Dựa vào diện tích peak

IV- ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP HPLC

b. Dựa vào diện tích peak

-i- Đặc điểm

 Diện tích peak của một chất là tƣơng ứng với tổng lượng chất đó.

 Để tính diện tích peak ngƣời ta thƣờng dùng phương pháp tích phân (tích phân kế).

 Phƣơng pháp chỉ cần đo điểm đầu và điểm cuối của peak đƣợc nhận ra chính xác, cho kết quả tốt với nồng độ cao và trung bình.

 Việc tính toán diện tích peak sẽ gặp khó khăn khi peak có:

 cường độ cao quá hoặc bị giãn,

 không đối xứng

 detector bị nhiễu.

-ii-Các phương pháp liên quan đến diện tích peak

một) Phương pháp chuẩn ngoại – chuẩn hóa với chất chuẩn ngoại

 So sánh trực tiếp diện tích peak trong mẫu thử chưa biết với một dung dịch chuẩn đối chiếu của chất.

 Phƣơng pháp này có thể tiến hành ở các nồng độ khác nhau (chuẩn hóa một điểm hay nhiều điểm bằng xây dựng đƣờng chuẩn).

 Trong phƣơng pháp chuẩn 1 điểm, nồng độ đƣợc tính nhƣ sau:

𝐂𝐓 = 𝐒𝐓 𝐒𝐂 ∗ 𝐂𝐂 = 𝐒𝐓 𝐒𝐂 ∗ 𝐃𝐓 𝐃𝐂 ∗ 𝐏 𝐦 ∗ 𝐚 ∗ 𝐂%  P: khối lượng trung bình của viên thuốc.

 M: khối lượng trung bình của hoạt chất trong viên.

 a: khối lượng chất chuẩn cân.

 C%: độ tinh khiết chất chuẩn.

% T T C c h D P x x x a xC h D m

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 28

hai) Phương pháp chuẩn nội - internal standard calibration

 Nhằm giảm sai số và đạt độ lặp lại cao, ngƣời ta sử dụng phương pháp chuẩn hóa với chuẩn nội thêm vào chuẩn ngoại và mẫu thử.

 Chất chuẩn nội phải:

 có cấu trúc hóa học tương đương với chất khảo sát nhưng không được biến thành chất cần phân tích trong quá trình sắc ký.

 Bền vững, không phản ứng với các thành phần trong mẫu, chất nhồi cột hay pha động.

 Phải tách hoàn toàn khỏi chất cần phân tích (Rs>1.5) cho một đỉnh riêng biệt.

 Có thời gian lưu gần với tR chất cần phân tích trong cùng điều kiện.

 Nên sẵn có dưới dạng tinh khiết trên thị trường

 Độ nhạy của chất chuẩn nội và chất cần phân tích thƣờng khác nhau, vì thế yếu tố hiệu chỉnh Fx phải đƣợc xác định đầu tiên với dung dịch chuẩn tinh khiết.

 [đồng đẳng, đồng phân của chất phân tích; kém lặp lại, kém chính xác trong sắc ký khí].

 i s S i s xC S xC S F   i s i x x C F S S C  . .

 Cxlà nồng độ của dung dịch chuẩn

 Cislà nồng độ của dung dịch chất chuẩn nội

 Sslà độ lớn của peak chuẩn (chất chuẩn ngoại)

 Sislà độ lớn của peak chuẩn nội

 Ưu điểm:

 Loại trừ các lỗi trong khi tiêm.

 Độ lặp lại cao hơn.

 Có thể đánh giá sự phục hồi của quá trình xử lý trước.

 Nhược điểm:

 Khó phân tách hơn.

 Khó tìm được chất chuẩn nội thỏa mãn các điều kiện trên.

ba) Chuẩn hóa bằng phương pháp thêm chuẩn (standard additive method)

 Đƣợc sử dụng khi có vấn đề ảnh hƣởng cảu chất hấp phụ.

 Dung dịch mẫu thử đƣợc thêm một lƣợng xác định của chất chuẩn, các peak thu đƣợc của cả 2 dung dịch mẫu thử; mẫu thử đƣợc thêm chất chuẩn vào phải đƣợc khảo sát trong cùng điều kiện sắc ký.

 Có thể thực hiện phƣơng pháp này 1 lần, 2 lần hay nhiều lần; trong trƣờng hợp thêm nhiều lần thì nồng độ mẫu chuẩn đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp phân tích hồi qui.

 𝐂𝐗 = ∆𝐂∆𝐒 ∗ 𝐒𝐗

 CX: nồng độ chưa biết của mẫu.  C: sự chênh lệch nồng độ.  S: độ tăng của độ lớn peak.

 Ưu điểm:

 Độ chính xác cao, có thể loại trừ các yếu tố ảnh hưởng khác.

 Sự thay đổi lớn về nhiệt độ và áp suất không ảnh hưởng đến kết quả đo đạc.

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 29

bốn) Phương pháp qui về 100% diện tích peak

 Đơn giản, nhƣng ứng dụng hạn chế trong HPLC; thường dùng trong sắc ký khí.

 Đòi hỏi mọi cấu tử trong hỗn hợp phải đƣợc rửa giải và phát hiện.

 Khi có sự đáp ứng như nhau của detector trên các cấu tử X, Y, Z với cùng cường độ tín hiệu thì:

%𝐗 = 𝐀𝐱 ∗ 𝟏𝟎𝟎 𝐀𝐱 + 𝐀𝐲 + 𝐀𝐳  %X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z.

 Ax, Ay, Az: diện tích peak của cấu tử X, Y, Z.

2- Ứng dụng trong định lượng

a. Chế phẩm đơn thành phần

 Chỉ định lượng riêng hoạt chất mong muốn, cho kết quả chính xác.

 Xác định tạp chất liên quan

 Ví dụ: Chuyên luận Viên nén Aspirin

 DĐVN 4 : định lượng acid-base kỹ thuật thừa trừ.

+ Định lượng với lượng dư NaOH 0.5N.

+ Định lượng lượng NaOH dư bằng HCl 0.5N; chỉ thị đỏ phenol.

+ NaOH sẽ định lượng: sản phẩm phân hủy của acid salicylic, acid acetic (nếu có).

+ Sai số do bản thân phương pháp thể tích+mức độ phân hủy.

 USP : định lượng HPLC.

+ Loại trừ sai số trên do tách biệt peak aspirin và peak tạp (hay sản phẩm phân hủy).

+ Kết quả phản ánh đùng lượng aspirin trong mẫu

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 30

b. Chế phẩm đa thành phần

-i- HPLC luôn là lựa chọn hàng đầu

 Có thể định lượng đồng thời nhiều hoạt chất.

 Không cần tinh khiết hóa mẫu

 Thời gian nhanh

 Độ chính xác cao

 Ít sử dụng dung môi, hóa chất độc hại.

-ii-Ví dụ về định lượng viên nang Multivitamin:

một) Tiêu chuẩn 1 : Định lượng Viên nang Multivitamin bằng các phương pháp hóa lý

 Các phương pháp thực hiện:

 Vitamin B1 (Thiamin nitrat hoặc Thiamin hydroclorid) :phương pháp cân khối lượng

 Vitamin B2 (Riboflavin) : pp đo quang phổ 444nm.

 Vitamin B6 (Pyridoxin hydroclorid) : phương pháp đo màu (tạo màu với clorimid 0.04% và đo quang bước sóng 650nm).

 Vitamin PP (Nicotinamid) : phương pháp đo màu (tạo màu với cyanogens bromide và đo ở 450nm).

 Vitamin C (Acid ascorbic) :phương pháp chuẩn độ iod.

 Nhận xét

 Mất nhiều thời gian, nhân lực

 Qui trình chuẩn bị mẫu nhiều công đoạn : sai số tăng

 Sử dụng nhiều hóa chất, thuốc thử : độc hại

 Không cần thiết bị hiện đại, đắt tiền

hai) Tiêu chuẩn 2 : Định lượng Viên nang Multivitamin bằng HPLC

 Điều kiện sắc ký tối ưu

 Cột Phenomenex RP-C18 (15cm;4.6mm;5μm)

 Pha động: Dung dịch đệm-MeOH (80:20)

 Tốc độ dòng : 1ml/phút

 Detector : 280nm

 Thể tích tiêm mẫu : 20l

 Pha dung dịch mẫu

 Dung dịch chuẩn : gồm 5 loại vitamin trong dung dịch đệm

 Dung dịch thử : bột thuốc pha trong dung dịch đệm

 Tiến hành

 Sau khi triển khai hệ thống ổn định, lần lượt tiêm dung dịch chuẩn và thử vào máy.

 Tính kết quả:𝐂𝐓 = 𝐒𝐓 𝐒𝐂 ∗ 𝐂𝐂 = 𝐒𝐓 𝐒𝐂 ∗ 𝐃𝐓 𝐃𝐂 ∗ 𝐦𝐏 ∗ 𝐚 ∗ 𝐂%  Nhận xét  Một lần định lượng 5 hoạt chất

 Cách chuẩn bị mẫu đơn giản

 Ít sử dụng hóa chất độc hại

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 31 

Pk # Name Retention Time Area Percent Area plates (USP) Theoretical Resolution (USP) Asymmetry

1 Acid Ascorbic 1.813 7270693 26.316 2828 0.00000 1.22450 2 Nicotinamid 3.163 2625117 9.502 4955 8.54023 1.22861 3 Pyridoxin HCl 6.073 5255353 19.022 6219 11.93081 1.15197 4 Riboflavin 12.857 8719194 31.559 5080 13.17691 1.03653 5 Thiamin nitrat 17.340 3757565 13.601 5215 5.33110 0.99054 

Pk # Name Retention Time Area Percent Area plates (USP) Theoretical Resolution (USP) Asymmetry

1 Acid Ascorbic 1.817 7460892 26.915 3065 0.00000 1.43662

2 Nicotinamid 3.177 2735318 9.868 4851 8.67075 1.21814

3 Pyridoxin HCl 6.117 5686095 20.513 5996 11.79764 1.14919

4 Riboflavin 13.120 8305266 29.961 4938 13.17953 1.02747

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 32

C. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT

1- Cơ chế xác định độ tinh khiết

 Nếu trong mẫu thử không có tạp chất : SKĐ chỉ có duy nhất pic hoạt chất.

 Nếu có tạp chất, trên SKĐ sẽ có pic phụ

2- Các phương pháp xác định tạp chất

a. Sử dụng tạp chuẩn

-i- Các khái niệm

 Tạp chất là chất qui định không đƣợc có hoặc có rất ít trong nguyên liệu (hoạt chất thuốc).

 Tạp chuẩn là chất này ở dạng tinh khiết, dùng để làm chuẩn đối chiếu, so sánh để xác định lƣợng chất tạp này trong mẫu thử nghiệm.

 Ví dụ:

 Acid salicylic tinh kiết có hàm lượng xác định được dùng làm tạp chuẩn để xác định lượng tạp chất liên quan acid salicylic có trong nguyên liệu aspirin.

 4-aminophenol được dùng làm tạp chuẩn để xác định lượng tạp chất liên quan 4- aminophenol có trong nguyên liệu và thành phẩm Paracetamol.

-ii-Phương pháp

 Pha dung dịch thử: là dung dịch của chế phẩm cần xác định tạp chất, theo nồng độ qui định trong tiêu chuẩn.

 Pha dung dịch chuẩn: là dung dịch của tạp chuẩn với nồng độ xác định trong tiêu chuẩn.

 Đo mẫu thử và chuẩn trên máy HPLC theo các điều kiện của tiêu chuẩn.

 Xem xét sắc ký đồ mẫu thử, nếu có pic tạp (pic có vị trí thời gian lƣu tƣơng tự pic trong sắc ký đồ mẫu tạp chuẩn), tính lượng tạp chất này bằng cách so sánh diện tích pic tạp với diện tích của pic chuẩn có nồng độ đã biết.



b. Không sử dụng tạp chuẩn

 Trong tiêu chuẩn sẽ cho biết vị trí của tạp chất trên sắc ký đồ để dựa vào đó xác định mà không cần mẫu tạp chuẩn để đối chiếu.

 Ví dụ:chuyên luận Lincomycin hydroclorid

 có chỉ tiêu xác định lượng Lincomycin B trong chế phẩm không được quá 5%.

 Xác định vị trí của tạp Lincomycin B trong sắc ký đồ mẫu thử bằng cách cho biết hời gian lưu liên quan là khoảng 0.5 cho Lincomycin B và 1.0 cho Lincomycin.

 Nếu sắc ký đồ mẫu thử cho thấy thời gian lưu của Lincomycin là 8’ thì nếu trên sắc ký đồ có pic với thời gian lưu khoảng 4’ thì đó là tạp Lincomycin B.

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 33 

 Phương pháp:

Sử dụng mẫu chuẩn đối chiếu là mẫu thử pha loãng: có thể xác định lượng tạp chất bằng cách dùng mẫu thử pha loãng ra nhiều lần, trường hợp này chỉ kết luận là tạp chất nhưng không định danh là tạp gì.

 Ví dụ: nếu cần xác định tạp chất trong mẫu không quá 1%.

 Dung dịch thử (1)

 Dung dịch thử pha loãng 100 lần (2)

 Sau đó tiến hành đo trên máy sắc ký lỏng, các pic tạp nếu có trong dung dịch (1) không được lớn hơn pic chính trong dung dịch (2)

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 34 V V-- MỤMỤCC LLỤỤCC I- ĐỊNH NGHĨA ... 1 1- Lịch sử ... 1 2- Các khái niệm ... 1

3- Ƣu điểm vƣợt trội ... 2

II- CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA HPLC ... 2

A. BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐỘNG ... 2

1- Đặc điểm, tính chất ... 2

2- Xử lý dung môi động ... 3

a. Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi ... 3

b. Đầu lọc dung môi... 3

c. Đuổi khí dung môi ... 3

d. Nƣớc rửa cột HPLC ... 3

B. BỘ PHẬN KHỬ KHÍ DUNG MÔI (DEGASSER) ... 3

C. BƠM (PUMP) ... 3 1- Đặc điểm ... 3 2- Cấu tạo ... 4 a. Đầu bơm ... 4 b. Thân bơm ... 4 3- Phân loại ... 4

a. Bơm đẳng dòng (isocratic pump) ... 4

b. Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump) ... 4

c. Bơm có áp suất không đổi ... 5

d. Bơm có lƣu lƣợng hằng định. ... 5

4- Lƣu ý khi sử dụng bơm nhị phân và bơm tứ phân ... 6

D. BỘ PHẬN TIÊM MẪU ... 6

1- Phƣơng pháp sử dụng syringe trực tiếp ... 6

a. Đặc điểm, cấu trúc ... 6

b. Ƣu điểm ... 6

c. Nhƣợc điểm ... 6

2- Phƣơng pháp sử dụng van bơm - Kiểu van loop ... 7

a. Đặc điểm ... 7

b. Ƣu điểm ... 7

3- Bơm mẫu tự động (Autosampler) ... 7

a. Đặc điểm ... 7

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 35

E. CỘT SẮC KÝ ... 8

1- Tiền cột (pre-column, guard column, scavenger column) ... 8

2- Cột sắc ký ... 8

a. Cột phân tích ... 8

b. Cột bán điều chế (semi - preparative column) ... 9

c. Cột chế hóa – cột điều chế (preparative column) ... 9

F. ĐẦU DÒ (DETECTOR) ... 9

1- Đặc điểm ... 9

2- Phân loại ... 9

a. Đầu dò quang phổ kế khả kiến và tử ngoại (detector UV-Vis) ... 9

-i- Nguyên tắc ... 9

-ii- Cấu tạo ... 10

mô ̣t) Nguồn ánh sáng đơn sắc (Source of monochromatic light) ... 10

hai) Flow cell ... 10

ba) Bộ phận đo sự thay đổi cƣờng độ ánh sáng khi đi qua Flow cell ... 10

-iii- Ƣu điểm ... 10

-iv- Nhƣợc điểm ... 10

b. Đầu dò dãy diode quang PDAD (Photo-Diode Array Detector)... 10

-i- Đặc điểm ... 10

-ii- Ƣu điểm ... 11

-iii- Nhƣợc điểm ... 12

c. Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi ELSD (Evaporative light scattering detector) ... 13

-i- Hoạt động ... 13

mô ̣t) Giai đoạn 1: phun sƣơng ... 13

hai) Giai đoạn 2: Bốc hơi pha động ... 13

ba) Giai đoạn 3: Phát hiện ... 13

-ii- Ƣu điểm ... 13

-iii- Nhƣợc điểm ... 13

d. Đầu dò khúc xạ kế vi sai RI (Refractive Index detector) ... 14

-i- Nguyên tắc chung ... 14

-ii- Ƣu điểm ... 14

-iii- Nhƣợc điểm ... 14

e. Đầu dò huỳnh quang FD (Fluorecence detector) ... 15

-i- Đặc điểm ... 15

-ii- Ƣu điểm ... 15

f. Đầu dò điện hóa ED (Electrochemical detector) ... 16

g. Đầu dò đo độ dẫn CD (conductivity detector) ... 16

h. Đầu dò khối phổ MSD (Mass spectroscopy detector) ... 16

i. Đầu dò đo cƣờng độ xung PAD (Pulsed Amperometry Detector) ... 18

Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 36

III- CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƢNG TRONG HPLC ... 20

A. TỐC ĐỘ DI CHUYỂN CỦA CÁC CHẤT ... 21

1- Tốc độ di chuyển của một chất ... 21

a. Thời gian lƣu (Retention time) ... 21

b. Thể tích lƣu ... 21

c. Hệ số dung lƣợng k’(capacity factor) ... 21

d. Hệ số phân bố K (partition coefficient) ... 22

2- Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất ... 22

B. HÌNH DẠNG- SỰ ĐỐI XỨNG CỦA PIC... 22

C. HIỆU LỰC CỘT- SỐ ĐĨA LÝ THUYẾT ... 23

D. ĐỘ PHÂN GIẢI – HỆ SỐ TÁCH CỘT (RESOLUTION) ... 24

E. DIỆN TÍCH ĐỈNH ... 25

IV- ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP HPLC ... 26

A. ĐỊNH TÍNH ... 26

B. ĐỊNH LƢỢNG ... 27

1- Các phƣơng pháp định lƣợng thƣờng áp dụng ... 27

a. Dựa vào chiều cao peak ... 27

b. Dựa vào diện tích peak ... 27

-i- Đặc điểm ... 27

-ii- Các phƣơng pháp liên quan đến diện tích peak ... 27

mô ̣t) Phƣơng pháp chuẩn ngoại – chuẩn hóa với chất chuẩn ngoại ... 27

hai) Phƣơng pháp chuẩn nội - internal standard calibration ... 28

ba) Chuẩn hóa bằng phƣơng pháp thêm chuẩn (standard additive method) ... 28

bốn) Phƣơng pháp qui về 100% diện tích peak... 29

2- Ứng dụng trong định lƣợng ... 29

a. Chế phẩm đơn thành phần ... 29

b. Chế phẩm đa thành phần ... 30

-i- HPLC luôn là lựa chọn hàng đầu ... 30

-ii- Ví dụ về định lƣợng viên nang Multivitamin: ... 30

mô ̣t) Tiêu chuẩn 1 : Định lƣợng Viên nang Multivitamin bằng các phƣơng pháp hóa lý ... 30

hai) Tiêu chuẩn 2 : Định lƣợng Viên nang Multivitamin bằng HPLC... 30

C. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT ... 32

1- Cơ chế xác định độ tinh khiết ... 32

2- Các phƣơng pháp xác định tạp chất ... 32

a. Sử dụng tạp chuẩn ... 32

-i- Các khái niệm ... 32

-ii- Phƣơng pháp ... 32

b. Không sử dụng tạp chuẩn ... 32