1- Cơ chế xác định độ tinh khiết
Nếu trong mẫu thử không có tạp chất : SKĐ chỉ có duy nhất pic hoạt chất.
Nếu có tạp chất, trên SKĐ sẽ có pic phụ
2- Các phương pháp xác định tạp chất
a. Sử dụng tạp chuẩn
-i- Các khái niệm
Tạp chất là chất qui định không đƣợc có hoặc có rất ít trong nguyên liệu (hoạt chất thuốc).
Tạp chuẩn là chất này ở dạng tinh khiết, dùng để làm chuẩn đối chiếu, so sánh để xác định lƣợng chất tạp này trong mẫu thử nghiệm.
Ví dụ:
Acid salicylic tinh kiết có hàm lượng xác định được dùng làm tạp chuẩn để xác định lượng tạp chất liên quan acid salicylic có trong nguyên liệu aspirin.
4-aminophenol được dùng làm tạp chuẩn để xác định lượng tạp chất liên quan 4- aminophenol có trong nguyên liệu và thành phẩm Paracetamol.
-ii-Phương pháp
Pha dung dịch thử: là dung dịch của chế phẩm cần xác định tạp chất, theo nồng độ qui định trong tiêu chuẩn.
Pha dung dịch chuẩn: là dung dịch của tạp chuẩn với nồng độ xác định trong tiêu chuẩn.
Đo mẫu thử và chuẩn trên máy HPLC theo các điều kiện của tiêu chuẩn.
Xem xét sắc ký đồ mẫu thử, nếu có pic tạp (pic có vị trí thời gian lƣu tƣơng tự pic trong sắc ký đồ mẫu tạp chuẩn), tính lượng tạp chất này bằng cách so sánh diện tích pic tạp với diện tích của pic chuẩn có nồng độ đã biết.
b. Không sử dụng tạp chuẩn
Trong tiêu chuẩn sẽ cho biết vị trí của tạp chất trên sắc ký đồ để dựa vào đó xác định mà không cần mẫu tạp chuẩn để đối chiếu.
Ví dụ:chuyên luận Lincomycin hydroclorid
có chỉ tiêu xác định lượng Lincomycin B trong chế phẩm không được quá 5%.
Xác định vị trí của tạp Lincomycin B trong sắc ký đồ mẫu thử bằng cách cho biết hời gian lưu liên quan là khoảng 0.5 cho Lincomycin B và 1.0 cho Lincomycin.
Nếu sắc ký đồ mẫu thử cho thấy thời gian lưu của Lincomycin là 8’ thì nếu trên sắc ký đồ có pic với thời gian lưu khoảng 4’ thì đó là tạp Lincomycin B.
Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 33
Phương pháp:
Sử dụng mẫu chuẩn đối chiếu là mẫu thử pha loãng: có thể xác định lượng tạp chất bằng cách dùng mẫu thử pha loãng ra nhiều lần, trường hợp này chỉ kết luận là tạp chất nhưng không định danh là tạp gì.
Ví dụ: nếu cần xác định tạp chất trong mẫu không quá 1%.
Dung dịch thử (1)
Dung dịch thử pha loãng 100 lần (2)
Sau đó tiến hành đo trên máy sắc ký lỏng, các pic tạp nếu có trong dung dịch (1) không được lớn hơn pic chính trong dung dịch (2)
Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 34 V V-- MỤMỤCC LLỤỤCC I- ĐỊNH NGHĨA ... 1 1- Lịch sử ... 1 2- Các khái niệm ... 1
3- Ƣu điểm vƣợt trội ... 2
II- CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA HPLC ... 2
A. BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐỘNG ... 2
1- Đặc điểm, tính chất ... 2
2- Xử lý dung môi động ... 3
a. Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi ... 3
b. Đầu lọc dung môi... 3
c. Đuổi khí dung môi ... 3
d. Nƣớc rửa cột HPLC ... 3
B. BỘ PHẬN KHỬ KHÍ DUNG MÔI (DEGASSER) ... 3
C. BƠM (PUMP) ... 3 1- Đặc điểm ... 3 2- Cấu tạo ... 4 a. Đầu bơm ... 4 b. Thân bơm ... 4 3- Phân loại ... 4
a. Bơm đẳng dòng (isocratic pump) ... 4
b. Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump) ... 4
c. Bơm có áp suất không đổi ... 5
d. Bơm có lƣu lƣợng hằng định. ... 5
4- Lƣu ý khi sử dụng bơm nhị phân và bơm tứ phân ... 6
D. BỘ PHẬN TIÊM MẪU ... 6
1- Phƣơng pháp sử dụng syringe trực tiếp ... 6
a. Đặc điểm, cấu trúc ... 6
b. Ƣu điểm ... 6
c. Nhƣợc điểm ... 6
2- Phƣơng pháp sử dụng van bơm - Kiểu van loop ... 7
a. Đặc điểm ... 7
b. Ƣu điểm ... 7
3- Bơm mẫu tự động (Autosampler) ... 7
a. Đặc điểm ... 7
Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 35
E. CỘT SẮC KÝ ... 8
1- Tiền cột (pre-column, guard column, scavenger column) ... 8
2- Cột sắc ký ... 8
a. Cột phân tích ... 8
b. Cột bán điều chế (semi - preparative column) ... 9
c. Cột chế hóa – cột điều chế (preparative column) ... 9
F. ĐẦU DÒ (DETECTOR) ... 9
1- Đặc điểm ... 9
2- Phân loại ... 9
a. Đầu dò quang phổ kế khả kiến và tử ngoại (detector UV-Vis) ... 9
-i- Nguyên tắc ... 9
-ii- Cấu tạo ... 10
mô ̣t) Nguồn ánh sáng đơn sắc (Source of monochromatic light) ... 10
hai) Flow cell ... 10
ba) Bộ phận đo sự thay đổi cƣờng độ ánh sáng khi đi qua Flow cell ... 10
-iii- Ƣu điểm ... 10
-iv- Nhƣợc điểm ... 10
b. Đầu dò dãy diode quang PDAD (Photo-Diode Array Detector)... 10
-i- Đặc điểm ... 10
-ii- Ƣu điểm ... 11
-iii- Nhƣợc điểm ... 12
c. Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi ELSD (Evaporative light scattering detector) ... 13
-i- Hoạt động ... 13
mô ̣t) Giai đoạn 1: phun sƣơng ... 13
hai) Giai đoạn 2: Bốc hơi pha động ... 13
ba) Giai đoạn 3: Phát hiện ... 13
-ii- Ƣu điểm ... 13
-iii- Nhƣợc điểm ... 13
d. Đầu dò khúc xạ kế vi sai RI (Refractive Index detector) ... 14
-i- Nguyên tắc chung ... 14
-ii- Ƣu điểm ... 14
-iii- Nhƣợc điểm ... 14
e. Đầu dò huỳnh quang FD (Fluorecence detector) ... 15
-i- Đặc điểm ... 15
-ii- Ƣu điểm ... 15
f. Đầu dò điện hóa ED (Electrochemical detector) ... 16
g. Đầu dò đo độ dẫn CD (conductivity detector) ... 16
h. Đầu dò khối phổ MSD (Mass spectroscopy detector) ... 16
i. Đầu dò đo cƣờng độ xung PAD (Pulsed Amperometry Detector) ... 18
Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 36
III- CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƢNG TRONG HPLC ... 20
A. TỐC ĐỘ DI CHUYỂN CỦA CÁC CHẤT ... 21
1- Tốc độ di chuyển của một chất ... 21
a. Thời gian lƣu (Retention time) ... 21
b. Thể tích lƣu ... 21
c. Hệ số dung lƣợng k’(capacity factor) ... 21
d. Hệ số phân bố K (partition coefficient) ... 22
2- Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất ... 22
B. HÌNH DẠNG- SỰ ĐỐI XỨNG CỦA PIC... 22
C. HIỆU LỰC CỘT- SỐ ĐĨA LÝ THUYẾT ... 23
D. ĐỘ PHÂN GIẢI – HỆ SỐ TÁCH CỘT (RESOLUTION) ... 24
E. DIỆN TÍCH ĐỈNH ... 25
IV- ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP HPLC ... 26
A. ĐỊNH TÍNH ... 26
B. ĐỊNH LƢỢNG ... 27
1- Các phƣơng pháp định lƣợng thƣờng áp dụng ... 27
a. Dựa vào chiều cao peak ... 27
b. Dựa vào diện tích peak ... 27
-i- Đặc điểm ... 27
-ii- Các phƣơng pháp liên quan đến diện tích peak ... 27
mô ̣t) Phƣơng pháp chuẩn ngoại – chuẩn hóa với chất chuẩn ngoại ... 27
hai) Phƣơng pháp chuẩn nội - internal standard calibration ... 28
ba) Chuẩn hóa bằng phƣơng pháp thêm chuẩn (standard additive method) ... 28
bốn) Phƣơng pháp qui về 100% diện tích peak... 29
2- Ứng dụng trong định lƣợng ... 29
a. Chế phẩm đơn thành phần ... 29
b. Chế phẩm đa thành phần ... 30
-i- HPLC luôn là lựa chọn hàng đầu ... 30
-ii- Ví dụ về định lƣợng viên nang Multivitamin: ... 30
mô ̣t) Tiêu chuẩn 1 : Định lƣợng Viên nang Multivitamin bằng các phƣơng pháp hóa lý ... 30
hai) Tiêu chuẩn 2 : Định lƣợng Viên nang Multivitamin bằng HPLC... 30
C. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT ... 32
1- Cơ chế xác định độ tinh khiết ... 32
2- Các phƣơng pháp xác định tạp chất ... 32
a. Sử dụng tạp chuẩn ... 32
-i- Các khái niệm ... 32
-ii- Phƣơng pháp ... 32
b. Không sử dụng tạp chuẩn ... 32