹ thuật khử khí dung môi với Degasser in line là kỹ thuật rẻ tiền so với kỹ thuật sục khí

helium

 Dung môi qua hệ thống khử khí sẽ qua màng tổng hợp nhựa đặc biệt, những khí hòa

tan trong dung môi có ái lực và linh độ cao hơn với màng này so với các phân tử dung môi lỏng

vì thế khí được đuổi ra ngoài hệ thống

 Chất lỏng được khử khí

C BƠM (PUMP)

1- Đặc điểm

 Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000psi (1psi=0.068atm, 1bar=14.7psi)

 Chịu được tác động của nhiều dung môi

 Đảm bảo lượng lặp lại 0.01-10ml/phút

2- Cấu tạo

a Đầu bơm

 Hút pha động vào thân bơm

 Đẩy pha động từ thân bơm vào cột sắc ký

b Thân bơm

 Có 1 pisston chuyển động qua lại

 Khi pisston tiến tới 1 bi đóng lỗ phía cột lại và bi khác nhấc ra để pha động vào thân bơm

 Khi pisston lùi lại, 1 bi đóng lỗ phía bình đựng dung môi và mở lỗ phía cột để pha động

 Theo dõi áp suất bơm trong quá trình phân tích

 Định kỳ rửa lọc dung môi đầu vào

 Nạp đầy hệ thống HPLC bằng methanol, acetonitril hay hỗn

hợp của chúng với nước khi không tiến hành phân tích để tránh nấm

mốc phát triển

b Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump)

 Lấy đồng thời 4 loại dung môi động

 Chạy được chương trình dung môi (gradient) một cách uyển chuyển và đa dạng

 Tiết kiệm dung môi





c Bơm có áp suất không đổi

 Áp suất không đổi

 Lưu lượng thay đổi



d Bơm có lưu lượng hằng định

 Di chuyển đơn giản (ống tiêm) có lưu lượng

thường không đổi, áp suất không đổi

+ Lưu lượng không đổi

+ Áp suất thay đổi

+

 Bơm 2 pisston:

+ Áp suất không đổi và hằng định

+ Lưu lượng không đổi; có thể điều chỉnh bằng motơ

+ Thể tích không bị giới hạn

+

4- Lưu ý khi sử dụng bơm nhị phân và bơm tứ phân

 Tương tự như bơm đẳng dòng

 Phối hợp dung môi hợp lý tránh kết tủa chất điện giải trên đượng ống

 Dùng dung môi trung gian một cách hợp lý khi phối hợp dung môi

 Cân bằng cột bằng hỗn hợp dung môi – nước với tỷ lệ tương tự hỗn hợp dung môi đệm

 Rửa kĩ đường ống chứa đệm bằng nước sau khi kết thúc quá trình phân tích, sau đó rửa lại bằng hỗn hợp dung môi ethanol hay acetonitril với nước

D BỘ PHẬN TIÊM MẪU

 Không làm xáo trộn chất nhồi trong cột khi đưa mẫu thử vào cột

1- Phương pháp sử dụng syringe trực tiếp

a Đặc điểm, cấu trúc

 Tiêm chính xác đến l để tiêm mẫu qua cột vách ngăn tự liền bằng cao su, Teflon, silicone

 Không tương kị với pha động của hệ thống sắc ký

 Chịu áp suất cao

 Không chứa chất dẻo hóa, chất chống oxy hóa

2- Phương pháp sử dụng van bơm - Kiểu van loop

a Đặc điểm

 Hay sử dụng

 Thể tích thay đổi: 5 – 100 l

 Dùng dưới áp suất cao và tự động hóa được (autosampler)

 Van tiêm mẫu có thể hoạt động dưới áp suất cao và được trang bị một loop có thể tích nhất định chứa mẫu

(loop: 10, 20, 30, 50  l) được đưa vào cột lúc nào cũng hằng định

 Lượng mẫu bơm vào thường nhiều hơn lượng cần thiết (10-100  l)

 Cũng là phương pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng van bơm với thể tích xác định

 Nhưng hệ thống này sẽ tự động bơm mẫu sau khi cài đặt chương trình điều khiển với thể

tích bơm mẫu có thể thay đổi 1-100l

b Ưu điểm

 Độ lặp lại cao

 Độ chính xác cao

 Có thể tự động hóa được

E CỘT SẮC KÝ

1- Tiền cột (pre-column, guard column, scavenger column)

 Hấp phụ, giữ lại các tiểu phân tạp kích thước nhỏ có thể sẽ gây nghẹt hay phá hủy cột sắc ký nhằm kéo dài tuổi thọ cột

 Cột bảo vệ có tác dụng bão hòa pha động với pha tĩnh làm cho sự mất dung môi là tối

thiểu

 Cấu tạo chất nhồi cột bảo vệ giống như cột phân tích nhưng kích thước hạt lớn hơn một

ít, làm áp suất hệ thống tăng lên 200-300psi

 Thường 3 tháng phải thay tiền cột hay áp suất cao hơn áp suất lịch sử 50%

 Hiện nay: 5 – 10 cm x 1 – 4.6 mm, 1.7 m, H = 100.000 đĩa/mét  tiêu tốn ít dung môi

và giảm thời gian phân tích

 Chất nhồi cột sắc ký lỏng được chế tạo từ silica (SiO2) bằng cách làm kết tụ các hạt silica

để tạo thành hạt có kích thước lớn hơn có đường kính đều nhau

 Các hạt silica gel được hình thành được bao bởi lớp mỏng hữu cơ liên kết hóa học và vật lý

với bề mặt

 Ngoài ra còn sử dụng chất nhồi cột khác như: oxyd nhôm, polymer xốp, nhựa trao đổi

ion, … tùy vào loại hình sắc ký



b Cột bán điều chế (semi - preparative column)

 Chất tan đi qua đầu dò  tạo những tín hiệu điện

 Sự thay đổi về độ lớn vật lý chất tan sẽ chuyển thành xung điện và đọc được trên máy ghi

 Sự đáp ứng đầu dò tỷ lệ với lượng chất tan, lặp lại và độc lập với chất rửa giải

 hấp thụ uv-vis, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn, khuếch tán ánh sáng…

 Detector lý tưởng

 Độ nhạy cao (< 1μg/ml)

 Độ lặp lại cao

 Đáp ứng rộng rãi đối với các mẫu cần phân tích

 Không quá nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt, ẩm, tốc độ pha động, …

 Phổ biến nhất hiện nay trong định lượng thường qui

 Nguyên tắc: pha động chứa chất phân tích được rửa giải từ cột đi ngang qua tế bào đo sẽ

hấp thụ năng lượng bức xạ UV-Vis; chất phân tích có cấu trúc không no hay có màu

 Sự hấp thu bức xạ này bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer

 Dung môi dùng trong trường hợp này không hấp thu hay hấp thu rất ít tại bước sóng phân

tích; chứa tạp chất cực nhỏ

-ii- Cấu tạo

một) Nguồn ánh sáng đơn sắc (Source of monochromatic light)

 Đèn kết hợp với kính lọc hay đèn kết hợp bộ tạo ánh sáng đơn sắc

 Cho phép chọn 1 bước sóng từ đèn nguồn phát ra ánh sáng trên 1 vùng dải bước sóng

rộng

 Kiểu hình chữ “Z”

 Cửa sổ là thủy tinh quartz bao lấy 2 đầu ống hình trụ có đường kính 1mm và dài 1cm

 Là diod quang (photodiode) hay ống nhân quang (photomultiplier tube)

 Tín hiệu từ diode quang hay ống nhân quang được khuếch đại và truyền tới máy ghi

(Recorder), Interrator hay máy vi tính

 Peak trên sắc ký đồ biểu thị cho sự đáp ứng với các thành phần có thể dùng chúng được

khi rửa giải khỏi cột sắc ký Chiều cao peak hay diện tích peak của từng thành phần có thể dùng

để xác định nồng độ khi đối chiếu với peak thu được từ việc tiêm mẫu chuẩn có cùng hoạt chất

-iii- Ưu điểm

 Độ nhạy cao (3ng/ml), giá thành không quá cao, dễ vận hành

 Ít phụ thuộc vào các thay đổi điều kiện (nhiệt độ, tốc độ dòng )

-iv- Nhược điểm

 Đòi hỏi dung môi phù hợp và tinh khiết

 Chọn lọc các chất tan hấp thu trong vùng Uv-vis

 Độ nhạy thấp hơn UV-Vis



b Đầu dò dãy diode quang PDAD (Photo-Diode Array Detector)

-i- Đặc điểm

 Phát triển từ UV-Vis

 Sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu [phòng RD]

 Tia đa sắc sau khi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc

rồi đi đến một dãy diod quang

 Mỗi một diod với một băng có độ dài sóng hẹp phát hiện sự hấp thu ở một bước sóng nhất

định

 Toàn bộ dãy diod [1024 con diode] được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý

 Thu được phổ UV-Vis của pic

 Có thể nhìn toàn thang sóng (maxplot)





-ii- Ưu điểm

 Phát hiện đồng thời chất được phân tích ở nhiều bước sóng khác, cung cấp thông tin về

phổ uv-vis của một peak

 Xác định bước sóng hấp thụ tối đa của một chất

 Phát hiện tạp chất, chất gây nhiễu [biến đổi của thuốc] ở bước sóng thấp hơn không đặc trưng

 Cung cấp thông tin vầ độ tinh khiết của peak

 % tinh khiết peak [có phải đó chỉ là 1 đỉnh?]

 Cung cấp phổ 3D [độ hấp thu, thời gian lưu, bước sóng] giúp cho việc chọn bước sóng phân

tích tối ưu cho định lượng, định danh chất phân tích

 Cung cấp phổ UV-Vis của một peak, định danh peak

 [đo NMR phải tinh khiết 95%]

 [vanillin sulfuric dùng để phát hiện tạp nối đơn]

-iii- Nhược điểm

 Độ nhạy kém hơn đầu dò UV-Vis thông thường

 Không tách được các đồng phân quang học





c Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi ELSD (Evaporative light scattering detector)

 Hạt phân tán đi qua buồng nhiệt

 Pha động bốc hơi khỏi hạt

 Phân lập chất phân tích thành những giọt nhỏ

được giữ lại bởi ống nhân

quang hay diode quang và

chuyển thành tín hiệu điện tỉ lệ với lượng chất

tan

-ii- Ưu điểm

 Phát hiện tất cả các hợp chất có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động

 Sự bay hơi của pha động

 Độ nhạy cao (ng/ml)

 Khảo sát đường và những chất có áp suất hơi yếu

 [rất sạch tạp, sắc ký rõ đẹp]

-iii- Nhược điểm

 Sử dụng với pha động dễ bay hơi

 Mẫu phân tích có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động



d Đầu dò khúc xạ kế vi sai RI (Refractive Index detector)

-i- Nguyên tắc chung

 Dựa trên sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ của pha động và pha động có lẫn chất tan sau

quá trình tách qua sắc ký cột

 Là loại thứ 2 được dùng phổ biến làm detector trong HPLC phân tích, rây phân tử

-ii- Ưu điểm

 Là detector vạn năng do có khả năng phát hiện hầu hết các chất tan (đường, glycoside

no, …)

 Rất bền và rất nhạy

-iii- Nhược điểm

 Độ nhay kém hơn UV-Vis

 Phụ thuộc nhiều vào sự thay đổi thành phần của pha động nên thường không sử dụng khi

cần gradient hóa dung môi

 Các máy HPLC phải được trang bị bộ phận điều nhiệt giữ cho độ biến thiên nhiệt độ của hệ thống khoảng ±0.5o

C

e Đầu dò huỳnh quang FD (Fluorecence detector)

-ii-Ưu điểm

 Phát hiện huỳnh quang cho:

 Khả năng tăng độ nhạy hang nghìn lần so với phát

hiện bằng đo độ hấp thu

 Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bước sóng khác

biệt làm giảm đi các peak gây nhiễu

f Đầu dò điện hóa ED (Electrochemical detector)



 Đo các cation, anion

 Có trong ion chromatography

 Khảo sát ion và hợp chất có thể ion hóa

 Giới hạn phát hiện: 0.2% của sự sai lệch độ dẫn

h Đầu dò khối phổ MSD (Mass spectroscopy detector)

 [mạnh nhất: sắc ký lỏng ghép khối phổ thời gian bay]

 Giới hạn phát hiện: cực nhỏ,

 Đắt tiền, lĩnh vực áp dụng rộng rãi











i Đầu dò đo cường độ xung PAD (Pulsed Amperometry Detector)

 Phụ thuộc nhiều vào sự thay đổi thành phần của pha động nên thường

không sử dụng

khi cần gradient hóa dung môi

 Các máy HPLC phải được trang bị bộ phận điều nhiệt giữ cho độ biến thiên nhiệt độ của hệ thống khoảng

 Độ nhạy cao

(3ng/ml), giá thành không

quá cao, dễ vận hành

 Ít phụ thuộc vào các thay đổi điều kiện (nhiệt

độ, tốc độ dòng )

 Đòi hỏi dung môi phù hợp và tinh khiết

 Chọn lọc các chất tan hấp thu trong vùng Uv-vis

 Độ nhạy

thấp hơn

UV-Vis

 Phát hiện đồng thời chất được phân tích ở nhiều bước sóng khác,

cung cấp thông tin về phổ uv-vis của một peak

 Xác định bước sóng hấp thụ tối đa của một chất

 Phát hiện tạp chất, chất gây nhiễu ở bước sóng thấp hơn không đặc trưng

 Cung cấp thông tin

vầ độ tinh khiết của peak

 % tinh khiết peak

 Cung cấp phổ 3D

[độ hấp thu, thời gian lưu, bước sóng] giúp cho việc chọn bước sóng phân tích tối ưu cho định lượng, định danh chất phân tích

 Không tách được các đồng phân quang học

FD Chọn lọc  8 pg/ml

Tính đặc hiệu cao

 Phát hiện huỳnh quang cho:

 Khả năng tăng độ nhạy hang nghìn lần

so với phát hiện bằng đo độ hấp thu

 Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bước sóng khác biệt làm giảm đi các peak gây nhiễu

Chọn lọc  1 pg/ml Nhạy cao, dùng rộng rãi

 Phát hiện tất cả các hợp chất có sự bay hơi

thấp hơn sự bay hơi của

 Mẫu phân tích có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động

III- CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG TRONG HPLC

 Thời gian lưu (tR)

A TỐC ĐỘ DI CHUYỂN CỦA CÁC CHẤT

1- Tốc độ di chuyển của một chất

 Được đặc trưng bởi:

hệ số phân bố của nó giữa hai pha các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh: thời gian lưu, thể tích lưu

a Thời gian lưu (Retention time)

 t R = t’ R + t M

 tR: Thời gian lưu là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến

detector; thời gian lưu càng lớn thì chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di hcuye6n3 của nó càng nhỏ

 tM (t0): thời gian chết là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi (pic nhỏ bên trái)

 tR’: là thời gian lưu tương đối



b Thể tích lưu

V R ’=V R -V M =V M -V 0

 VR: thể tích lưu

 VR’: thể tích lưu tương đối

 VMthể tích chết của cột = V0: thể tích rỗng là thể tích dung môi từ nơi tiêm trong cột đến đầu dò

c Hệ số dung lượng k’(capacity factor)

' '

k

t t

t V

V k xV

C

xV C Q

Q

M

R M

S M

M

s s M

 k’>8: thời gian phân tích quá dài

 k’<1: pic xuất hiện quá sớm dễ lẫn pic tạp và pic dung môi

 Hệ số dung lượng = hệ số phân bố khối lượng giữa 2 pha k’: mô tả tốc độ di chuyển của