LỊCH SỬ 1938 Izmailov và Schraiber SKLM Al2O3, bản thủy tinh SKLM là một phương pháp sắc ký mà trong đó một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ silica gel,
Trang 1SẮC KÝ LỚP MỎNG – TLC
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
A LỊCH SỬ
1938 Izmailov và Schraiber SKLM (Al2O3, bản thủy tinh)
SKLM là một phương pháp sắc ký mà trong đó một dung dịch mẫu thử được chấm trên
một lớp mỏng chất hấp phụ (silica gel, nhôm oxyt) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất
dẻo) đóng vai trò là pha tĩnh
Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các
cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau do sự hấp phụ, phân bố … tạo thành một sắc ký
đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau
II- CƠ CHẾ TÁCH
Các chất cần tách trong SKLM có thể khuếch tán theo cả
chiều dọc và chiều ngang
Sự tách chủ yếu dựa vào ái lực hấp phụ khác nhau
của các chất đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh) và được
biểu thị thông qua hằng số hấp phụ
Trong loại sắc ký này, chất rắn làm pha tĩnh là nhựa trao đổi ion
Sự phân tách xảy ra do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch cần tách với các gốc ion có trong pha tĩnh
Sự trao đổi ion được đặc trưng bằng hằng số trao đổi ion
Sự tách dựa trên kích thước phân tử chất tan để lọt sâu vào trong các hốc của pha tĩnh và
bị giữ lại đó sẽ ra sau
Các chất có kích thước phân tử lớn sẽ nằm ngoài các hốc và ra trước
Trang 2Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 2
Pha tĩnh hay sử dụng trong SKLM là chất hấp phụ rất mịn
Các chất hấp phụ có trộn thêm chất kết dính như CaSO4 5-15%, tinh bột 2-5%, dextrin, … hay không dùng chất kết dính
A SKLM PHA THUẬN (NORMAL PHASE-TLC)
a Tính chất
Chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay
Kích thước hạt 10-40 m, được loại Fe bằng cách đun HCl đậm đặc, dùng nước rửa sạch ion
clorid và lắng gạn loại các hạt nhỏ lơ lửng, sấy ở 120o C trong 48h Hoạt hóa trong 2h ở 105oC
Hoạt tính do các nhóm OH trên bề mặt quyết định Hàm ẩm tăng làm giảm hoạt độ
Chất phân cực, trung tâm hấp phụ là các nhóm -OH silanol (OH, HOOH,
-Si-trihydroxyl) có tính acid -OH silanol có Pka 9,5 và pH 5 -7 MP: pH < 8.5 (dùng 5<pH<7)
Tỉ lệ silanol tự do/geminal silanol # (2:1), diện tích bề mặt 200-400m2 /g
Mật độ nhóm silanol càng cao (hạt càng mịn) khả năng hấp phụ càng lớn
Tan ít trong MeOH
Khả năng hấp phụ tùy thuộc tình trạng ngậm nước hàm ẩm tăng
Tùy theo việc chọn dung môi thích hợp có thể dùng silicagel để tách sắc ký các hợp chất
base (alkaloid) và các hợp chất ưa dầu
Tăng khả năng phân chia của silicagel khi tẩm nó với:
Trang 3Nhiệt độ Ngậm nước
200-450 0 Mạnh, không giải hấp được Phục hồi được Bắt đầu trơ
450-1100 -1 Mất hoàn toàn khả năng hấp phụ Hết phục hồi Hết sử dụng
b Sự hấp phụ mẫu phân tích lên bề mặt pha tĩnh
Mẫu thử càng có nhiều cực hấp phụ lực hấp phụ càng lớn càng phân cực
c Sự giải hấp phụ bằng dung môi
Silica gel = silica gel pha thuận= silica gel NP hay Kieselgel= si-gel= silica gel= gel de silice= silicic acid= SiO2.n H2O # Kieselgurh
Trang 4Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 4
Trang 52- Nhôm oxyd 5%
a Tính chất
Kích thước hạt thường thô hơn so với silica gel
Là chất hấp phụ phân cực mạnh (hơi kém hơn Silica gel),
S bề mặt 100m2/g, bề dày lớp mỏng 0,1-0,15mm
Có ba loại Alumina trên thị trường
Loại trung tính (7,3 ± 0,5): Al-OH + -Al-O- tách các chất trung tính
Loại base (9,0 ± 0,5 ): -Al-O- sắc ký acid amin có tính base
Nhưng cũng có thể chuyển đổi pH của oxid nhôm nếu cần
Hoạt tính giảm khi hàm lượng nước gia tăng
Hoạt hóa: 120oC /1h
Có nhiều cỡ hạt 40-63, 63-200μm
Nhiều dạng hình thù khác nhau: α (xoang 90A), є (60A) thường sử dụng trong CC
Rất ít sử dụng oxyt nhôm pha đảo (Aluminai RP-18)
Có thể hấp phụ mạnh các chất phân cực:
Có thể phản ứng với nhóm C=O trong aldehyd, ceton amid…
Để tăng khả năng chia tách, xử lý nhôm oxyd với dung dịch kiềm hay acid
Al O
OH
Al O
OH
Al O
OH
Al OH
O
O Al
Al O
OH
Al O
OH
Al O
OH
Al OH
O
Trang 6Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 6
c Xác định bậc hoạt tính của oxid nhôm dựa vào giá trị Rf của các chất màu chuẩn
So sánh silica và oxyd nhôm:
Silicagel Nhôm oxyd
Hấp phụ mạnh Các chất kiềm Các chất acid
để tinh chế các chất ít bị than hoạt hấp phụ
Là hợp chất cao phân tử của (-CONH-) tạo mạng cấu trúc 3 chiều
Một chất hấp phụ yếu hơn nhiều so silica gel và nhôm oxyd, dùng tách các chức phenol
Sự hấp phụ do sự tạo thành những liên kết
hydro thuận nghịch giữa các nhóm chức của mẫu
với oxy của –CO trong polyamid
Ngoài cơ chế hấp phụ còn có cơ chế phân bố
nhờ các xoang rỗng của polyamid đây cũng đƣợc
xem là cơ chế tách của polyamid (alkaloid, acid
amin…)
Trang 7 Kieselguhr là một chất hấp phụ yếu, dùng tách các chất phân cực như cetoacid, lacton,
… thường được dùng làm chất mang cho pha tĩnh trong sắc ký phân bố
Đôi khi người ta còn sử dụng hỗn hợp kieselguhr – thạch cao
kieselguhr – silicagel với tỷ lệ 1:1
Được điều chế bằng cách trộn dung dịch CaCl2 và H2SO4 với tỷ lệ đồng phân tử, đun 70–
80oC, gạn lấy CaSO4, rửa tới trung tính, sấy 115 -120 oC/48 giờ
Chất hấp phụ yếu
Hiện nay ít sử dụng
B SKLM PHA ĐẢO (RP: REVERSE PHASE-TLC )
Chất mang là các hạt silica đồng nhất, xốp, bền cơ học có d= 3,5,10 μm được thủy phân hoàn toàn bằng HCl 0.1M ở nhiệt độ cao /1 ngày để tạo thành các nhóm Silanol va gem- silanol
Các nhóm Silanol va gem- silanol được cho phản ứng với clorosilane để tạp thành các -Si-O-Si-R, Si-R
Pha thuận (NP) Pha đảo (RP) Mẫu nghiên cứu Phân cực kém đến vừa Phân cực mạnh
Trang 8Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 8
Trang 92- Cellulose
Là chất cao phân tử thiên nhiên [(C6H7O2(OH)3]n,
Dạng sợi mịn, không cần chất kết dính thường dùng cho PC (giấy Whatman, FN…)
Cellulose vi tinh thể: xử lý cellulose bằng tẩm methanol, acid formic và nước hoặc bằng
isopropanol, acid acetic và nước tạo hỗn dịch để chạy SKC pha đảo
Cellulose có cơ chế phân bố là chính thường dùng tách các hợp chất phân cực mà không
thể tách bằng sắc ký hấp phụ (polysaccaride, acid amin, acid nucleic ) các vết thu được khá
tròn, ít biến dạng và thời gian phân tách ngắn
Nhựợc điểm chính của cellulose là không thể phát hiện vết sắc ký bằng các thuốc thử
mạnh như NaOH, H2 SO4, …
Trong sắc ký phân bố hay dùng silicagel, kieselguhr, cellulose, thạch cao để làm chất
mang dung môi pha tĩnh
[khó chọn dung môi vì làm hỏng giấy]
Là loại silicagle được sunfon hóa (hay gắn các gốc có khả năng trao đổi ion), đó là cationit
có nhóm – SO3H nên có thể sử dụng trong môi trường acid mạnh
Pha tĩnh có chất kết dính: silicagel G, kieselguhr G, oxyd nhôm G, đã trộn sẵn 5% thạch cao
Pha tĩnh không có chất kết dính: silicagel H, oxyd nhôm H
Pha tĩnh có chất chỉ thị huỳnh quang: silicagel GH254 và HF254, …
Bản sắc ký tráng sẵn với giá đỡ là tấm thủy tinh, giấy nhôm hay polymer có nhiều ưu điểm hơn bản mỏng tráng thủ công:
Thao tác đơn giản và dễ dàng hơn do có độ ổn định cơ học cao hơn
Thích hợp định lượng do có tính đồng nhất cao
Độ phân tách tốt hơn
Trang 10Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 10
Pha tĩnh
Tính chất
Các chất được dùng để phân tích
phân chia
Hydrocarbon,
alcaloid,
chất màu thực phẩm,
lipid
Đường,
các triglycerid,
các acid bậc cao
Carotinoic,
tocopherol,
các acid béo,
glycerid kỵ nước
Silicagel + oxyd nhôm
Các chất màu, các acid barbituric
phân bố ?) Các antoxyan
Acid nucleic,
nucleotid,
ion kim halogenic
Là yếu tố quan trọng trong quá trình sắc ký
Trong sắc ký rất ít khi pha động là 1 dung môi
Thường pha động là 1 hỗn hợp 2 hay nhiều hơn 2 thành phần được gọi là hệ dung môi
Để cải thiện khả năng tách của hỗn hợp, 1 lượng nhỏ kiềm, acid … có thể được thêm vào hệ dung môi
Độ tinh khiết của dung môi: có 1 kết quả tốt, lặp lại
Để đánh giá khả năng rửa giải của 1 dung môi người ta thường dùng khái niệm “độ phân cực” của
dung môi, được dự đoán bằng moment lưỡng cực, hằng số điện môi, thực nghiệm v.v…
Trang 11B ĐỘ PHÂN CỰC VÀ SỨC RỬA GIẢI CỦA DUNG MÔI
Polar: Water > Acetic acid> Ethyleneglycol >Methanol >Ethanol >Isopropanol >Pyridine
>Acetonitrile >Nitromethan >Diethylamine >Aniline >Dimethylsulfoxide >Ethylacetate
>Dioxane >Acetone >Dichloroethane >Tetrahydrofuran >Dichloromathane >Chloroform
>Diethylether >Benzene >Toluene >Xylene >Carbontetrachloride >Cyclohexane >Petroleum
ether >Hexane >Pentane: Non-polar
Dung môi CTCT Boiling point Nhiệt độ sôi Tỉ trọng Density (dãy Snyder) P’ (dãy Halpaap) F
Dãy snyder P’ : được sắp xếp theo thứ tự chỉ số phân cực tăng dần
Dãy Halpaap (F): được sắp xếp theo thứ tự khả năng rửa giải tương đối (F) tăng dần → Ước
lượng độ phân cực của một dung môi
Ví dụ: S = Bz- EtOAc (80:20) P’S= 0.8x2.7+ 0.2x4.4= 3,04 (sấp xỉ DCM)
Trang 12Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 12
Để so sánh và phân biệt 2 dung môi trong 1 hệ dung môi, người ta phân biệt:
Dung môi mạnh: là dung môi có ái lực mạnh với chất phân tách, làm cho chất phân tách
di chuyển nhanh hơn
Dung môi yếu: là dung môi có ái lực với chất phân tách không mạnh ba ̀ng dung môi
mạnh
Dung môi mạnh hay yếu là xét trên 1 hệ cụ thể
SKLM pha thuận: dung môi phân cực mạnh là dung môi mạnh
SKLM pha đảo: dung môi ít phân cực hơn là dung môi mạnh
Khi viết 1 hệ dung môi, thông thường người ta viết
Dung môi yếu trước – Dung môi mạnh sau
Tỉ lệ của các dung môi (dung môi yếu:dung môi mạnh)
Ví dụ:
Sắc ký pha thuận
+ n-hexan – ethyl acetat (8:2)
+ chloroform – aceton (75:25; lớp dưới)
Sắc ký pha đảo + nước – methanol (80:20)
+ nước – acetonitril (45:55)
C YÊU CẦU CHO MỘT DUNG MÔI SẮC KÝ TỐT
Hòa tan tốt mẫu thử
Không phản ứng với mẫu thử
Linh động, độ nhớt thấp
Nhiệt độ sôi không quá thấp, không
quá cao
Không có mùi khó chịu
An toàn, không độc hại,
Rẻ tiền, dễ kiếm
Thân thiện với môi trường
D LỰA CHỌN DUNG MÔI CHO SKLM
*Qui tắc tam giác Stahl (1960’)
Mẫu thử Chất hấp phụ (SP) Hệ dung môi khai triển (MP)
Phân cực kém Phân cực mạnh
(silica gel, oxyd nhôm )
Phân cực cực kém (PE, n-hexan, Tol, BZ, Cf, EtOAc…)
Phân cực mạnh (silica gel RP…) Phân cực kém Phân cực mạnh
(ACN, Me, H2O)
Tham khảo hệ dung môi của các chất cần phân tích trên các textbook, các tạp chí uy tín
Tham khảo dãy (Snyder, dãy Halpaap) để chọn ra loại dung môi tinh khiết có “độ mạnh” phù hợp
Tổ hợp dung môi hai thành phần ví dụ (A-B); (A-C); (A-D); (B-C), theo hướng tăng dần độ phân cực
sau đó chấm lên một loạt bản, mỗi bản khai triển với một trong các hệ dung môi này, sơ bộ ghi nhận các hệ dung môi nào tách tốt (soi UV hay phun thuôc thử thích hợp)
bằng cách soi đèn UV và phun thuốc thử phù hợp
Trang 13
Có thể thêm thành phần thứ 3 vào hệ 2 dung môi này để cho các vết tách rõ hơn, sắc gọn
hơn như là acid (acid formic, acid acetic ) nếu SKLM chất có tính acid như Flavonoid, hoặc
kiềm (NH3, Dietylamin ) khi SKLm chất có tính kiềm như Alkaloid với tỉ lệ <1% (chất điều
chỉnh: modifier)
Bên cạnh tác dụng điều chỉnh pH cũng có thể làm tăng đáng kể độ phân cực của hệ dung
môi vừa chọn
Tuy nhiên lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm
Việc lựa chọn dung môi không theo 1 qui tắc cụ thể mà phải sắc ký sơ bộ để thăm dò dung
môi thích hợp Hệ dung môi càng đơn giản càng tốt và phải dùng dung môi tinh khiết
E MỘT SỐ YẾU TỐ GIÚP LỰA CHỌN PHA TĨNH VÀ PHA ĐỘNG CHO TLC
Tính chất của hỗn hợp chất cần phân tách
độ hòa tan,
đặc tính các nhóm chức hóa học
Cơ chế sắc ký của pha tĩnh
Độ bay hơi, độ nhớt, sự phân lớp và độ tinh khiết của hỗn hợp DM
Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để 0,2< Rf <0,8 đạt độ phân giải cực trị
Chất phân tích dạng ion được rửa giải tốt với dung môi phân cực rất mạnh như hỗn hợp
n-butanol:nước
Thêm một ít acid acetic hoặc ammoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của acid hoặc base
tương ứng
Khi dùng silicagel hoặc các chất chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ
quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng Nếu thêm một ít dung
môi ít phân cực như ether ethylic vào dung môi không phân cực như methyl benzene làm tăng
đáng kể trị số Rf
Một số nhóm chức có khả năng hấp phụ [khả năng đẩy chất ra khỏi oxyd nhôm hay silicagel] theo thứ tự tăng dần:
CH=CH<-OCH3<COOR<C=O<CHO<SH<OH
Trang 14Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 14
Trang 15 Sử dụng dung môi phân cực (ACN, MeOH, H2O), có thể kèm dung dịch đệm
Dùng bản mỏng tráng sẵn Silicagel F254, Silicagel RP-2, RP-8, RP-18
Khác về kích thước hạt, độ đồng đều của các hạt và bề dày của pha rắn
Trang 16Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 16
Kéo mao quản từ ống TT có d=1-2mm
Theo dõi CC: vết sát nhau hơn
P-TLC: chấm băng liên tục dày 1-2mm, mao quản 1-10µl
Với lớp mỏng dính chắc: đánh dầu đường xuất phát cách mép dưới 1-2cm
Với bản mỏng phân tích: chấm dạng vết
Dùng mao quản hay micropipette chấm dung dịch lên bản mỏng cách 2 mép bên của bản
1-2cm, các vết cách nhau >= 1cm
Chấm không làm thủng lớp mỏng, vết chấm gọn, nhỏ chứa lượng chất thử khoảng 1-10 g
Lượng chất chấm có ảnh hưởng đến sự di chuyển của vết, làm thay đổi vị trí của nó trên sắc
ký đồ
Trang 17 Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trên của bản khoảng 1-2cm thì lấy ra, đánh dấu mức
dung môi trên kính, để khô hay sấy khô
Đặt bản mỏng vào bình dung môi:
tránh dựa lưng vào giấy lọc
tránh hai biên tiếp xúc DM
nghiêng góc 45o
Không di chuyển bình sắc ký hay có rung động
Khai triển một hay nhiều lần (F254)
Khai triển theo hai chiều thẳng góc nhau
Trang 18Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 18
b Phun thuốc thử hiện màu hoặc nhúng bản mỏng
Có thể dùng nhiệt độ làm tăng phản ứng tạo màu và cường độ vết màu
THUỐC THỬ
CHUNG
Acid phosphomolypdic Xanh tối Nhiều chất hữu cơ
Acid sulfuric đặc Nâu – đen Tất cả các chất hữu cơ
Hơi iod Nâu Nhiều chất hữu cơ
THUỐC THỬ
CHỌN LỌC
Ninhydrin Hồng – tím Acid amin, các nhóm chức amin
2,4-dinitrophenylhydrazon Da cam, đỏ Các hợp chất carbonyl
Xanh hoặc lục bromocresol Vàng Các acid hữu cơ
2,7 fluorescein Vàng – lục Nhiều chất hữu cơ
Vanilin/acid sulfuric Xanh – lục – hồng Alcol, ceton
Rhodamin B Huỳnh quang đỏ Các chất lipid
Anisaldehyd/SbCl3 Nhiều màu Các chất steroid
Diphenylamin/Zn2+ Nhiều màu Cac chất bảo vệ thực vật
c Densitormeter
Đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dưới đèn UV-Vis
Chất hấp phụ bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký
Ghi điều kiện của TLC
Loại bản mỏng , kích thước
Mẫu thử, dung môi hòa tan mẫu
DM khai triển và số lần khai triển
Điều kiện hiện màu
Tính Rf hoặc Rx
2 số lẻ
Theo thứ tự Rf nhỏ dần
SKĐ đính kèm
Trang 19
B CÁC HIỆN TƯỢNG NGOẠI Ý THƯỜNG GẶP TRONG TLC
Vết di chuyển không hoàn toàn Mẫu còn nhiều tạp phân cực Loại tạp kỹ hơn trước khi
tiến hành TLC
Vết trải dài không tách Chọn dung môi sắc ký chưa tốt
DM chiết không chuyên biệt
Thăm dó lại hệ
Chọn DM chiết mẫu chuyên biệt hơn
Vết di chuyển xéo
Bản mỏng bỉ mẻ ở hai bờ, thành bản mỏng tiếp xúc dung môi
Hở bình sắc ký
Thay bản mỏng khác
Thay bình sắc ký khác Vết hình móng ngựa Vết chấm hình tròn quá lớn Chấm nhỏ hơn với nồng độ
cao hơn hoặc chấm vạch Các vết lân cận trùng vào nhau Chấm các vết quá gần Chấm khoảng cách vết
theo đúng qui định Vết hình ngọn lửa nhiều đầu Chấm vết không trùng nhau Chấm kỹ lại trên bản mỏng
khác Vết loang Vết khuyếch tán do bay hơi vì để
lâu hoặc nhúng thuốc thủ quá lâu
Vẽ, chụp hình ngay sau khi hiện màu xong